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FACULDADE ASSIS GURGACZ
DESENVOLVIMENTO DE UM CREME ANTIOXIDANTE PARA USO
DERMATOLÓGICOA PARTIR DE UM PRINCÍPIO ATIVO CONTENDO
PRE/PROBIÓTICOS
CASCAVEL
2015
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JAQUELINE COSTA VALE
DESENVOLVIMENTO DE UM CREME ANTIOXIDANTE PARA USO
DERMATOLÓGICOA PARTIR DE UM PRINCÍPIO ATIVO CONTENDO
PRE/PROBIÓTICOS
Trabalho de conclusão de curso apresentado
como requisito de avaliação da disciplina de
TCC II do curso de Farmácia da Faculdade
Assis Gurgacz.
Profa. Orientadora: Suzana Bender
CASCAVEL
2015
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JAQUELINE COSTA VALE
DESENVOLVIMENTO DE UM CREME ANTIOXIDANTE PARA USO
DERMATOLÓGICOA PARTIR DE UM PRINCÍPIO ATIVO CONTENDO
PRE/PROBIÓTICOS
Trabalho apresentado no Curso de Farmácia da FAG, como requisito parcial
para obtenção do título de Bacharel em Farmácia, sob a orientação da Professora
Suzana Bender.
BANCA EXAMINADORA
Suzana Bender
Especialista
Giovane Douglas Zanin
Mestre
Yara Jamal
Mestre
Cascavel, 20 de Junho de 2015.
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Sumario
1 - REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................ 5
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 21
2 - ARTIGO ..................................................................................................................27
NORMAS DA REVISTA CIENTÍFICA
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1 – REVISÃO DE LITERATURA
1.1 RADICAIS LIVRES
Os
radicais
livres
são
qualquer espécie
química
capaz
de
existir
independentemente que apresente um ou mais elétrons não pareados e contenham
um número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica. Em geral, essas
espécies são instáveis, tem uma meia-vida curta, e reagem rapidamente com
diversos compostos e alvos celulares, podendo ser formados quando eles cedem o
elétron solitário, oxidando-se, ou recebem outro, reduzindo-se. Portando, os radicais
livres são resultantes ou provocados pelas reações de óxido-redução (DATTNER,
1999).
A sua produção pode ocorrer de forma endógena no citoplasma, nas
mitocôndrias ou nas membranas e o seu alvo celular
(proteínas,
lipídeos,
carboidratos e DNA) estando relacionado com o seu sítio de formação. Outra forma
de produção é a exógena devido à radiação ultravioleta, em especial o UVA que
reage com fotos sensibilizadores e com cromóforos da pele como a melanina. Sendo
assim, o processo do fotoenvelhecimento ocorre devido ao excesso de
radicais
livres formados neste processo. Quanto mais expostos ficamos a essa
radiação
maior é a quantidade de radicais livres que se acumulam, sem a capacidade de
neutralizar ou eliminá-los podem ocorrer alterações irreversíveis nas células ou
mutações como rugas, flacidez, desenvolvimento de células cancerosas e outras
doenças patológicas. Outras fontes exógenas são ambientais como pesticidas,
poluição, cigarro, medicamentos antitumorais e estilos de vida não saudáveis, que
também podem provocar estas alterações (OGA, 2003; FERREIRA & MATSUBARA,
1997).
O oxigênio molecular e seus radicais são os reagentes mais importantes nas
células aeróbicas. O termo “espécies reativas de oxigênio” (ERO) inclui os radicais
livres contendo oxigênio, como o ânion superóxido (O2-), o radical hidroxila (OH-), o
hidroperóxido (H2O) e espécies não radicalares como o peróxido de hidrogênio
(H2O2) e o oxigênio singlete (1O2), os quais são frequentemente gerados como
subprodutos de reações biológicas ou por fatores exógenos (ANDRADE et al.,2007).
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As ERO´s são produzidas no organismo por fagocitose e como consequência
do metabolismo celular normal. Já que 95% do oxigênio consumido pelas células
seguem para a cadeia transportadora de elétrons e os 5% restantes, apresentam
erros no processo de redução do oxigênio, dando assim, origem as ERRO
(CANTERLE, 2005). Estes por sua vez atuam no processo de lesão tecidual de
patologias, tendo como fontes, a cadeia
transportadora
de
elétrons das
mitocôndrias, leucócitos ativados, a enzima xantina oxidase, além dos produtos da
auto-oxidação das catecolaminas e os metabólitos da degradação do ácido
araquidônico (SCHIMITZ et al., 2005).
Segundo Morais-de-Souza (2007) os danos que as ERO´s podem causar em
organismos vivos são divididos em cinco categorias; citotoxicidade ou morte celular;
mutagênese, causada devido aos danos aos ácidos nucleicos ou as suas enzimas
ativadoras; estresse mecânico endotelial, possibilitando o aparecimento
de
aterosclerose; inativação de antiproteases; desagregação de polissacarídeos no
tecido conjuntivo, que gera processos degenerativos na cartilagem articular.
Sua produção é controlada nos seres vivos por diversos compostos
antioxidantes, os quais podem ter origem endógena como a dismutase e peroxidase,
ou serem provenientes da dieta alimentar. Destas últimas destacam-se tocoferóis e
carotenoides, além disso, os antioxidantes podem ser produzidos de forma sintética
como é o caso do PG e do BHT (SOUSA et al., 2007).
1.2. FOTOENVELHECIMENTO
A pele é o maior órgão do corpo humano e corresponde a 15 % do peso
corporal, estando diretamente exposta ao estresse oxidativo
especialmente o
causado pela radiação ultravioleta (BORGES, 2010).
Os raios solares possuem em sua constituição a radiação ultravioleta A, B e
C. Os raios UVC's incidem em um comprimento de onda entre 180 nm e 290nm,
sendo chamados de comprimento de ondas curtas, os UVB's incidem entre 290 e
320 nm, e são comprimento de ondas médias já os UVA's atuam entre 320 e 400
nm, e são denominados comprimento de ondas longas. A radiação UVC tem pouca
incidência na superfície terrestre, sendo está retida pela camada de ozônio. Já as
radiações UVA e UVB estimulam a formação de radicais livres, não se tem certeza
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qual das duas provoca mais o aparecimento destas moléculas. No entanto sabe-se
que juntas são mais danosas que isoladamente e
que
o
estresse oxidativo
provocado por elas nas camadas da pele depende da penetração dos raios
ultravioletas que por sua vez levam ao fotoenvelhecimento (MAGALHÃES, 2000).
A exposição crônica ou excessiva à radiação UV, gera radicais livres que se
sobrepõem a capacidade de defesa da pele, causando a inativação de antioxidantes
enzimáticos e depleção dos não enzimáticos, imediatamente após a irradiação, o
que pode levar a morte celular por apoptose ou necrose (RITTIE; FISHER, 2002)
O fotoenvelhecimento ocorre quando o indivíduo se expõe à radiação solar
em excesso. Seu grau e intensidade podem variar de acordo com o tipo da pele e
tempo de exposição. Quando a luz penetra na pele, a radiação pode danificá-la
interagindo a um nível molecular com cromóforos, alterando a sua estrutura química,
ou a um nível subatômico criando um estresse oxidativo. (ORIÁ
et
al;
2003;
TESTON, 2010).
Desta forma destaca-se o uso de antioxidantes como preventivo tanto por
via oral, como por via tópica, visando à prevenção
ou
correção
das lesões
resultantes dos radicais livres produzidos pela radiação UV.
1.3. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Os antioxidantes podem ser definidos, do ponto de vista biológico, como
compostos que protegem os sistemas biológicos contra efeitos potencialmente
danosos causados por processos ou reações que promovem a oxidação de
macromoléculas e estruturas celulares (SOUSA et al., 2007).
É imprescindível para o antioxidante ser considerado de qualidade, possuir as
seguintes propriedades, presença de substituintes doadores de elétrons ou de
hidrogênio ao radical; função de potencial de redução; capacidade de deslocamento
do radical formado em sua estrutura; capacidade de quelar metais de transição
implicados no processo oxidativo e acesso ao local de ação este dependendo de
sua hidrofilia ou lipofilia e de seu coeficiente de partição (MANACH et al., 2004).
A atividade antioxidante possui várias linhas o sistema primário é formado por
substâncias que impedem ou interrompem a geração de espécies reativas, ou
sequestradores evitando a interação com seus alvos. Já os sistemas secundários
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são formados geralmente por compostos fenólicos, que bloqueiam a etapa de
propagação da cadeia radicular, sequestrando radicais livres secundários. A terceira
linha é constituída pelos sistemas de reparo do DNA, proteínas e lipídeos (OGA,
2003).
Os antioxidantes oriundos de fontes naturais enquadram-se na linha de
defesa secundária, que podem atuar como agentes redutores, sequestradores de
radicais livres, inibidores de enzimas e como quelantes de metais possuindo assim a
capacidade de interromper a formação de radicais livres. Neste contexto, vários
estudos têm demonstrado que estes antioxidantes provenientes de fontes naturais,
como por exemplo, os obtidos através de alimentos, apresentam uma grande
importância
na
prevenção
de
doenças
crônicas,
tais
como
doenças
cardiovasculares, câncer e desordens cerebrais degenerativas relacionadas ao
envelhecimento, sendo assim podem ser considerados antioxidantes por excelência
(CATANEO et al., 2008; MORAIS-DE-SOUZA, 2007).
Pesquisas realizadas tem sua fundamentação relacionada á atuação dos
antioxidantes, comprovando assim a eficácia do seu uso no processo
de
envelhecimento, já que os mesmos atuam nos mecanismos de defesa contra os
radicais livres e impedem a sua formação, principalmente pela inibição das reações
em cadeia com o ferro e o cobre. Além destas atuações eles também, interceptam
os radicais livres gerados por fontes exógenas ou pelo próprio metabolismo,
impedindo assim o ataque aos lipídeos, aminoácidos, duplas ligações dos ácidos
graxos e as bases de DNA, com isso evita a formação de lesões e a perda da
integridade celular, além disso realizam a proteção e o reparo de lesões causadas
pelos radicais estando esses relacionados a remoção de danos da molécula de DNA
e a reconstituição de membranas celulares danificadas, sendo alguns antioxidantes
obtidos da dieta, como as vitaminas C, E e A, os flavonóides e carotenoides
extremamente importantes na intercepção dos radicais livres (SOUSA et al., 2007).
Para determinação da atividade antioxidante uma das metodologias mais
comum, prática, rápida e sensível é a que envolve um radical cromóforo estável, que
estimula as espécies reativas de oxigênio (EROs), sendo o radical livre DPPH (1,1 difenil-2- picrilhidrazina) um dos mais utilizados. Este método consiste em avaliar a
capacidade antioxidante via sequestro do radical livre através de espectrofotometria,
com um pico de absorção no comprimento de onda de 515- 518 -nm, em meio
metanólico ou etanólico. No teste de captura com DPPH ocorre uma reação de oxi-
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redução, onde o DPPH, que apresenta coloração violeta, é reduzido, ou seja, o
elétron desemparelhado do nitrogênio se emparelha com o elétron cedido por um
radical hidrogênio de um antioxidante, tornando a solução amarela e ocorrendo a
formação do DPPH-H, reduzido e estável. É essa característica de mudança de
coloração que permite o acompanhamento visual da reação. (ANDRADE
et
al.,
2007).
A avaliação da atividade antioxidante se da através da monitorização do
consumo do radical livre pela amostra através da medida do decréscimo da
absorbância. (SOUSA et al. 2007).
1.4. PROBIÓTICOS COMO ANTIOXIDANTES
O interesse no papel das bactérias ácido lácticas na promoção da saúde
humana remota pelo menos ao ano de 1908, quando Metchnikoff sugeriu que o
consumo de leite fermentado com lactobacilos iria prolongar a vida. Esta crença
fortaleceu o marketing de muitos alimentos contendo culturas vivas de bactérias
lácticas, denominados como probióticos, pois inúmeros estudos subsequentes
comprovaram que seu consumo é seguro e proporciona efeitos benéficos à saúde.
(RICHARDSON, 1996).
Desde então estas bactérias são utilizadas na produção de laticínios tais
como leite ou iogurte e atualmente possuem grande importância na indústria,
principalmente por sua capacidade de inibir o crescimento de patógenos
nos
alimentos fermentados e no intestino do hospedeiro quando ingeridos.
O termo “probiótico” foi introduzido pela primeira vez em 1965 por Lilly e
Stillwell, definindo-se como o fator de origem microbiológico que estimula o
crescimento de outros organismos. Em 1989, Roy Fuller introduziu a ideia de que o
mesmo tem um efeito benéfico para o hospedeiro.
Schrezenmeir & De Vrese (2001) propuseram que o termo probiótico deveria
ser usado para designar preparações ou produtos que contêm
microrganismos
viáveis definidos e em quantidade adequada, que alteram a microbiota própria das
mucosas por implantação ou colonização de um sistema do hospedeiro.
As bactérias probióticas proporcionam benefícios à saúde que incluem o
balanço da flora intestinal, influenciando
beneficamente seu equilíbrio , competindo
10
com microorganismos patógenos, melhorando a digestão e reforçando o sistema
imune, além de estimular a produção de vitaminas, quando ingeridos (BAETS
et.al.2008).
Inúmeras evidências indicam que os probióticos podem ser
úteis
como
agentes antioxidantes, pois nos últimos anos várias investigações foram conduzidas
para elucidar e comprovar estas propriedades das bactérias ácido lácticas in vitro e
in vivo, sendo os Lactobacillus um dos probióticos existente mais pesquisado.
Sugere-se que os Lactobacillus podem melhorar a defesa
antioxidante
do
hospedeiro, pois possuem sistemas para manter os radicais livres em níveis que não
são tóxicos para as células. (STECCHIN et al. 2001; AHIRE et al. 2013).
Em 1993, Kaizu et al relataram pela primeira vez a atividade antioxidante das
bactérias ácido lácticas em ratos com deficiência de vitamina E é demonstraram que
o tratamento com Lactobacillus sp. diminuiu potencialmente o risco de estresse
oxidativo. Além disso, Sanders et al. (1995) verificaram que os Lactobacillus
Lactococcus demonstram atividade da enzima superóxido dismutase importante na
defesa antioxidante na maioria das células expostas ao oxigênio.
Posteriormente, Lin e Yen (1999) e Lin e Chang (2000) observaram que
cepas diferentes de Lactobacillus e Bifidobactérias, na forma de células intactas e
extratos livres, foram capazes de inibir a auto-oxidação do ascorbato, quelar íons
metálicos dimunir os íons superoxidos e outros ERO's e a peroxidação lipídica in
vitro.
A defesa microbiana contra os efeitos danosos das espécies reativas de
oxigênio envolve componentes enzimáticos e não enzimáticos (STECCHINI
et
al.2001).
As maiorias das bactérias ácidas lácticas reagem através da produção de
enzimas superóxido dismutase (STECCHINI et al. 2001), que catalisam radicais
superóxido a oxigênio e peróxido de hidrogênio e da glutationa peroxidase
que
elimina peróxido de hidrogênio e os radicais hidroxila (AMANATIDOU et al., 2001b).
Algumas bactérias ácido lácticas podem também produzir antioxidantes não
enzimáticos, com atividade de redução e capacidade quelante de íons metalicos
(SAIDE E GILLILAND, 2005; LEE et al, 2005). O uso de cepas específicas pode
demonstrar diferentes mecanismos de ação.
Em estudos anteriores o Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium longum,
Lactobacillus fermentum e Lactobacillus sake (LIN E CHANG, 2000c; KULLISAAR et
11
al, 2002;
AMANATIDOU et
al,
2001a)
demonstraram
possuir
atividade
antioxidante, e foram capazes de diminuir o risco de acumulação de ROS, inibindo a
peroxidação do ácido linoleico e a capacidade de varrer os
radicais
livres
DPPH.Lee et al. (2005) descobriram que o L. casei KCTC 3260 parece remover íon
metálicos, o que resulta no bloqueio da cadeia oxidativa.
Assim, os probióticos podem representar uma ferramenta terapêutica na
prevenção do estresse oxidativo através da via tópica ou por ingestão. Essas cepas
antioxidantes, com propriedades desejáveis, representam um material promissor
para a indústria de alimentos e farmacêutica, considerando o fato de
que
a
microbiota humana tem que ser tolerante ao estresse oxidativo endógeno e exógeno
(CATANEO et al., 2008; MORAIS-DE-SOUZA, 2007).
1.5.
ALPHA-GLUCAN
OLIGOSACCHARIDE
E
POLYMNIA
SONCHIFOLIA ROOT JUICE (AND) MALTODEXTRIN E LACTOBACILLUS.
O princípio ativo é uma combinação original e simbiótica, que contém de βfrutooligossacarídeo e α-glucooligossacarídeo em conjunto com
Lactobacillus
inativados, atomizado em maltodextrina, tornando esta associação mais estável.
Fornece uma ação complementar pré probiótica desencadeando uma melhora na
aparência da pele por confrontar as agressões diárias, mantendo, estimulando e
reconstituindo a ecoflora cutânea. (SOLABIA, 2009).
Os prebióticos afetam beneficamente o hospedeiro, por
estimularem
seletivamente a proliferação ou atividade de populações de bactérias desejáveis,
possuem capacidade de inibir a multiplicação de patógenos. Fazem parte desta
composição os prebióticos GLUCO-OLIGASSACARÍDEO (GOSα) obtido por um
processo de síntese enzimática a partir de açúcares naturais (maltose de milho,
sacarose de beterraba) e os FRUTOOLIGOSSACARÍDEOS:
fibras
dietéticas
solúveis prebióticas, extraída da raiz da chicória. São polímeros de frutose ligados à
glicose, com capacidade de promover o desenvolvimento de microorganismos
probióticos (bifidobactérias), imprescindíveis e benéficos para microbiota (SOLABIA,
2009).
O ativo também tem sua eficácia atribuída aos Lactobacillus casei e
Lactobacillus acidophilus. O Lactobacillus casei, é uma espécie de bactéria lática
fenotipicamente e geneticamente heterogênea. É caracterizado como microrganismo
12
gram-positivo, não esporulado, catalase-negativo, desprovido de
citocromo,
anaeróbio, mas aerotolerante, ácido-tolerante e estritamente fermentativo. Devido a
sua forma de bastonetes é chamado de “bacilos” e por ter a capacidade de
transformar, através da fermentação o açúcar do leite (lactose) em ácido láctico, é
chamado de Lactobacillus (FERRERO, 1996).
Já Lactobacillus acidophilus possui características muito semelhantes ao
Lactobacillus casei. É um bastonete gram-positivo, não formador de esporos,
homofermentativo de catalase negativa, que habita comumente o trato intestinal do
ser humano. (MERCENIER, 2002).
Aplicações não intestinais de probióticos são pouco investigadas, no entanto,
estes microorganismos são passíveis de serem aplicados a qualquer ambiente onde
existe uma microbiota normal, assim como a pele, embora menos complexa
(TANNOCK, 1995).
Neste sentido o princípio ativo estimula também os mecanismos de defesa
natural da pele ativando células como os queratinócitos a secretar peptídeos
antimicrobianos melhorando a superfície da pele, proporcionando o conforto, bem
estar de uma aparência esteticamente agradável (SOLABIA, 2009).
O mecanismo de ação do princípio ativo, segundo o fornecedor, é bastante
diversificado e compõem no mínimo uma das seguintes categorias: 1) Inibição de
patógenos e restabelecimento da homeostase microbiana. 2) Proteção da barreira
epitelial. 3) Modulação da resposta imune.Sua atividade antioxidante não foi
pesquisada.
1.6.
INIBIÇÃO
DE
PATÓGENOS
E
RESTABELECIMENTO
DA
HOMEOSTASE MICROBIANA
Vários microrganismos probióticos apresentam atividade antagonista contra
espécies patogênicas pela síntese de bacteriocinas, peróxido de hidrogênio, ácidos
orgânicos voláteis, ácido lático e acético (JIN et al, 2000).
No caso dos probióticos, existe na literatura uma ampla gama de trabalhos
descrevendo a ação antagonista destas substâncias, capazes de
inibir
a
multiplicação de outras bactérias, mesmo em baixas concentrações, contra vários
patógenos, tais como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus
faecalis, Klebsiella pneumoniae, Clostridium sporogenes, Clostridium perfringens
13
Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis, dentre outros (JAMUNA et al, 2005;
GARCIA et al., 2006; TODOROV; DICKS, 2007; TODOROV, 2009).
As bacteriocinas, dependendo de sua concentração, são bactericidas ou
bacteriostáticas e atuam permeabilizando as membranas de células sensíveis por
meio da formação de poros, o que causa desequilíbrio iônico e fluxo de íons fosfato.
A consequência da formação de poros é a dissipação da força protônica (PMF), que
está envolvida diretamente com a síntese de ATP, fosforilação e transporte de
proteínas, síntese e rotação dos flagelos (BRUNO; MONTVILLE, 1993).
A produção de bacteriocinas ocorre principalmente na fase
logarítmica.
Estudos relataram que todas as bacteriocinas até então conhecidas são sintetizadas
como pré-peptídeos com uma sequencia N-terminal que dirige seu transporte para
fora da célula e é removida antes que uma bacteriocina ativa possa ser detectada.
Na região C-terminal, em alguns casos, o polipeptídeo precursor sofre modificações
pós-tradução. Estas modificações incluem desidratação de resíduos de serina e/ou
treonina específicas, o que resulta na formação
de
2,3-dideidroaminoácidos;
e
adição de grupos tióis de resíduos de cisteína as ligações duplas de alguns desses
aminoácidos, o que gera resíduos de lantionina e b-metil lantionina. O transporte dos
peptídeos para o ambiente externo é carreado por um efluxo dependente de ATP de
complexos proteicos associados à membrana (PIARD et al., 1992).
Segundo KLAENHAMMER (1993), as bacteriocinas de
bactérias láticas
podem ser divididas em 4 classes, de acordo com as propriedades estruturais e
físico-químicas. As bacteriocinas da classe I e II, as mais conhecidas, apresentam
peso molecular inferior a 10 kDa e termoestabilidade. As das classes III e IV não são
bem conhecidas, mas apresentam peso molecular superior a 30 kDa;
são
termolábeis e podem ser proteínas hidrofílicas ou
por
proteínas, fosfolipídios e/ou carboidratos (Tabela 1).
complexos
formados
14
O peróxido de hidrogênio é importante para a manutenção do equilíbrio da
microbiota, como um antagonista cujo espectro de ação inclui a inibição do
crescimento de bactérias patogênicas Gram negativas, como demonstrado por
Pridmore e colaboradores (2008), que observaram a atividade anti-Salmonella de
Lactobacillus johnsonii NCC533 derivada da produção de peróxido. Além disso, ele
também pode estar impedindo o estabelecimento de patógenos na colonização da
vagina (VALLOR et al. 2001).
O desenvolvimento de certas espécies de Lactobacillus previne o crescimento
de vários agentes patogênicos no trato gastro intestinal, pois reduz o pH
local
através da produção de ácidos orgânicos, bem como de ácido lático e acético.
(GARCIA et al., 2006). Um estudo que destaca a relação entre a produção destas
substâncias e a inibição de patógenos é o de De
Keersmaecker colaboradores
(2006) que atribui à atividade antimicrobiana da linhagem GG de Lactobacillus
rhamnosus contra Salmonella enterica à produção de ácido lático.
15
Figura 1: Resumo do mecanismo de ação dos probióticos.
Fonte: (DE KEERSMAECKER, 2008).
PB: probiótico; PG: patógeno; CEI: célula epitelial intestinal; CD: célula dendrítica; MC: macrófago.
1.7. PROTEÇÃO DA BARREIRA EPITELIAL
A competição por nutrientes e/ou competição entre linhagens patogênicas e
microrganismos probióticos pelos mesmos sítios de adesão (exclusão competitiva),
além da indução da síntese de defensinas e muco são propriedades que promovem
a proteção da barreira epitelial pelos probióticos. (TURNER et al, 2001; OLIVEIRA et
al., 2002; SAAD, 2006).
1.8. DEFENSINAS
As defensinas são pequenos AMPs (peptídeos antimicrobianos), ricos em
arginina com peso molecular de 3 a 5 kDa (BOGEFORS et al, 2012), que podem ser
originadas em diferentes sistemas ou células como os leucócitos, queratinócitos,
melanócitos, pneumócitos e células de Paneth, assim como no sistema
nervoso
16
central (GANZ, 2002; SELSTED; OUELETTE, 2005; SUN et al, 2005; VAN
DAMME
et al, 2009; YANG et al, 1999).
Foram descobertas no início dos anos 80 (ANTCHEVA et al., 2006) e seus
mecanismos de ações incluem vários graus de atividade antimicrobiana contra
bactérias, fungos e vírus. A sua maioria atua ao
penetrar
na
membrana
citoplasmática microbiana por meio de atração elétrica (catiônicas), formando um
poro na membrana que permite o extravasamento de lisozimas. Ferramentas que
poderiam ser usadas para o entendimento de sinais intracelulares frente a várias
enfermidades são: o bloqueio de proteases, reparação e proliferação celular,
quimiotaxia, ativação do sistema de complemento e síntese de citocinas (SELSTED;
OUELETTE, 2005; VAN DAMME et al, 2009).
Estudos recentes demonstram a importância desses peptídeos na pele,
especificamente na epiderme, onde constituem uma importante barreia imunológica
contra bactérias e outros agentes patógenos (ASANO et al, 2008).
1.9. DEFENSINAS E Β-DEFENSINAS
Dentro da bioquimica, as defensinas são consideradas como peptídeos
pequenos (25-49 aminoácidos) que possuem formato anfipática α-hélice ou de
lâminas-β e pontes dissulfeto estáveis entrando em contato com a superfície
microbiana de bactérias, artrópodes, anfíbios, mamíferos, fungos, plantas, moluscos
(STEINSTRAESSER et al, 2011). As diferentes extirpes de defensinas (α, β e θ) são
presentes variavelmente nos mamíferos, sendo expressas
por
macrófagos,
monócitos, células dendríticas e células epiteliais (CROVELLA et al, 2005;
BOGEFORS et al, 2012).
Sendo formadas por pontes de cisteínas, que são efetivas na resposta imune
contra antígenos-específicos (LYNN; BRADLEY, 2010; BOGEFORS et al.,
2012)
além disso destaca-se a sua evidente eficiência na diminuição da incidência assim
como no tamanho e multiplicação de lesões de pele, induzidas pela exposição à luz,
como a ocorrência de carcinomas de células escamosas (HILL et al., 1991).
Na década de 80 entre os três tipos de defensinas existentes, as α-defensinas
foram às primeiras a serem identificadas como moléculas ricas em cisteína,
componentes de neutrófilos e células fagocíticas dos mamíferos. Na sequência, no
início da década de 90 as β-defensinas foram identificadas nos leucócitos e epitélios
17
de mamíferos (LEONARD et al, 2012; ANTCHEVA et al, 2006). As defensinas são
moléculas catiônicas (polar) espacialmente carregadas e com regiões hidrofóbi cas
(GANZ, 1999; CROVELLA et al, 2005). Essa estrutura permite a inserção de
fosfolipídios na sua membrana fazendo com que as regiões hidrofóbicas
ocultas com a sua membrana oleosa interna,
assim
suas
fiquem
regiões catiônicas
interagem com cabeças de fosfolipídios aniônicos e a água (anfipáticas), atuando
assim como antibióticos e moléculas de sinalização (GANZ, 1999; DIAO et al, 2007;
LYNN; BRADLEY, 2010).
Acontece na superfície da mucosa e na pele a ponte estabelecida pelas βdefensinas entre a imunidade inata adaptativa (YANG et al, 1999), envolvendo a sua
ação antibacteriana a permeabilização das células-alvo como um passo
crucial.
Dentre as suas diversas funções imunológicas e não imunológicas incluem-se:
bloqueio de proteases e transcriptase reversa, ativação do sistema de complemento,
síntese de citocinas, além da diferenciação de tecidos reprodutivos, cor preta na
pelagem dos cães, maturação espermática e propriedades analgésicas (CROVELLA
et al, 2005; CANDILLE et al, 2007; BOGEFORS et al, 2012; LEONARD et al, 2012).
As defensinas são moléculas produzidas por neutrófilos em resposta
a
infecção, em questão de minutos a horas alcançando níveis máximos no organismo
em 24 horas (TIZARD, 2000; GANZ, 2002). Suas propriedades quimiotáxicas se
baseiam nos sinais intracelulares transmitidas a outras células de defesa do
hospedeiro estabilizando uma ligação entre elas e o sistema imune adaptativo
(LEONARD et al, 2012). As propriedade quimiotáxica das β-defensinas foram
estudadas principalmente na β-defensinas hBD-1 (β-defensina humana 1) e hBD-2 (βdefensina humana 1). A hBD1 produzida de forma induzida está expressa nos túbulos
renais e em menor grau no pâncreas e outros sítios epiteliais; a hBD2, e produzida
normalmente e também de forma induzida na pele e
outros
epitélios durante a
inflamação (YOUNT et al, 2009; STEINSTRAESSERET et al, 2011; BOGEFORS, et
al, 2012). Concentrações micro molares de defensinas são capazes de atrair células
dendríticas e células T de memória, sendo capaz de iniciar
a resposta imune
secundária. Como as β-defensinas, os neutrófilos humanos e as α- defensinas
também atraem células T. Além disso, algumas defensinas também bloqueiam
receptores adrenocorticotróficos e podem inibir a produção de hormônios adrenais
imunodepressores numa infecção aguda (SELSTED; OUELETTE, 2005; ERLES et al,
2010; LEONARD et al, 2012).
18
1.10 MODULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE
Bactérias probióticas são capazes de modular a resposta
imune
hospedeiro por meio da ativação de macrófagos, proliferação de células
T
do
e
aumento da produção de imunoglobulinas, anticorpos e citocinas (OLIVEIRA et al.,
2002; PANCHENIAK, 2005).
A modulação imune dos probióticos é um resultado da interação de moléculas
conservadas da parede celular destes microrganismos (MAMPs) com receptores de
reconhecimento do hospedeiro (PRRs), induzindo assim as
vias de
sinalização
imune, sendo a resposta imunológica gerada dependente diretamente da linhagem
probiótica ingerida e do tipo celular ao qual ela se liga (CROSS, 2002;
OELSCHLAEGER, 2010).
A interação do microrganismo probiótico com as células dendríticas é o fator
que promove a produção de citocinas, principais moléculas do complexo de
histocompatibilidade principal para apresentação de antígenos, e moléculas coestimulatórias que polarizam células T em células T regulatórias e auxiliares tipo 1 e
2.
Todos os mecanismos citados são elucidados e comprovados no informe do
fornecedor, porém a pesquisa da atividade antioxidante ainda não foi realizada.
1.11. ANTIOXIDANTES EM COSMETOLOGIA
A procura pela juventude e beleza da pele, cresce constantemente, tanto por
parte das mulheres quanto dos homens, e com esta visão o mercado de produtos
cosméticos tem inovado em sua tecnologia, criando novos produtos, pesquisando
novos princípios ativos e comprovando a eficácia na utilização dos mesmos
(GILCHREST; KRUTMANN, 2007).
Os produtos cosméticos prometem hoje melhorar a aparência da pele, a sua
textura e a sua saúde no geral. Este mercado teve um grande crescimento
nos
últimos anos. Segundo a (ABIHPEC, 2014) indústria brasileira de higiene pessoal,
perfumaria e cosméticos apresentou crescimento médio de 10% nos últimos anos,
tendo um faturamento de 34 bilhões de reais em 2012, o Brasil ocupa atualmente a
quarta posição mundial em vendas de produtos para a pele (ABIHPEC, 2014).
19
Uma parcela considerável da indústria cosmética, baseando-se em evidências
científicas, desenvolveu produtos utilizando princípios ativos antioxidantes com o
propósito de proteger a pele das radiações solares UVA e UVB. Impedindo assim a
ação dos radicais livres e a oxidação das células, evitando os danos ao DNA e
fibroblastos, retardando os efeitos indesejados do tempo e prolongando a boa
qualidade e aparência da pele (DISTANTE; RIGANO; 2010).
Estudos têm demonstrado o poder de certas vitaminas e bactérias como
antioxidantes em cosméticos, através de testes laboratoriais e clínicos que fornecem
fortes evidências que estes componentes em níveis adequados, têm importante
papel nos processos protetores, corretivos e de renovação da pele. Estas pesquisas
também constatam efeitos na redução do processo de degeneração de células,
ajudando a prevenir o aparecimento de doenças e retardando o envelhecimento do
organismo (ALMEIDA, 2008).
Deste modo, o uso de antioxidantes aumentou, sendo cada vez mais
aconselhados por dermatologistas como complemento de tratamentos, tanto para
uso tópico como oral, de forma individual ou em associação. Independente da sua
via de administração, o objetivo é o mesmo: evitar o estresse oxidativo, prevenindo a
ocorrência de lesões, ou reparando danos já existentes (BARATA, 2002).
Quando usados regularmente os antioxidantes exercem efeitos benéficos em
produtos para cuidados cutâneos, sendo assim eficazes na reparação da pele na
melhoria do aspecto e da qualidade da mesma e capaz de atrasar o envelhecimento
cutâneo (WALTERS, 2008).
1.12.
DESENVOLVIMENTO
DE
UM
PRODUTO
COSMÉTICO
ANTIOXIDANTE
Os produtos cosméticos são substâncias ou misturas destas destinadas
entrar em contato com as partes externas do corpo humano (epiderme,
piloso, unhas, etc.) ou com os dentes e as mucosas bucais, tendo em
a
sistema
vista,
exclusiva ou principalmente a função de, limpar perfumar, modificar o aspecto,
proteger, manter em bom estado ou corrigir os odores corporais, podendo ser
classificados em grau I e grau II (ANVISA, 2005). A principal diferença entre eles
são os dizeres de rotulagem e a composição, os cosméticos de grau I possuem
20
propriedades básicas, cuja comprovação inicialmente não é necessária e não requer
informações detalhadas quanto ao seu modo de usar e suas restrições. No entanto
os cosméticos de grau II são produtos com risco potencial, ou seja, produtos com
indicações específicas, que exigem informações e cuidados quanto ao modo e
restrições. Pode conter ingredientes considerados irritantes quando utilizados em
altas concentrações; devem ser registrados na ANVISA e apresentar os testes de
eficácia e segurança. O produto a ser desenvolvido trata-se de um cosmético grau II
com atividade especifica (ANVISA, 2014).
O processo de desenvolvimento de produtos situa-se exatamente na interface
entre a indústria e o mercado, cabendo a ela identificar, e na medida do possível,
antecipar as necessidades e propor soluções para atender de modo adequado o
consumidor. Atualmente, observa-se um crescimento na busca por produtos naturais
para tratar a pele, isto porque existe um grupo considerável de clientes que excluem
o uso de ativos petroquímicos e priorizam os que possuem uma produção
ecologicamente correta, usado como matéria-prima produtos da biodiversidade
natural existente no país (RIBEIRO, 2009).
Nesse sentido, o creme dermatológico a ser desenvolvido vem de encontro
com esta necessidade, uma vez que usa um princípio ativo natural, com poucos
produtos ainda no mercado e com grande potencial de aplicação.
21
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27
2 – ARTIGO
DESENVOLVIMENTO DE UM CREME ANTIOXIDANTE PARA USO
DERMATOLÓGICO A PARTIR DE UM PRINCÍPIO ATIVO CONTENDO
PRE/PROBIÓTICOS.
Jaqueline Costa Vale1*; Suzana Bender2
RESUMO: O presente estudo fundamentou-se na necessidade
de
explorar o
potencial dos probióticos na pele, avaliando a atividade antioxidante de um creme
dermatológico contendo os mesmos e sua possível utilização no tratamento do
fotoenvelhecimento. Este princípio ativo é o único comercialmente disponível
no
Brasil, contendo células bacterianas intactas liofilizadas e atomizadas. O objetivo da
pesquisa foi avaliar a atividade antioxidante do creme dermatológico contendo préprobióticos, através do método DPPH, verificando a viabilidade celular e a
caracterização morfo-tintorial e bioquímica das cepas da fração
probiótica
do
princípio ativo. Em cada 1 grama do princípio ativo foram encontradas em média
4,15.109 UFC, as colônias encontradas apresentaram características morfo-tinturiais
condizentes com as do Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei. No método
do DPPH, o
creme dermatológico apresentou atividade antioxidante
dependente.O produto desenvolvido possui potencial de
inovação
e
dose
pode ser
utilizado para o fotoenvelhecimento, pois não existem outros no mercado com
o
mesmo princípio ativo para a mesma aplicação.
UNITERMOS: Antioxidantes, Creme Dermatológico, Pré/Probióticos, Viabilidade,
DPPH, Lactobacilos,
ABSTRACT:
This study was based on the need to explore the potential of probiotics in
the skin, evaluating the antioxidant activity of a dermatological cream containing
them and their possible use in the treatment of photoaging. This active principle is
the only commercially available in Brazil, containing bacterial cells lyophilized and
atomized intact. The objective of the research was to evaluate the antioxidant activity
1*
Acadêmica do curso de Farmácia da Faculdade Assis Gurgacz. Email: [email protected]
do cusro de Farmácia da Faculdade Assis Gurgacz.
2 Docente
28
of dermatological cream containing pre-probiotics, through the DPPH method,
checking cell viability and morpho-dyeing and biochemical characterization of strains
of probiotic fraction of the active ingredient. In each 1 gram of active ingredient were
found in average 4,15.109 UFC, the colonies had
found
morpho-tinturiais
characteristics consistent with those of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus
casei. In the method of DPPH, the dermatological cream was active antioxidant dose
dependent.The product developed has potential for innovation and can be used for
photoaging, for there are no others on the market with the.
KEYWORDS:
1. INTRODUÇÃO
Internacionalmente os probióticos são definidos
como
micro-organismos
vivos, que quando administrados em quantidades adequadas conferem benefício a
saúde do hospedeiro. Formulações orais e alimentos com probióticos são utilizados
para restaurar o equilíbrio microbiano, principalmente no trato gastrointestinal e
recentemente, para o tratamento de condições inflamatórias e alérgicas, sendo que
bactérias especificas são capazes de modular o sistema imunológico a níveis locais
e sistêmicos (CROSS, 2002).
Nos últimos anos autores levantaram a hipótese de um novo modelo de
unificação, ou seja, eixo intestino-cérebro-pele, sugerindo que a modulação da
microbiota pela implantação dos probióticos poderia exercer profundos efeitos
benéficos sobre a homeostase também da pele, assim como, prevenir e tratar
doenças incluindo os sinais externos do envelhecimento (CATENEO, 2008).
Estudos clínicos publicados na última década sugerem
que
numerosas
estirpes de probióticos apresentam grande potencial para o uso na dermatologia
além do bem-estar intestinal já consagrado (BARATA, 2002).
Sendo assim os mesmos podem representar uma alternativa
para
o
tratamento de diversas afecções da pele, além de serem mais seguros ao
consumidor, pois são produtos naturais com melhor tolerância e menor capacidade
alergênica. Fato este que atende a demanda por este tipo de produto, denominado
biocosméticos impulsionando os avanços técnicos e científicos no setor
consequentemente, o desenvolvimento de novos cosméticos (BRINEY, 2004).
e,
29
Aplicações não intestinais de probióticos são pouco investigadas, no entanto,
estes microrganismos são passíveis de serem aplicados a qualquer ambiente onde
existe uma microbiota normal, assim como a pele. (TANNOCK, 1995).
Neste sentido, o presente estudo fundamenta-se na necessidade de explorar
o potencial dos probióticos na pele, avaliando a atividade antioxidante de um creme
dermatológico contendo os mesmos e sua possível utilização no tratamento do
fotoenvelhecimento. Este princípio ativo é o único comercialmente disponível
no
Brasil, contendo células bacterianas intactas liofilizadas e atomizadas.
O princípio ativo em estudo é um insumo original e simbiótico, que contém as
fibras solúveis prebióticas β-frutooligossacarídeo e α-glucooligossacarídeo
em
conjunto com cepas de Lactobacillus inativados, atomizado em maltodextrina,
tornando esta
associação
mais
estável. Fornece uma ação
complementar
pre/probiótica desencadeando uma melhora na aparência da pele por confrontar as
agressões diárias, mantendo, estimulando e reconstituindo a ecoflora cutânea.
(SOLABIA, 2009).
O ativo também tem sua eficácia atribuída aos Lactobacillus casei e
acidophilus. O Lactobacillus casei, é uma espécie de bactéria lática fenotipicamente
e geneticamente heterogênea. É caracterizado como microorganismo gram-positivo,
não esporulado, catalase-negativo, desprovido de citocromo, anaeróbio,
mas
aerotolerante, ácido-tolerante e estritamente fermentativo. Devido a sua forma de
bastonetes é chamado de “bacilo” e por ter a capacidade de transformar, através da
fermentação o açúcar do leite (lactose) em ácido láctico, é chamado de lactobacilos
(FERRERO, 1996).
Já Lactobacillus acidophilus possui características muito semelhantes ao
Lactobacillus casei. É um bastonete gram-positivo, não formador de esporos,
homofermentativo, catalase negativo, que habita comumente
o
trato
intestinal
humano. (MERCENIER, 2002).
O mecanismo de ação do princípio ativo, segundo o fornecedor, é bastante
diversificado e compõem no mínimo uma das seguintes categorias: 1) Inibição de
patógenos e restabelecimento da homeostase microbiana. 2) Proteção da barreira
epitelial. 3) Modulação da resposta imune. Sua atividade antioxidante não foi
pesquisada.
30
O objetivo da pesquisa foi avaliar a atividade antioxidante do creme
dermatológico contendo pré-probióticos, através do método DPPH, verificando a
viabilidade celular e a caracterização das cepas da fração probiótica do princípio
ativo.
Além da inibição de micro-organismos patogênicos, há estudos que procuram
verificar atividades benéficas dos probióticos na pele, como aumento da hidratação,
inibição da melanogênese e antioxidação. O foco do presente trabalho buscou
verificar
a
capacidade
antioxidante de
um creme dermatológico
contendo
pre/probióticos, de modo a validar essa nova vertente de estudos desse tema (KIM
et al, 2015; TSAI et al, 2013).
31
2. METODOLOGIA
O trabalho foi do tipo prospectivo experimental, onde a atividade antioxidante
de um creme dermatológico contendo pré/probióticos foi avaliada.
O estudo foi desenvolvido nas dependências do campus da Faculdade Assis
Gurgacz (FAG), localizada na cidade de Cascavel – PR.
2.1 Materiais Utilizados
O reativo 2,2-difenil-1-picril-hidrazila (DPPH) (Sigma-Aldrich Co.), ferricianeto de
potássio, ácido tricloroacético, cloreto férrico, fosfato de sódio monobásico anidro e
fosfato de sódio dibásico anidro (Vetec Química Fina Ltda) e metanol (Merck)
utilizados no trabalho eram analiticamente puros. O princípio ativo foi adquirido da
empresa Solabia. O ágar e o caldo MRS- De Man Rogosa and Sharpe (Oxoid) e o
caldo TSB - Tryptic Soy Broth (Acummedia) foram adquiridos na empresa Paraná
Labor Comércio de Produtos e Equipamentos para Laboratório
LTDA.Os
equipamentos utilizados foram: vórtex (Phoenix Luferco – AP56), centrífuga Excelsa
modelo 280 R (Fanem-Brasil), sonicador-ultra som USC750 (Ultra Sonic CleanerUnique). As medidas de absorção foram realizadas em espectrofotômetro UV-Vis
modelo 1600 (Nova) utilizando cubetas de vidro com percurso óptico de 1,0 cm.
2.2 Ativação da fração probiótica do princípio ativo
A ativação das cepas liofilizadas dos probióticos contidas no princípio ativo é
importante para possibilitar a verificação da viabilidade celular e caracterização das
cepas presentes no produto.
Para ativação das cepas liofilizadas, 1 grama do princípio ativo foi transferido
para tubos contendo 10 mL de caldo TSB (TrypticSoyBroth) 10% (v/v), os
foram posteriormente incubados por um período de 24 horas
anaerobiose a 37 °C ±1, conforme metodologia de Redondo (2008).
em
jarra
quais
de
32
2.3 Viabilidade da fração probiótica do princípio ativo
A viabilidade foi realizada segundo Schmitt (2014) com o objetivo de verificar
quantas células viáveis o produto apresentava, pois, esta informação não constava
no laudo do fornecedor. Após 24 horas de incubação foi realizada a centrifugação da
cultura a 5000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o sedimento
ressuspenso em 10 mL de solução salina fosfatada tamponada, com posterior
homogeneização em vórtex seguida de centrifugação. O procedimento foi realizado
03 vezes, a fim de eliminar todo o caldo do sedimento.
Posteriormente,
ressuspendeu-se o sedimento com 9 mL de solução fosfato tampão. A partir desta
suspensão foram realizadas oito diluições sucessivas. A viabilidade celular foi
determinada pela técnica de semeadura em profundidade, utilizando o meio ágar
MRS (De Man Rogosa e Sharp). As análises foram realizadas em triplicata, com uma
repetição.
Para contagem, foram utilizadas placas que apresentaram entre 30 e 300
colônias, multiplicando-se o resultado individual pela respectiva diluição.
Os
resultados médios por diluição foram expressos em UFC.g-1 de produto.
2.4 Isolamento das cepas da fração probiótica do princípio ativo
O isolamento das bactérias foram realizados a partir de agar MRS que permite
apenas o crescimento destes probióticos (GARCIA, 1999).
2.5 Caracterização da fração probiótica do princípio ativo
2.5.1 Caracterização morfo-tintorial
A quarta etapa consistiu na caracterização morfo-tintorial do o princípio ativo
liofilizado, com o objetivo de comprovar que o mesmo continha cepas
de
Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei. A caracterização morfológica foi
realizada observando o aspecto das colônias na placa contendo meio de cultura. Já
a caracterização morfo- tintorial foi realizada pelo método de Gram conforme Tortora
(2010). Para isso foram preparadas suspensões a partir das colônias
isoladas
33
apresentando aspectos morfológicos diferentes em salina fisiológica, com as quais
foram preparados esfregaços em lâminas de vidro. Após coloração pelo método de
Gram, foram observadas as características tintoriais das células ao
microscópio
óptico com auxílio de objetiva de 100X (imersão). As amostras bacterianas
caracterizadas como “BACILOS” Gram positivos, aos pares, isolados ou em
pequenas cadeias foram, então, caracterizadas presuntivamente como do gênero
Lactobacillus spp. (GARCIA, 1999).
2.5.2 Prova da catalase
Na quinta etapa foi realizada a caracterização do princípio ativo a partir da
avaliação da presença da catalase, através de metodologia convencional. Uma gota
de peróxido de hidrogênio (H2O2 a 3% (v/v), foi adicionada, em lâmina de vidro,
sobre uma colônia bacteriana, previamente identificada, a fim de se selecionar
bactérias ácido-lácticas catalase-negativo com ausência de produção de bolhas
(GARCIA, 1999).
2.6 Elaboração do creme dermatológico
A sexta etapa resumiu-se na preparação do creme dermatológico. O princípio
ativo foi adicionado a uma concentração de 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0 % à base creme.
A preparação consistiu no aquecimento, separadamente, fases 1 e 2 até 75°C.
Após, verteu-se fase 1 sobre fase 2, deixando atingir a temperatura de 45°C.
Separadamente, dispersou-se o princípio ativo em suas concentrações 1%, 1,5%,
2%, 2,5% e 3% no dimeticone e incorporou-se as respectivas bases
cosméticas
q.s.p. para 100 gramas, em seguida as mesmas foram invasadas e rotuladas.
2.7 Determinação da atividade antioxidante do creme dermatológico
2.7.1Varredura da solução metanólica do DPPH
Foi realizada a varredura espectrofotométida
da solução metanólica do
DPPH, a fim de determinar o comprimento de onda de máxima absorção da
solução. A varredura espectrofotométrica foi realizada na região do UV visível, na
faixa de 430 a 650 nm.
34
2.7.2 Avaliação da Atividade Antioxidante do creme dermatológico
A metodologia foi realizada conforme Mensor (2001) com
algumas
modificações. Foram pesadas 0,2 g de cada amostra de creme nas diferentes
concentrações (1,0;1,5;2,0;2,5 e 3%), as quais foram adicionadas 1,8mL da solução
metanólica de DPPH 50 mg L-1.. Em seguida, as amostras foram centrifugadas
por 15 minutos e deixadas em repouso no escuro por mais 15 minutos.
A absorbância da solução foi mensurada em espectrofotômetro em um
comprimento de onda de 517nm. O branco foi preparado utilizando os cremes em
suas diferentes concentrações acrescidas de 1,8 mL de metanol sem a adição
de DPPH. O controle negativo consistiu em creme base adicionado de solução
metanólica de DPPH.
Os experimentos foram realizados em duplicata, com uma repetição, à
temperatura ambiente e ao abrigo da luz.
O percentual da atividade antioxidante foi calculado conforme a seguinte
equação:
% AA=
2.8 Análise estatística
Após tabulação dos dados obtidos, foram calculados a média das duplicatas
com uma repetição (n=4) e o desvio padrão da média (±S). Os valores encontrados
para as duplicatas das amostras foram verificados estatisticamente pelo teste de
variância (ANOVA) e pelo teste de Tukey usando o software SISVAR versão 5.3. As
diferenças que apresentaram níveis de probabilidade menores e iguais a
5%
(p≤0,05) foram consideradas estatisticamente significativas.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A importância das bactérias probióticas na manutenção e melhora da saúde
humana em todas as faixas etárias estão cada vez mais comprovadas (BOTELHO et
al, 2008; KOMATSU et al, 2008).
Atualmente admite-se que os efeitos benéficos dos probióticos vão
muito
além dos relacionados com as atividades metabólicas e fisiológicas do trato
gastrintestinal, incluindo pele e mucosas, onde os probióticos podem ter
efeito
protetor natural contra micro-organismos. O conceito de probióticos começa a não
serem mais restrito as bactérias que habitam o cólon, mas também as comunidades
35
microbianas de outras partes do corpo, como pele e mucosa vaginal, onde a
microbiota regional impede a proliferação de bactérias patogênicas (SOUZA et al,
2010; MARTINEZ, 2008).
A nível dermatológico, novas evidências dos efeitos benéficos dos microorganismos probióticos, assim, como de aplicações de produtos simbióticos
(associação
interessantes.
de
prebióticos
e
probióticos),
Tem-se como exemplo,
o
estão
trabalho
apresentando
que
resultados
utilizou metabólitos
Lactobacillus para reprimir a atividade patogênica oportunista de Staphylococcus
epidermidis (LAU; LIONG, 2014).
Viabilidade da fração probiótica do princípio ativo
A avaliação da viabilidade celular é importante por considerar que a microbiota
bacteriana de um produto é realmente viável, ou seja, que realmente há microorganismos presentes para realizar os efeitos esperados. Através dos dados
obtidos foi possível determinar que em 01 grama do princípio ativo analisado, estão
presentes em média 4,15.109 UFC.g-1
As
contagens das colônias não apresentaram diferenças
estatísticas
significativas, com coeficiente de variação de 3,52%, como demostrado na Tabela 2.
TABELA 2: Contagem de colônias de Lactobacillus spp.
Número de colônias bacterianas
Placa 1
Placa 2
Placa 3
Média das triplicatas com uma
repetição
Coeficiente de variação
4.109
UFC.g-1
4.5 109 UFC.g-1
3.7 109 UFC.g-1
4.15 109 UFC.g-1
3,52%
*Ensaio realizado em triplicata com uma repetição
Caracterização da fração probiótica do princípio ativo
Os resultados encontrados estão expressos na Tabela 3:
Repetição
4.3 109 UFC.g-1
3.5 109 UFC.g-1
3.9 109 UFC.g-1
36
TABELA 3: Caracterização da fração probiótica do princípio ativo.
Caracterização Tintorial das colônias
Prova da
Catalase
Caracterização morfológicas das
colônias
Colônia 1
Bacilos medianos Gram positivos, aos pares,
isolados ou em pequenas cadeias.
Colônia 2
Negativa
Colônias
brancas;
pequenas,
profundas
e
Bacilos medianos Gram positivos, aos pares,
isolados ou em pequenas cadeias.
Negativa
Colônias
medianas
convexas
amarelas com aspecto cremoso.
Após análise dos resultados e comparação com dados obtidos na literatura,
foi possível presumir que as bactérias analisadas eram do gênero Lactobacillus,
espécie L. acidophilus (colônia 1) e L. casei (colônia 2).
Avaliação da Atividade Antioxidante do creme dermatológico
A média das absorbâncias, das duplicatas com uma repetição e o desvio padrão
das mesmas estão demonstrados na tabela 4.
TABELA 4: Média das absorbâncias das duplicatas com uma repetição e o desvio padrão.
Concentração
1,00%
1,50%
2,00%
Primeira Leitura
1
0,922
Segunda Leitura
1
1,004
Primeira repetição
0,9424
Segunda L. da repetição
Desvio Padrão
Média
2,50%
3,00%
0,893
0,83
0,825
1
0,964
0,863
0,9248
0,8928
0,8384
0,8272
0,9416
0,9008
0,8976
0,8952
0,8232
0,08018379
0,04535063
0,05281322
0,06192242
0,01900386
1
0,9234
0,8953
0,8668
0,8261
A partir dos percentuais calculados da atividade antioxidante foi construído o gráfico
da porcentagem da atividade antioxidante versus concentração para cada amostra. Os
resultados estão apresentados na figura 2.
Figura 2: Porcentagem da atividade antioxidante nas diferentes frações do creme dermatológico.
Diferenças significativas (P<0,05) estão indicadas com letras diferentes.
37
Observou-se que a atividade antioxidante do princípio ativo foi dosedependente, ou seja, demonstrou ter maior atividade antioxidante quanto maior a
concentração.
As formulações nas concentrações de 1,5%, 2% e 2,5% apresentaram
atividade antioxidante superior a 20%. Entretanto, entre si, estas três formulações
não apresentaram diferenças estatísticas significativas, o que explica as letras
semelhantes no gráfico.
Contudo, essas formulações apresentaram diferenças estatísticas na atividade
antioxidante em comparação com a formulação que continha 1% do princípio ativo.
Neste caso a atividade antioxidante foi superior.
A formulação do creme dermatológico na concentração de 3% apresentou a
maior atividade antioxidante em relação às demais concentrações. Este resultado foi
estatisticamente diferente
(P<0,05)
em comparação com as formulações contendo
concentrações inferiores.
A atividade antioxidante dose-dependente também foi observada no trabalho
de Gusmão et al (2013), ao avaliarem um fluido hidratante facial contendo ácido
ascórbico (vitamina C), utilizando o método do DPPH. A atividade antioxidante
encontrada variou de 0,2% a 1%, conforme aumentou a concentração de ácido
ascórbico.
Em um estudo que avaliou a eficácia do sobrenadante do Lactobacillus
rhamnosus em cosméticos, comparou-se a atividade antioxidante do sobrenadante
nas concentrações de 10%, 50%, 100% com o butil hidroxi anisol
(BHA). Nesse
estudo as amostras que continham 100% do sobrenadante do L. rhamnosus
apresentaram resultados muito próximos ao do BHA, que ficou em um pouco mais
de 70% de atividade antioxidante. Para um estudo preliminar, o resultado obtido foi
considerado promissor. (TSAI et al, 2013).
Cinque et al. (2011) realizaram uma série de experiências, a fim de estudar a
atividade antioxidante de uma estirpe específica de bactéria acido lática, a S.
thermophilus S244. Extratos desta bactéria apresentaram atividade antioxidante
quando comparados à uma substância utilizada como referência desta atividade
(Trolox) de forma dose-dependente. Com base nestes dados os autores avaliaram
ainda o efeito fotoprotetor do lisado desta bacteria e observaram que a mesma foi
capaz de proteger as células humanas da radiação UV também de forma
38
dependente. Os autores atribuiram esta capacidade fotoprotetora à capacidade
antioxidante desta bactéria.
Os probióticos podem ainda ser utilizados na ativação de compostos bioativos
de aplicação em cosméticos dermatológicos, diminuindo o efeito alergênico que
alguns compostos causam, aumentando a eficácia antioxidante, anti-melanogênese
e anti-rugas (LEE et al, 2012).
Fries e Frasson (2010) investigaram a atividade antioxidante de quatro
cosméticos anti-idade comercializados em todo o país pelo método DPPH. Neste
trabalho foi possível constatar que os cremes apresentavam atividade antioxidante,
entretanto a intensidade desta ação foi diferenciada entre eles, devido aos variados
compostos empregados em suas formulações. Ainda, segundo os autores, a
composição dos cremes não estava especificada quantitativamente na rotulagem.
Existem várias moléculas com propriedades antioxidantes
utilizadas
em
cremes dermatológicos, umas alvo de diversos estudos, tais como a vitaminas
lipossolúveis A e E e outras que demonstram grande potencial, mas que ainda
necessitam de alguns estudos, como os probióticos.
Grande parte dos estudos até o momento, comprovam a
atividade
antioxidante das células bacterianas ou dos extratos livres de células como no
estudo realizado por Lin e Yen (1999), tanto pelo método do DPPH como por outras
metodologias. Estes estudos atribuíram a atividade antioxidante das células dos
lactobacilos à composição da sua parede celular. No envoltório destas bactérias,
existem exopolissacarídeos compostos por açucares redutores capazes de
reduzir
íons metálicos. Também estão presentes glicoproteínas denominadas S. Layer que
ajudam na manutenção da célula bacteriana e são responsáveis pela sobrevivência
das mesmas às condições adversas, como por exemplo na eliminação dos radicais
livres. Outra substância presente é o ácido lipotecóico que está ligado a membrana
celular. Este ácido possui capacidade de limpar os cátions e conferir propriedades
eletromecânicas à parede celular, mediando a adesão às células epiteliais (Delcour
et al., 1999).
4. CONCLUSÃO
Foi desenvolvido um creme dermatológico antioxidante, contendo pré/probióticos,
no qual 1 grama de princípio ativo apresentou 4,15.109 UFC de Lactobacillus
39
acidophilus e Lactobacillus casei. O produto cosmético desenvolvido representa uma
inovação e possui potencial para ser utilizado no fotoenvelhecimento, pois não
existem no mercado brasileiro outros contendo o princípio ativo para esta aplicação.
40
5. REFERÊNCIAS
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NORMAS DA REVISTA CIENTÍFICA
INSTRUÇÕES AOS AUTORES



Escopo e política
Forma e preparação de manuscritos
Envio dos manuscritos
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impressa
ISSN 1809-4562 versão online
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FARMACÊUTICAS/Brazilian Journal of Pharmaceutical
Sciences tem por finalidade publicar os seguintes tipos de
publicação: Artigos originais relacionados com as áreas de
conhecimento das Ciências Farmac êuticas, Trabalhos de
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solicitados a especialistas pela Comissão de Publicações ou
quando submetidos em forma de Abstract para avaliação
quanto ao interesse. Ressalta- se a necessidade de se incluir
visão crítica dos autores, inserindo os seus trabalhos no tema
e avaliando em relação ao estado de arte no País. Notas
Prévias relativas a novas metodologias e resultados parciais,
cuja originalidade justifique a publicação rápida. Nesse caso,
o limite é de 2.000 palavras, excluindo-se tabelas, figuras e
referências. Pode- se incluir, no máximo, uma figura, tabela e
10 referências. Resenhas elaboradas por especialistas
segundo sugestão da Comissão de Publicações. Suplementos
temátic os e aqueles relativos a eventos cientiíficos podem ser
publicados mediante aprovação prévia da Comissão de
Publicações. Os trabalhos elaborados por especialistas
nacionais e estrangeiros podem ser apresentados em língua
portuguesa, inglesa ou espanhola. Devem ser originais e
inéditos e destinar-se exclusivamente à REVISTA
BRASILEIRA DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS/ Brazilian
Journal of Pharmaceutical Sciences.
Escopo e política
Os manusc ritos submetidos à Revista, que atenderem as
"Instruções aos autores", são encaminhados ao Editor
Científico, que indicará dois revisores especialistas no tema
44
abordado (veja Relação dos Consultores - 2003 e gráfico 10).
Após a revisão, cujo caráter anônimo é mantido durante todo
o processo, os manusc ritos são enviados à Comissão de
Publicação, que decidirá sobre a publicação. Manuscritos
recusados, passíveis de reformulaç ão, poderão ser resubmetidos após reestruturaç ão, como novo trabalho,
iniciando outro processo de avaliação. Manuscritos
condicionados à reestruturação serão reavaliados pelos
revisores. Manuscritos enviados aos autores para revisão
devem retornar à Editoria dentro de, no máximo, dois meses,
caso contrário terão o processo encerrado.
Forma e preparação de manuscritos
Instruções para apresentação dos trabalhos
1. Estrutura dos originais
1.1. Cabeçalho: constituído por:
- Título do trabalho: deve ser breve e indicativo da exata
finalidade do trabalho.
- Autor(es) por extenso, indicando a(s) instituição(ões) a(s)
qual(is) pertence(m) mediante números. O autor para
correspondência deve ser identificado com asterisco,
fornecendo o endereço completo, incluindo o eletrônico. Estas
informaç ões devem constar em notas de rodapé.
1.2 Resumo (em português): deve apresentar a
condensação do conteúdo, expondo metodologia, resultados e
conclusões, não excedendo 200 palavras. Os membros da
Comissão poderão auxiliar autores que não são fluentes em
português.
1.3 Unitermos: devem representar o conteúdo do artigo,
evitando-se os de natureza genérica e observando o limite
máximo de 6(seis) unitermos.
1.4 Introdução: deve estabelecer com clareza o objetivo do
trabalho e sua relação com outros trabalhos no mesmo
campo. Extensas revisões de literatura devem ser
substituídas por referências aos trabalhos bibliográficos mais
recentes, onde tais revisões tenham sido apresentadas.
1.5 Material e Métodos: a descrição dos métodos usados
deve ser breve, porém suficientemente clara para possibilitar
a perfeita compreensão e repetição do trabalho. Processos e
Técnicas já publicados, a menos que tenham sido
extensamente modific ados, devem ser apenas referidos por
citação. Estudos em humanos devem fazer referência à
aprovação do Comitê de Ética correspondente.
45
1.6 Resultados e Discussão: deverão ser acompanhados de
tabelas e material ilustrativo adequado, devendo se restringir
ao significado dos dados obtidos e resultados alcançados. É
facultativa a apresentação desses itens em separado.
1.7 Conclusões: Quando pertinentes, devem ser
fundamentadas no texto.
1.8 Resumo em inglês (ABSTRACT): deve acompanhar o
conteúdo do resumo em português.
1.9 Unitermos em inglês: devem acompanhar os unitermos
em português.
1.10 Agradecimentos: devem constar de parágrafos, à
parte, antecedendo as referências bibliográficas.
1.11 Referências: devem ser organizadas de acordo com as
normas da ABNT NBR- 6023, ordenadas alfabeticamente no
fim do artigo incluindo os nomes de todos os autores.
A exatidão das referências é de responsabilidade dos autores.
2. Apresentação dos originais
Os trabalhos devem ser apresentados em lauda padrão (de
30 a 36 linhas com espaço duplo). Utilizar Programa Word for
Windows. Os autores devem encaminhar o trabalho
acompanhado de carta assinada pelo autor de
correspondência, que se responsabilizará pela transferência
dos direitos à RBCF.
3. Infomaç ões adicionais
3.1 Citação bibliográfica: As citações bibliográficas devem
ser apresentadas no texto pelo(s) nome(s) do(s) autor(es),
com apenas a inicial em maiúsc ulo e seguida do ano de
publicação. No caso de haver mais de três autores, citar o
primeiro e acrescentar a expressão et al. (em itálico)
3.2 Ilustrações: As ilustrações (gráficos, tabelas, fórmulas
químic as, equações, mapas, figuras, fotografias, etc) devem
ser incluídas no texto, o mais próximo possível das
respectivas citações. Mapas, figuras e fotografias devem ser,
também, apresentados em arquivos separados e reproduzidas
em alta resolução(800 dpi/bitmap para traços) com extensão
tif. e/ou bmp. No caso de não ser possível a entrega do
arquivo eletrônico das figuras, os originais devem ser
enviados em papel vegetal ou impressora a laser.
Ilustrações coloridas somente serão publicadas mediante
pagamento pelos autores.
As tabelas devem ser numeradas consecutivamente em
algarismos romanos e as figuras em algarismos arábicos,
46
seguidos do título. As palavras TABELA e FIGURA devem
aparecer em maiúsc ulas na apresentação no texto e na
citação com apenas a inicial em maiúsc ulo.
3.3 Nomenclatura: pesos, medidas, nomes de plantas,
animais e substâncias químic as devem estar de acordo com
as regras internacionais de nomenc latura. A grafia dos nomes
de fármac os deve seguir, no caso de artigos nacionais, as
Denominaç ões Comuns Brasileiras (DCB) em vigor, podendo
ser menc ionados uma vez (entre parênteses, com inicial
maiúsc ula) os registrados.
Envio de manuscritos
Os trabalhos devem ser remetidos por correio eletrônico, anexando à
mensagem os arquivos correspondentes.
E-mail: [email protected]
Secretaria de edição:
Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas/Brazilian Journal of
Pharmaceutical Sciences
Divisão de Biblioteca e Documentaç ão do Conjunto das Químicas/USP
Av. Prof. Lineu Prestes, 950
Caixa Postal 66083
05315-970 - São Paulo - SP - Brasil
Contato telefônico: Fone: (011) 3091.3804 FAX: (011) 3097.8627