Controle - e descontrole - do Ciclo Celular
As três vertentes:
1. Os fãs do Pink Floyd, que acreditavam que a
chave estava nas vias disparadas pelos 10% de
soro fetal
2. Os caçadores de galinhas, que procuravam
por oncogenes inseridos em retrovírus tumoral
3. Os enfurnados nos laboratórios estudando
levedura e rãs, que não têm cancer, e
descobriram o relógio
Vertente 1, das células 3T3
• Meio de cultura
– Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)
• sais, aminoácidos, vitaminas, glicose
• tampão bicarbonato/ác. carbônico pH 7 em 5% CO2
• ou sal de fruta ENNO, caixa Tupperware e esponja
– Soro fetal bovino
• 10% v/v, seria o que uma célula “veria”
• Cultilab (Campinas)
• SORO x PLASMA: o que corre nos vasos?
– PDGF: importante fator plaquetário do soro
Só vou repicar umas células...
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Lavar 2x com PBS
Adicionar 1 mL de tripsina em PBS EDTA
Deixar filme de tripsina
Ressuspender em meio com soro
– o soro inativa a tripsina
– subcultivar com diluição (1/4, 1/6...)
• Anotar o número da passagem no frasco
Fibroblastos: modelo de estudo
• Célula normal = inibição por contato
– cresce até a “confluência” ou “monocamada”
– pára de se dividir com conteúdo de DNA de G1
– motivo: p27 bloqueia quinases reguladoras
das etapas do ciclo, exceto a da mitose
– células ficam quiescentes, mas não como Go
• Célula tumoral: perde inibição por contato
– empilha = focos de transformação
– ensaio: nº de placas com foco (+TPA ou PMA)
Descobrindo quanto se vai viver
• Pedaço de tecido
– embrião ou braço + pinça + tesoura
– colonização da superfície da placa = cultura
primária (geralmente fibroblastos)
– crise: cerca de 100 passagens se o doador for
jovem e morte da cultura por senescência
– protocolos iniciais: quase sempre resultavam
em células transformadas (empilhavam)
– protocolo 3T3 ou 10T1/2: imortais normais
(repiques feitos sem adimitir confluência)
Fases do ciclo de divisão celular
• Dois eventos visíveis
– M= células redondas e bi-refringentes
– S = incorporação de Timidina tritiada ou BrdU
• Dois vãos ou “gaps”
– G1, antes de S (DNA = 2C)
– G2, depois de S (DNA = 4C)
• Detecção de proliferação
– FACS, incorporação de BrdU ou índice mitótico
• Células quiescentes = estado “G zero” (Go)
Duração do ciclo
• Variações de G1
– G1 é ausente em embriões (não em mamíferos)
• até a midi-blástula
– Variável, porque soma-se a paradas
intermitentes em Go
• Variações de S
– curta em embriões (não em mamíferos)
• uso de maior número de origens de replicação
• Determinação do tempo de dobramento
– curva de crescimento em plote logarítmico
Sincronização das células
• Todas na mesma fase do ciclo
– Mitotic Shake-off (destacamento mitótico)
• Nocodazole 50 ng/ml por 4 horas (<100% em M)
• BANG, BANG, BANG
– Carenciamento para soro (24 h)
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•
células mais jovens que meio G1 páram (G1pm)
células mais velhas que meio G1 ciclam (G1ps)
ao final das 24 h, todas se acumulam em Go
demoram o dobro de G1 para percorrer Go/G1
– Afidicolina (inibe Pol. alfa): bloqueio em fase S
Lesões em DNA
• Quebras em cadeias de DNA
–
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sedimentação em gradiente de sacarose
desnaturação alcalina suave (Bihrimboin)
eluição alcalina
relaxamento de nucleóides
• Quantificação das modificações químicas
• Inibição de síntese de DNA
– taxa de incorporação de timidina tritiada
– velocidade de crescimento da cadeia de DNA
Sobrevivência celular
• Letalidade é um evento raro
• Segue distribuição de Poisson
• Classe Zero de Poisson
– quando a média de eventos letais é de 1 por
célula
– 37% das células sobrevivem
• Ombro da curva de sobrevivência
– indica capacidade de suportar lesões
– por reparo ou pouca genotoxicidade
Muitas lesões?
• Pode ser disparada a apoptose
– morte celular programada
– diferente de necrose
– iniciada por proteólise limitada mediada por
caspases
– envolve ação de nucleases que atacam o DNA
• Bloqueios de ciclo celular evitam apoptose
– permitem tempo de reparo
– mecanismos de checagem ou “checkpoints”
Instabilidade genômica
• Câncer = pelo menos 4 mutações
– incompatível com ocorrência ao acaso
– necessário instabilidade genômica
• Mutações
– reguladores do próprio ciclo celular
– positivos = protoncogenes (vírus RNA animal)
– negativos = supressores de tumor (vírus DNA)
• Afetam o relógio do ciclo celular
– quinases dependentes de ciclinas
v-sis
BPV E5
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HPV E6
HPV E7
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