Genética Geral II
Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza
Depto de Genética – UFPR
[email protected]
www.ufpr.br/~lehtonen
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
Inventada em 1983 por Kary Mullis
 é uma das técnicas mais comuns utilizadas em
laboratórios de pesquisas médicas e biológicas
Aplicações:
 seqüenciamento de genes
 diagnóstico de doenças hereditárias
 testes de paternidade e na medicina forense
 diagnóstico de doenças infecciosas

PCR
Reação de PCR:
 DNA
 dNTPs (desoxirribonucleotídeos trifosfatos)
 iniciadores (também chamados de primers)
 DNA polimerase
 solução tampão
PCR

Toda esta mistura é
colocada na máquina
de
PCR,
o
termociclador, que faz
ciclos de temperatura
pré-estabelecidos com
tempos exatos
Desnaturação


Processo no qual ocorre a separação da fita
dupla de DNA por meio da elevação da
temperatura.
As amostras são aquecidas a 94-96 ºC durante
um a vários minutos.
Hibridação

A temperatura é reduzida a 55-65 ºC durante
alguns segundos.

Os iniciadores hibridam com as sequências
complementares do DNA molde
Extensão

Eleva-se a temperatura a 72ºC por alguns
segundos.
A DNA polimerase faz a duplicação da
cadeia a partir dos iniciadores

PCR

animação
PCR – desenho dos iniciadores




Comprimento: em torno de 20 bases
GC: ideal em torno de 50%
Software para desenhar iniciadores:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome
PCR – desenho dos iniciadores
PCR-RFLP

Enzima de restrição:
–
–


mutação cria sítio de restrição
mutação elimina sítio de restrição
Transforma uma diferença de nt, que não
detectada em uma eletroforese, em uma
diferença de tamanho
Fragmentos com tamanhos diferentes
migram diferente na eletroforese
PCR-RFLP
PCR-RFLP









ALA
539 540 541 545 546
Seqüência normal....5'..GAA GCA GAA TGG.....GCA GG...3'
Iniciador (3')
GT CGT ACC.....CGT CC
Produto da PCR
5'..GAA GCA GCA TGG..............3'

Fnu4HI ou BsoFI

____________85 pb__________'________21 pb_________
PCR-RFLP
85pb
106pb
UU
UK
KK
PCR-RFLP

Vantagem: rapidez

Desvantagem: algumas enzimas tem
digestão parcial
PCR-SSCA (ou SSCP)
Análise de Conformação de Fita Simples






Descrita originalmente por ORITA e cols. (1989).
DNA é amplificado por PCR
Depois é desnaturado por calor
Gel de poliacrilamida não desnaturante
As fitas simples adquirem conformações tridimensionais e
correm em posições diferentes no gel.
Uma simples mutação de ponto pode alterar essa conformação
e, conseqüentemente, o padrão de bandas do fragmento
(IWAHANA e cols., 1992).
PCR-SSCA







Padronização da técnica  vários fatores
Relação bisacrilamida x acrilamida
Concentração de acrilamida
Tampão do gel  pH
Tempo de corrida
Temperatura de polimerização
Temperatura da corrida
PCR-SSCA
PCR-SSCA
Seqüenciamento didesoxi



Método de Sanger
Síntese de DNA na presença de
nucleotídeos didesoxi, os quais não tem o
grupo 3’-hidroxila.
Eles podem ser incorporados na cadeia, mas
terminam a síntese
Seqüenciamento

animação
PCR em tempo real




É uma técnica para a detecção e medida de produtos gerados
durante cada ciclo da PCR
A emissão dos compostos fluorescentes gera um sinal que
aumentará na proporção direta da quantidade de produto da
PCR.
Em tempo real é possível saber a quantidade de produto em
um ponto no qual a reação ainda está na fase exponencial
Por este motivo, essa técnica permite a quantificação, o
acompanhamento da reação e a apresentação dos resultados
de forma mais precisa e rápida, pois não mais requer a
detecção em gel de eletroforese.
PCR em tempo real
PCR em tempo real




SYBR Green
é um fluoróforo em suspensão, intercalante de DNA
dupla fita, que emite uma fluorescência verde com a
excitação da luz emitida pelo sistema ótico do
termociclador.
Durante a PCR, as moléculas do SYBR Green vão
se ligando ao DNA recém sintetizado
Um aumento da fluorescência é observado em
tempo real, o que possibilita o monitoramento
contínuo da reação
PCR em tempo real
SYBR Green
PCR em tempo real

Taqman
PCR em tempo real
PCR em tempo real
Aplicações




Quantificação
Detecção de carga viral
Determinação do número de cópias de um
gene
Análise da expressão gênica
PCR em tempo real


Exemplo de aplicação:
Investigação de amplificação ou deleção dos
genes BCHE e ACHE em tecido mamário
tumoral com relação ao tecido normal.
PCR em tempo real
Quantificação relativa
TumorCHE / Tumor18S
Q = ───────────────────────
SangueCHE / Sangue18S
PCR em tempo real
Gene BCHE
Sem Informação
20,93%
Amplificado
18,60%
Inalterado
9,30%
Deletado
51,16%
Genotipagem com Taqman
Homozigoto para o alelo marcado com
FAM
Heterozigoto
Homozigoto para o alelo marcado com
VIC
Genotipagem
FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs2863381
Características da Amostra
População1
Grupo
n2
Guarani (GRC) Ameríndio
58
Detalhes dos Genótipos
Frequência Alélica
TT
TC
CC
HW
T
C
0,431
0,414
0,155
>0,250 0,6379
0,3621
Kaingang (KRC) Ameríndio
58
0,793
0,190
0,017
>0,500
0,8898
0,1102
Japão (JPT)
Asiático
85
0,294
0,494
0,212
>0,950
0,5410
0,4590
China (HCB)
Asiático
81
0,272
0,506
0,222
>0,750
0,5250
0,4750
Europa (CEU)
Euro-americano 111
0,441
0,477
0,081
>0,250
0,6800
0,3200
Nigéria (YRI)
Africano
0,955
0,045
0,000
>0,750
0,9780
0,0220
112
Fonte: Alves, 2009
FREQUÊNCIAS GENOTÍPICAS E ALÉLICAS DO SNP rs3495
Características da Amostra
População1
Grupo
Guarani (GRC)
Ameríndio
n
57
Detalhes dos Genótipos
Frequência Alélica
GG
GA
AA
HW
G
A
0,000
0,035
0,965
>0,750 0,0175
0,9825
Kaingang (KRC)
Ameríndio
58
0,000
0,069
0,931
>0,750
0,0345
0,9655
Europa (EUR)
Euro-americano
24
0,042
0,375
0,583
1,000
0,2290
0,7710
China (CHN)
Asio-americano
24
0,000
0,458
0,542
0,150
0,2290
0,7710
218
0,170
0,427
0,404
>0,100
0,3830
0,6170
22
0,364
0,591
0,045
0,150
0,6590
0,3410
Afro-brasileiros (AFBII) Afro-brasileiro
África (AFR)
Afro-americano
2
Fonte: Alves, 2009