Técnicas de Biologia Molecular em
microbiologia Clínica
Preparação de Ácidos Nucleicos
Prof.Doutor José Cabeda
Preparação das células:
pulverização pós congelação
Preparação das células:
homogeneização
MagnaLyser
Magna Lyser WorkFlow
FastPrep
Sonicação
Principio de funcionamento semelhante ao
MagnaLyser
 Fonte de agitação são ultrasons

Preparação das células do sangue:
Centrifugação em gradiente de densidade (Ficoll)
Preparação das
células do sangue:
Lise dos eritrócitos
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA
 DNA e RNA :
 Lise suave e solubilização do DNA/RNA
 Destruição enzimática das proteínas (proteases)
 Destrição e precipitação química das proteínas
(fenol/clorofómio/álcool isoamilico)
 Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de
amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio)
 Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia
remoção de sais)
Método do
fenol/
clorofórmio
Método do
salting-out
Libertação dos ácidos Nucleicos

Para alguns procedimentos os ácidos
nucleicos podem não ser puros
 Remover a hemoglobina com choque
osmótico
 Utilizar o pellet celular
 Libertar ácidos nucleicos com choque
térmico (ex PCR)
Adsorpção A Silica



Em 1979 Vogelstein & Gillespie descobrem que o
DNA adsorve a pó de vidro (silica) na presença de
NaI
Posteriormente verificou-se que outros agentes
caotrópicos como guadinida isotiocianato tem a
mesma propriedade que o NaI
Diferentes espécies de Ácidos nucleicos adsorvem
diferentemente em função da força iónica e pH
Separação de ácidos nucleicos
por cromatografia de troca iónica
Eluição dos vários ácidos
nucleicos em função do pH
Colunas de sílica (ex. Qiagen)
Formato de 96 poços
Vacuo Versus Centrifugação
Qiagen Biorobot 9604
Método de Boom
Sample + Lysis buffer GuSCN
Nucleic acid
Silica
Wash
Proteins and Lipids
Elution buffer
processing time
10 samples/1.5h
Centrifugation
Purified Nucleic acid
“Boom” compatible Sample Types
 Faeces
Full Blood
 Throat swabs
 Serum/plasma
 Dermal lesions
 PBMC/PBL
swabs
 Sputum
 Cerebro spinal
 Urine
fluids
 Brain tissue
 Cervical smears
 Spleen tissue
 Pus samples
 Foodmatrices
 Liver tissue
Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990

Nuclisens
Extractor
Unidade Principal
Baía dos reagentes
Cartridge modules
As cartridges
MagnaPure (Roche)
EZ1
EZ1
Magna Compact
Outros sistemas automáticos