Métodos Analíticos em Biotecnologia
Métodos envolvendo Ácidos Nucleicos:
•Extração e quantificação;
•Enzimas de modificação;
•Marcação;
•Hibridizações Moleculares;
•Desenho de iniciadores;
•PCR de várias modalidades;
•Clonagem gênica;
•Sequenciamento gênico;
•Genômica e bioinformática;
Precisamos de um novo olhar para
o básico conhecido na estrutura
dos ácidos nucleicos para
compreender os métodos com
mais facilidade
BASES NITROGENADAS
Purinas
Pirimidinas
5-Metildicetopirimidina
Dicetopirimidina
Base-Pareamento nos ácidos
nucleicos
Bases nitrogenadas e
ABSORÇÃO DE LUZ
U.V.
DOSAGEM DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ABSORÇÃO DE LUZ U.V.
D.O 260nm = 1,0 corresponde a
• 50g/mL de DNA dupla fita
•40 g/mL de DNA ou RNA simples fita
•20 g/mL de oligonucleotídeos.
D.O 260nm/ D.O 280nm : fornece a pureza de uma preparação de ácidos
nucleicos (1,8 e 2,0 para DNA e RNA respectivamente). Valores inferiores
indicam contaminação com fenol e proteínas.
Purificação de DNA por gradiente de Cloreto de
Césio e visualização por luz U.V.
O CsCl tem sua solução aquosa com uma gravidade específica próxima a do
DNA . Quando esta solução é centrifugada por um longo período de tempo e
em alta velocidade, atinge-se um equilíbrio com a formação de um gradiente de
densidade contínuo, com a porção mais concentrada de CsCl no fundo do tubo
e a porção menos concentrada no topo.
Tratamento ácido:
depurinação
MARCAÇÃO NÃO RADIOATIVA DO DNA
VIA BASES NITROGENADAS
•DIGOXIGENINA: O DNA é marcado com o
glicosídeo digoxigenina-11-UTP
•BIOTINA: O DNA é marcado com biotina
•COMPOSTOS FLUORESCENTES: O DNA é
marcado com compostos fluorescentes como Texas
Red.
dUTP-Digoxigenina
dUTP- Biotina
AÇÚCARES DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
Ligação P-O sensível a alkali e enzimas
Grupamentos Fosfatos nos
ácidos nucleicos
dATP

β
α
As sondas genéticas podem ser produzidas pelo emprego de
nucleotídeos marcados com radiosótopos no fosfato α, por
exemplo α 32P .
Ligações Fosfodiéster
Ligações fosfodiéster constituem o
núcleo principal da vida já que são parte
da constituição básica de todos os ácidos
nucleicos.
A hidrólise das ligações fosfodiester são
catalisadas pelas fosfodiesterases
(quebra do DNA)
•Etanol e isopropanol: A natureza higroscópica do DNA forma precipitados quando
colocado em presença de etanol ou isopropanol e pequenas concentrações de cátions
monovalentes.
A: desidratada
B: Helicoidal alongada
Laboratório de Biofísica do Kings College
Química de formação : Rosalind Franklin (1920-1958): Novembro de
1951- Cadeia
de fosfato-desoxiribose no exterior com bases no interior havendo
entre 2 e 4 hélices co-axiais.
Maurice Wilkins 15/12/1916- 05/10/2004
25 de abril de 1953 - Prêmio Nobel em 1962 junto com Maurice Wilkins)
Uma estrutura de ferro e
madeira, imitando uma
hélice dupla, foi a forma
que os biólogos James
Watson e Francis Crick
encontraram
para
demonstrar como é a
forma da molécula de
DNA.
Grupos fosfatos das ligações fosfodiester são
carregados negativamente
Por quê o mesmo
tamanho
molecular pode
migrar
diferentemente no
gel de
eletroforese?
Estrutura e propriedades dos RNAs
80% do material genético das células: rRNA
15%: tRNA
5%: mRNA
2%: sn RNA e scRNA
•Regiões dupla fita (Pontes de H) são rompidas
por altas temperaturas e calor (como no DNA!)
•Ligações fosfodiester são rompidas por alkalis
(NÃO OCORRE NO DNA!!!!)
mRNA
RNA polimerase II: Transcreve
os genes do mRNA (e também
o snRNA).
Ribosomos são compostos por moléculas de RNA e proteínas formando grandes
complexos que compreendem a maior parte da massa de uma célula. O
ribossomo tem um coeficiente de sedimentação de 70S, e pode ser dividido em
duas subunidades: 50S e 30S. Estas subunidades são compostas por unidades
separadas: a subunidade 50S possui 2 moléculas de RNA, uma de 23S e outra de
5S bem como 34 proteínas diferentes. A subunidade 30S tem como subunidades
a molécula de rRNA de 16S e 21 proteínas diferentes.
rRNA
RNA polymerase I (Pol I): Transcreve os
genes do rRNA dos precursores 23S e 16S
RNA polymerase III (Pol III): Transcreve os
genes para o rRNA 5S
tRNA
RNA polymerase III (Pol
III): Transcreve os genes
para os tRNAs.