Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Bioquímica Médica
Curso: Enfermagem e Obstetrícia
T ÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
T ÉCNICAS USADAS EM
DIAGNÓSTICO
ELISA
Western Blot
PCR
Sequenciamento
Já utilizadas
Menos difundida
A NTÍGENO
X
A NTICORPO
T ÉCNICAS
COM ANTICORPO
W ESTERN B LOT
Western Blotting é um poderoso método
para a detecção de uma determinada
proteína em uma mistura complexa. Ele
combina o poder de resolução da
eletroforese em gel, a especificidade dos
anticorpos, e a sensibilidade dos ensaios de
enzima.
Chamado
Western
blotting,
ou
immunoblotting, este procedimento é
comumente usados ​para separar proteínas e,
em seguida, identificar uma proteína de
interesse.
W ESTERN B LOT
W ESTERN B LOT
ELISA ( ENZYME - LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY )
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) permite uma rápida triagem e
quantificação da presença de um antígeno em uma amostra.
-Proteínas em uma amostra são adsorvidas a
uma superfície inerte
- A superfície é lavada com uma solução
de uma proteína inespecífica
-A superfície é tratada com uma solução
contendo o anticorpo contra a proteína de
interesse
-A superfície é tratada com uma solução
contendo anticorpos contra o anticorpo
-O substrato da enzima ligada ao anticorpo é
adicionado
- Formação do produto (monitorado como
intensidade de cor) é proporcional a
concentração da proteína de interesse na
amostra.
ELISA
ELISA
ELISA antígeno
ELISA anticorpo
ELISA antígeno sanduíche
W ESTERN B LOT E ELISA:
DIAGNÓSTICO DO HIV
ELISA primeira técnica utilizada no diagnóstico da infecção pelo HIV
Testes de terceira geração só detectavam a presença de anticorpos
(IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato
Testes de quarta geração já detectam tanto anticorpos quanto um dos
antígenos do HIV (a proteína p24), diminuiu sensivelmente o período
de janela imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.
Um resultado positivo num teste de HIV por ELISA é sempre confirmado por
outros testes específicos:
Western blot - detecta o anticorpo anti-HIV na amostra de soro
humano
PCR - detecta os ácidos nucleícos virais
W ESTERN BLOT E E LISA :
OUTRAS APLICAÇÕES
Western blot é um teste definitivo para a doença da vaca louca.
ELISA
Entre as doenças passíveis de diagnóstico pelo teste, estão várias doenças infecciosas (a
maioria dos agentes patológicos desencadeia a produção de imunoglobulinas). Também
pode ser usado no diagnóstico de doenças auto-imunes ou alergias e para se detectar
outras substâncias de interesse como, por exemplo, hormônios. Pelo fato do
radioimunoensaio ser muito caro, o teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais
simples e barata.
PCR ( REAÇÃO DA P OLIMERASE EM
C ADEIA
-
Método de isolamento e amplificação de um segmento de DNA - envolve a produção "in vitro" de
milhões de cópias do segmento em estudo
-
Foi desenvolvido por Kary Mullis (Cetus Corporation, Emeryville). Ele recebeu $20,000 de bonus e
depois o Prêmio Nobel. Mais tarde, a patente foi vendida para Hoffman-LaRoche por $300,000,000
- Reação de PCR:
1. Pequenos "primers" de DNA que se ligam às extremidades 3' ends do DNA
2. Os 4 nucleotídeos: A, C, G, T
3. DNA polimerase especial (Taq polimerase): funciona em altas temperaturas; isolada de
micoorganismos que vivem em fontes termais (Termus aquaticus )
- Ocorre em 3 etapas:
1. A desnaturação da dupla fita do DNA, em alta temperatura
(90oC )
2. O pareamento dos "primers", a baixa temperatura - 37o C
3. A duplicação do segmento isolado através da reação da
DNA polimerase
O processo é cíclico e pode ser repetido "n" vezes,
dependendo do grau de amplificação que se deseja
Kary B. Mullis
Prêmio Nobel de Química 1993
PCR
Taq é uma enzima, que foi isolada pela primeira vez em 1971 de uma bactéria termófila
(Thermus aquaticus) que vive nos geisers do Parque Nacional de Yellowstone!!!
Perfeita para resistir as variações de temperatura nas reações de PCR!!!
Máquina de PCR
PCR
PCR
PCR
F ILME PCR
PCR:
-HIV, detecta os ácidos nucleícos virais.
- Doença infecto parasitária
- Anemia falciforme
APLICAÇÕES
S EQUENCIAMENTO
Qualquer tipo de ácido nucléico pode ser
seqüenciado, amostras de RNA, DNA genômico, plasmídeos,
cromossomas artificiais e produtos de PCR.
O primeiro método de sequenciamento de DNA
foi desenvolvido em meados dos anos 70 e ficou conhecido
como Seqüenciamento Químico ou Maxam-Gilbert
Sequencing.
O segundo método de sequenciamento de DNA
ficou conhecido como Sequenciamento Enzimático, Dideoxi
ou Sanger-Coulson Sequencing.
S EQUENCIAMENTO
Método Enzimático, Dideoxi ou Sanger
Nesse método o princípio básico é a síntese de uma nova fita pela DNA
polimerase. O primer é marcado na sua extremidade 5` com 32P. A Dna pol, os
dNTPs e os ddNTPs são adicionados em quatro tubos juntamente com o DNA e o
primer. A síntese da nova fita acontece até ser adicionado um dideoxinucleotídeo,
que impede a continuidade da síntese. Os fragmentos resultantes são analisados
pela migração eletroforética.
S EQUENCIAMENTO
Método Enzimático, Dideoxi ou Sanger
Exemplo de fragmentos resultantes:
S EQUENCIAMENTO
AUTOMÁTICO
Ao longo dos anos o método Sanger se tornou o método mais
reprodutível e utilizado. O avanço da tecnologia solucionou parte
das limitações apresentadas por esse método. O que permitiu que
fosse utilizado nos dias atuais.
O
sequenciamento
automático
utiliza
os
mesmos
dideoxinucleotídeos utilizados em Sanger, marcados com
fluorescência. Sendo que o seu maior avanço encontra-se no fato de
utilizar laser e programas de computador específicos para detectar o
sinal dos ddNTPs.
Quando os ddNTPs são excitados com laser, emitem fluorescência
num comprimento de onda específico para cada ddNTP. Este
comprimento de onda é detectado pelo Sequenciador, que gera a
seqüência do DNA. Com isso, não a necessidade de reações em
tubos diferentes para cada fragmento a ser seqüenciado.
Foto do Sequenciador
S EQUENCIAMENTO
AUTOMÁTICO
Exemplo de Eletroferograma
S EQUENCIAMENTO DE 2 º
G ERAÇÃO
Pirosequenciamento
Solexa/Illumina
Roche (454)
ABI SoliD
S EQUENCIAMENTO DE 2 º
G ERAÇÃO - C OMPARAÇÃO
P ROJETO G ENOMA
A estratégia...
O início...
As primeiras propostas para se mapear o
genoma humano surgiram em 1985,
quando um grupo de cientistas
pretendiam detectar mutações em
humanos. Com isso foi criado o Projeto
Genoma Humano.
Mais tarde Craig Venter funda a empresa
Celera Genomics, tendo como um dos
principais objetivos seqüênciar todo o
genoma humano antes do Projeto
Genoma Humano. Em 2000 a Celera
anuncia a conclusão do sequenciamento.
P ROJETO G ENOMA
Em 2001 duas montagens
do genoma humano foram
publicadas:
SINTOMAS DA DOENÇA
Farmacogenômica busca as causas da doença com
ferramentas de engenharia genética
TRATAMENTO COM DROGA ESPECÍFICA
NO
FUTURO A IDÉIA SERÁ?
O QUE PENSAR ??
Remédios personalizados ( ↓ efeito
colateral x ↑ eficiência).
Terapia gênica: substituição do gene
defeituoso
Aconselhamento genético:
prognóstico prévio de doenças,
pré-natal