A Genética Molecular
em Análises Clínicas
2001/2002
Prof.Doutor José Cabeda
Genética
Cuidados Básicos no Laboratório
PROTEGER A AMOSTRA

EVITAR CONTAMINAÇÕES
 Pontas de filtro
DNAses/RNAses
 Luvas
 Luvas
 3 Zonas Distintas
 Cobertas de banca
 Descontaminar bancas...
 Materiais M.B. Grade
 Descontaminar
PRECISÃO MÁXIMA
bancas...
• Confirmar volumes
• Tempos e Temperaturas exactos
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA

DNAses e RNAses
 Omnipresentes em todo o material biológico:
 Função biológica essencial
 Presentes em todo o material de vidro e de
plástico não tratado convenientemente
 Presentes em químicos não “Mol.Biol.Grade”
 Presentes nas mãos de todo o pessoal de
laboratório
Descontaminar
bancas e
equipamento
Pontas para
múltiplos
volumes
Pontas com marcas de volume
Pontas para tubos longos
Pontas para Geis
Pontas para DNA Genómico
Os tubos eppendorf:
A Genética Molecular
em Análises Clínicas
Preparação de Ácidos Nucleicos
2001/2002
Prof.Doutor José Cabeda
Genética
Preparação das células:
pulverização pós congelação
Preparação das células:
homogeneização
Preparação das células do sangue:
Centrifugação em gradiente
descontínuo de densidade (Ficoll)
Preparação das
células do sangue:
Lise dos eritrócitos
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA
 DNA e RNA de mamiferos:
 Lise suave e solubilização do DNA/RNA
 Destruição enzimática das proteínas (proteases)
 Destrição e precipitação quimica das proteínas
(fenol/clorofómio/ácido isoamilico)
 Precipitação dos ácidos nucleicos (Acetato de
amónio / Acetato de sódio / Cloreto de sódio)
 Redissolução dos ácidos nucleicos (prévia
remoção de sais)
Método do
fenol/
clorofórmio
Método do
salting-out
PREPARAÇÃO DE
DNA E RNA
 DNA e RNA bacteriano
 Como a dos mamíferos, mas é necessário ser
eficaz na separação de polissacáridos, muito
abundantes em algumas bactérias:
 CsCl
 Enzimas:
• Lisozima
• Lisostafina
• etc
Ultracentrifugação
em gradiente de
densidade (CsCl)
Separação de ácidos nucleicos
por cromatografia de troca iónica
Eluição dos vários ácidos
nucleicos em função do pH
Colunas de sílica (ex. Qiagen)
Formato de 96 poços
DNA Genómico
Vacuo Versus Centrifugação
Qiagen Biorobot 9600
Qiagen Biorobot 9604
Método de Boom
Sample + Lysis buffer GuSCN
Nucleic acid
Silica
Wash
Proteins and Lipids
Elution buffer
processing time
10 samples/1.5h
Centrifugation
Purified Nucleic acid
“Boom” compatible Sample Types
 Faeces
Full Blood
 Throat swabs
 Serum/plasma
 Dermal lesions
 PBMC/PBL
swabs
 Sputum
 Cerebro spinal
 Urine
fluids
 Brain tissue
 Cervical smears
 Spleen tissue
 Pus samples
 Foodmatrices
 Liver tissue
Ref. Boom et al. J. Clin. Microbiol. (28), 495-503, 1990

Nuclisens
Extractor
Unidade Principal
Baía dos reagentes
Cartridge modules
As cartridges
MagnaPure (Roche)
MagnaLyser
Outros sistemas automáticos