Métodos Alternativos para
Enumeração e Identificação de
Microrganismos
• QUESTÕES DE PROVAS;
• CONTEÚDO DAS PRÓXIMAS AULAS;
• EXERCÍCIOS CONCEITUAIS;
Blog do professor:
http://chicoteixeira.wordpress.com
Histórico
A tarefa do laboratório de microbiologia na área
farmacêutica consiste em prover, para todo o
processo de produção, informações de natureza
microbiológica, tais como:
TESTES DE
CONTROLE NO
MONITORAÇÃO
PROCESSO
AMBIENTAL
TESTES DO PRODUTO TERMINADO
Histórico
Para este propósito, o microbiologista deve
dispor de métodos analíticos confiáveis e exatos,
que permitam a enumeração e identificação de
microrganismos;
Falhas neste aspecto conduzirão a sistemas fora
de controle, ocasionando como consequência a
possibilidade de uso, pelo paciente, de produto
potencialmente inseguro, além de perdas para a
empresa;
Histórico
A área de métodos rápidos e automação têm se
desenvolvido aceleradamente nos últimos 15 a 20
anos;
Disponibilizando tecnologia e instrumentos
levando-se em conta o ambiente da indústria
farmacêutica, que é altamente regulado;
Assim, observa-se uma abordagem conservadora
e que apresenta a necessidade de rígidos
requisitos de validação;
Histórico
A maioria dos testes efetuados hoje continua a
ter por base métodos seculares, desenvolvidos
pelos microbiologistas pioneiros;
9000-8000 a.c.
Louis Pasteur
Robert Koch
Joseph Lister
Histórico
Testes baseados na diluição seriada e recuperar
os microrganismos usando meio de cultura
estéril, sólido ou líquido;
Isto ocorre porque esses métodos são simples e
não dispendiosos, podem ser muito eficientes, e
têm uma longa história de aplicação;
Porém, existem limitações decorrentes da baixa
velocidade do crescimento microbiano, seleção
do meio de cultura e respostas heterogêneas;
Histórico
Assim, verificou-se a necessidade da criação de
uma força tarefa, que trabalhando conjuntamente
para implementar os novos testes publicou um
relatório designado PDA Technical Report nº 33,
Evaluation, Validation and Implementation of New
Microbiological Testing Methods (PDA, 2000);
O relatório influenciou na publicação de diversos
outros capítulos e, como resultado, os métodos
microbiológicos rápidos passaram a ser vistos e
considerados para implementação na indústria;
Histórico
É necessário avaliar, validar e obter aprovação na
implementação das novas técnicas;
Então surge a questão
se os novos métodos
são tão bons quanto
os métodos clássicos
ou convencionais.
Novos paradigmas
De 1965 a 1975 enfatizou-se a miniaturização e o
desenvolvimento de kits diagnósticos;
O período do desenvolvimento de kits de testes
imunológicos ocorreu de 1975 a 1985, enquanto
de 1985 a 1995 o foco recaiu sobre as provas
genéticas e a reação de polimerase (polymerase
chain reaction – PCR);
A tendência atual tem, de modo geral, se dirigido
ao âmbito do biosensor e da tecnologia do chip,
contando com instrumentação e automação;
Novos paradigmas
Porém, a maioria dos métodos disponibilizados
aos microbiologistas farmacêuticos e aceitos
pelas autoridades regulatórias, baseiam-se em
métodos de cultivo;
Novos paradigmas
Considerando os vários dias de incubação, e o
impacto dessa demora levar à perda de produtos
contaminados;
Por exemplo, se for identificada contaminação
num teste em processo, um ciclo de fabricação
pode ser interrompido e o problema corrigido;
Assim, podendo ser poupado o alto custo do
produto terminado e dos inventários e evitando a
redução da flexibilidade de resposta à demanda;
Novos paradigmas
Outra desvantagem relativa à abordagem usual
ou tradicional consiste no fato de que métodos
de cultivo empregados podem não ser capazes
de recuperar todos os microrganismos presentes
na amostra-teste;
O que pode resultar na potencial liberação de
produto contaminado;
Novas tecnologias microbiológicas, que superam
todas ou algumas das limitações dos métodos
convencionais, estão disponíveis;
Novos paradigmas
Estes novos métodos apresentam resultados no
mesmo dia ou em até 2 dias, muito mais rápido
quando comparado aos métodos tradicionais;
Existem certos sistemas cujos resultados podem
ser obtidos em tempo real, tornando possível
obter monitoramento ambiental ou biocarga de
insumos antes do início da produção;
Adicionalmente, há métodos rápidos que não
dependem de cultivo, assim, não exigem o
crescimento de microrganismos;
Métodos Microbiológicos
Os métodos de testes microbiológicos podem ser
divididos em três amplas categorias gerais, de
acordo com a sua finalidade:
• Detecção de presença ou de ausência de
microrganismos em uma amostra-teste;
• Enumeração de microrganismos presentes na
amostra-teste;
• Caracterizar e identificar microrganismos que
são recuperados de produto ou do ambiente;
Métodos Microbiológicos
Considerando as tecnologias para testes de
controle de qualidade microbiológico, com
ênfase nas inovadoras, podemos classificá-las
em:
• Tecnologias baseadas no crescimento;
• Tecnologias baseadas na viabilidade;
• Tecnologias baseadas
celulares, ou artefatos;
nos
componentes
• Tecnologias baseadas nos ácidos nucleicos;
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Parâmetros bioquímicos ou fisiológicos refletem
o crescimento dos microrganismos e, sendo
dependentes do crescimento destes, não são
caracterizados como testes realmente rápidos;
Adicionalmente, a seletividade inerente de meios
de cultura e suas condições de incubação
limitam a faixa de microrganismos a serem
enumerados;
As tecnologias baseadas no crescimento e suas
aplicações incluem:
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Bioluminescência ATP e AK
Tecnologias Baseadas no Crescimento
A medida de bioluminescência do ATP para
análise microbiológica é amplamente usada na
indústria de alimentos e cosméticos, para várias
aplicações, incluindo monitoramento e testes de
produtos terminados;
Nos últimos anos tem crescido o interesse dos
laboratórios farmacêuticos por estes sistemas;
Comercialmente disponíveis, há três sistemas
com potencial uso na indústria farmacêutica:
Tecnologias Baseadas no Crescimento
MicroStar®
PallChek®
Rapidscreen®
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Detecção colorimétrica e da pressão
do headspace de produção de CO2
Tecnologias Baseadas no Crescimento
GLICOSE e LACTOSE
MANITOL
Utilização de carbono, reações bioquímicas e fisiológicas
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Impedância e condutividade (detecção de bioburden)
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Permite a automatização
na semeadura de
amostras, evitando
contaminações cruzadas
e diminuindo o tempo e o
número de placas;
Plaqueamento Espiral
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Membrana filtrante
hidrofóbica
Pour plate e semeadura da
amostra em superficie
Tecnologias Baseadas no Crescimento
Método dos tubos múltiplos
Tecnologias Baseadas na Viabilidade
Baseiam-se na coloração vital de componentes
bioquímicos das células microbianas, ou ainda
na fluorescência da clivagem enzimática de
substratos fluorogênicos das paredes celulares;
Como não se baseiam no crescimento dos
microrganismos, podem ser universais e rápidos;
Suas aplicações incluem:
Microscopia direta de
filtro epifluorescente
Tecnologias Baseadas na Viabilidade
Citometria de
Fluxo
Tecnologias Baseadas em
Componentes Celulares ou Artefatos
Baseiam-se na medida de componentes celulares
que proporcionam um alto grau de especificidade
conduzindo a resultados rápidos;
As desvantagens incluem a possível necessidade
de elevado número de células para alguns tipos
de testes, sua alta especificidade, necessidade
de grandes bases de dados e mudança de
paradigma, ao tratar microrganismos (entidades
bioquímicas) como substâncias químicas;
Tecnologias Baseadas em
Componentes Celulares ou Artefatos
Suas aplicações incluem:
• Perfis de ésteres metílicos de ácidos graxos;
• Espectrometria de massa por dessorção e
ionização a laser assistida por matriz (MALDITOF);
• Técnicas de fluorescência de anticorpos;
• Ensaio de imunossorbância ligada à enzima;
Tecnologias Baseadas em
Componentes Celulares ou Artefatos
Suas aplicações incluem:
• Aglutinação de látex;
• Ensaio de endotoxina;
• Coloração de Gram;
Tecnologias Baseadas nos
Ácidos Nucleicos
Baseiam-se na detecção de sequências de ácidos
nucleicos. São limitadas pela preparação de
amostra, captura do alvo, amplificação e
detecção das sequências de ácidos nucleicos;
Suas aplicações incluem:
• Sondas de ácidos nucleicos;
• Amplificação de DNA - PCR;
Tecnologias Baseadas nos
Ácidos Nucleicos
• Técnicas de sequenciamento do RNAr,
porções 16S e 23S;
• Impressões digitais (fingerprint) – PCR
– baseadas na sequência repetitiva;
• Amplificação da transcrição – mediada
em tempo real;
• Pyrosequencing;
Tecnologias Baseadas nos
Ácidos Nucleicos
• Riboprinting automatizado;
• Mapeamento óptico;
OBRIGADO