UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
4ª Semana do Servidor e 5ª Semana Acadêmica
2008 – UFU 30 anos
FERMENTAÇÃO DO SORO DO LEITE POR ASPERGILLUS NIGER PARA
PRODUÇÃO ENZIMÁTICA
Izabela Cortes Cardoso1
Faculdade de Engenharia Química, Universidade Federal de Uberlândia. Av. João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K
[email protected]
Keila Cristiane Pereira1
[email protected]
Nathacha Kare Gonçalves Silva1
[email protected]
Raquel Chamone Barbosa1
[email protected]
Vicelma Luiz Cardoso2
[email protected]
Ubirajara Coutinho Filho2
[email protected]
Resumo: O soro de leite é uma matéria-prima abundante que, muitas vezes, é descartada no
ambiente gerando poluição e degradação. Essa poluição pode ser reduzida, ou mesmo eliminada,
utilizando-se o soro na geração de produtos que tenham valor de mercado. Neste sentido a
produção de enzimas surge como uma alternativa interessante, pois estas são de grande valor
agregado, por serem catalisadores biológicos que desempenham um papel importante, não apenas
para o metabolismo dos seres vivos, mas também para setores variados do mercado mundial,
dentre os quais o farmacêutico, o alimentício e o de tratamento de resíduos. Este trabalho tem por
objetivo analisar a utilização do soro de leite na síntese enzimática do fungo Aspergillus niger.
Para tanto foi avaliada a produção das enzimas celulase, lactase e sacarase na fermentação do
soro do leite por diferentes cepas do referido fungo. Os resultados obtidos sugerem que o A. niger
cresce adequadamente no soro de leite gerando quantidades apreciáveis de enzimas e massa
celular em quarenta e oito horas de fermentação.
Palavras-chave: Aspergillus niger, enzima, fermentação, soro do leite.
1. INTRODUÇÃO
Enzimas são catalisadores de natureza protéica que atuam em processos biológicos, podendo
acelerar a transformação de grande número de moléculas na unidade de tempo. Os valores
conhecidos indicam que essa transformação pode ser da ordem de 10.000 a 1.000.000 de moles de
substrato por minuto, por mol de enzima (Villela, Bacila e Tastaldi, 1978). As enzimas apresentam
maior eficiência que os catalisadores não enzimáticos, já que diminuem de modo sensível a energia
de ativação das reações das quais participam. Representam um papel importante para a produção de
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Acadêmicas do curso de Engenharia Química
Orientadores
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químicos finos, farmacêuticos, produtos biotecnológicos e alimentícios.
Uma forma viável de obtenção de enzimas é através da fermentação que, no sentido mais
amplo possível, pode ser definida como todo processo no qual microorganismos catalisam a
conversão de uma dada substância em um determinado produto (Borzani, Lima e Aquaroni, 1975).
O resultado da fermentação é que uma substância é quebrada em compostos mais simples. Em
alguns casos essa reação é usada para modificar um material cuja transformação seria difícil ou
muito cara se métodos químicos convencionais fossem escolhidos. A química das fermentações é
uma ciência nova que ainda está em suas fases iniciais. Consiste na base de processos industriais
que convertem matérias-primas como grãos, açúcares e subprodutos da indústria em produtos
sintéticos diferentes. Cepas cuidadosamente selecionadas de mofos, leveduras e bactérias são
largamente utilizadas.
Diversos microorganismos são capazes de sintetizar enzimas, dentre eles Aspergillus niger,
fungo de fácil obtenção e satisfatório poder aminolítico nas reações fermentativas (Araújo, 1979).
Além da ampla possibilidade de uso na produção de enzimas e biomoléculas, tal fungo também se
destaca no tratamento de resíduos. Um exemplo é a produção de lactase capaz de catalisar a
degradação de compostos fenólicos e aminas de efluentes da indústria têxtil. A enzima mencionada
é responsável pela quebra da lactose, o principal componente do soro conhecido como açúcar do
leite. A lactase é encontrada em animais, plantas, bactérias, fungos e leveduras, porém as mais
utilizadas são as originárias de leveduras e fungos.
Em termos ambientais esse processo é bastante interessante, pois resíduos que inicialmente
seriam descartados, podem ser transformados em produtos de alto valor agregado. Tal fato é
aplicável ao soro, um dos subprodutos da indústria de laticínios que tem sido freqüentemente
analisado, não só pelo grande volume gerado, mas principalmente, por sua carga poluidora, que
lançada em corpos receptores pode causar graves problemas ao ambiente. Aproximadamente 80%
do volume do leite destinado à fabricação de queijos é transformado em soro, o qual contém metade
do extrato seco do leite, representado por lactose, proteínas solúveis e sais (Paolucci, 1991).
Estima-se que somente no Estado de Minas Gerais 3,2 bilhões de litros de soro de leite
proveniente da produção de queijo são descartados anualmente no meio ambiente. O subproduto,
altamente poluente, lançado nos rios e, em pequena quantidade, destinado à alimentação de animais
equivale a 28 mil toneladas de proteína de alto valor biológico. O efeito poluidor do soro do leite é
tão considerável que o despejo de 250 mil litros de soro no ambiente equivale à poluição causada
por uma cidade de 50 mil habitantes. Nos países desenvolvidos o aproveitamento do soro chega até
a 100%. As importações brasileiras de soro em pó – produto usado pelas indústrias de bebidas
lácteas, panificação, biscoitos, fármacos e rações, principalmente na linha pet – equivalem a US$ 33
milhões anuais.
Procurando atender às legislações ambientais, algumas indústrias de laticínios
compreenderam ser preferível o aproveitamento do soro de leite através de algum método de
recuperação dos nutrientes ao seu tratamento puro e simples (Scott, 1986). Um exemplo disso é
através do soro, subproduto dos derivados do leite, que pode ser reaproveitado para a síntese de
enzimas ao invés de ser eliminado no ambiente, poluindo-o. Alguns países já encontraram um
destino economicamente viável para o soro do leite, que ocorre por meio da produção de álcool,
sendo que a Alemanha representa o país destaque para tal procedimento industrial.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Células de Aspergillus niger
Foram utilizadas seis cepas de Aspergillus niger mantidas por cultivo em ágar batata
dextrose nos laboratórios de Engenharia Bioquímica da Faculdade de Engenharia Química da
Universidade Federal de Uberlândia.
2.2. Meio de cultura, inóculo e meio fermentado
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Para o preparo do inóculo foram utilizados como meio de cultura uma solução de água de
batata e glicose 20g/L que, após o crescimento do fungo, foi transferida para o soro de leite na
proporção volumétrica de um volume de inóculo para cada dez volumes de meio. As fermentações
para avaliação da produção enzimática foram realizadas em reator do tipo orbital sob rotação de
120rpm por um tempo de 48 horas, e as fermentações para avaliação do crescimento celular foram
executadas nas mesmas condições para um tempo de fermentação de 96 horas. Ambos os meios
foram esterilizados em autoclave a 121°C, por vinte minutos, e o manuseio do fungo ocorreu na
capela de fluxo laminar. Mediu-se o pH dos meios fermentados através do pHmetro.
2.3. Atividade enzimática
A concentração de enzimas existentes no meio de cultura foi determinada pela formação de
açúcar redutor proveniente da hidrólise de soluções de carboximetilcelulose, lactose e sacarose,
preparadas na concentração de 1g/100mL, a qual foi determinada espectrofotometricamente pelo
método do DNS (Miller, 1959), com a absorbância das amostras lidas a 540 nm e expressas em
termos de unidade de atividade definida como a geração de um micromol de produto por minuto (1
U=1 µmol/min).
2.4. Crescimento celular
O crescimento celular foi avaliado em termos da concentração celular gerada pela massa
seca obtida por centrifugação de um volume determinado de meio fermentado (10 mL) a 3000 rpm,
seguido de secagem em estufa a 105oC até a obtenção de massa constante. A partir das
concentrações celulares e concentração de carboidratos ao fim do processo estes resultados foram
expressos em termos dos coeficientes estequiométricos associados ao crescimento celular expressos
pela Equação 1.
Yx/s = (X-Xo)/(So-S)
(1)
Xo e X são as concentrações celulares no início e fim do processo, respectivamente, So e S
são as concentrações de substrato no início e fim do processo.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Tabela 1 apresenta os valores de atividades das enzimas celulase (CMC), lactase (LAC) e
invertase (INV) e os coeficientes estequiométricos (Yx/s) associados ao crescimento celular das seis
cepas distintas utilizadas, obtidas após 48h de fermentação partindo-se de uma concentração de
inóculo de aproximadamente 3,5 g/L.
Tabela 1: Valores das atividades enzimáticas.
Cepa
CMC
LAC
INV
Yx/S (g/L)
A
192.328999
251.204419
233.088905
0.133637
B
311.589466
477.648344
462.552082
0.133637
C
189.309746
195.348251
193.838625
0.133637
D
181.761616
294.983578
204.406008
0.133637
E
225.540774
432.359559
319.137597
0.133637
F
408.205540
557.658530
512.369746
0.133637
3
As análises dos dados correspondentes ao final das quarenta e oito horas de fermentação e
dos resultados dos coeficientes estequiométricos das atividades enzimáticas sugerem que as
diferentes cepas do fungo cresceram de forma satisfatória nos meios de soro, produzindo as enzimas
anteriormente mencionadas em quantidades consideráveis.
A Tabela 2 mostra os valores de pH obtidos para cada cepa do fungo, o que evidencia a
diferença existente em seus metabolismos.
Tabela 2: Valores das medidas de pH.
Cepa
A
B
C
D
E
F
pH
4,74
5,11
3,35
3,90
3,22
5,11
Concentração (g/L)
A Figura 1 apresenta a concentração celular obtida ao longo de 96 horas de fermentação e
indica que as cepas do Aspergillus niger crescem satisfatoriamente no leite, sem que haja a
necessidade de suplementação de nutrientes no referido meio.
Tempo(h)
Figura 1: Concentração celular (g/L) por tempo (h)
4. CONCLUSÃO
4
O crescimento celular e a produção de enzimas de Aspergillus niger em soro de leite são
procedimentos cuja existência foi comprovada experimentalmente. Constituem, pois, em processos
bastante promissores e de grande interesse ambiental, ainda que sejam necessários ensaios
adicionais para melhor avaliação da cinética de crescimento celular.
5. NOMENCLATURA
Xo = concentração celular no início do processo;
X = concentração celular no final do processo;
So = concentração de substrato no início do processo;
S = concentração de substrato no final do processo;
Yx/s = fator estequiométrico de conversão de substrato em produto.
6. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à Universidade Federal de Uberlândia e à Faculdade de Engenharia
Química pela oportunidade de realização desse trabalho.
7. REFERÊNCIAS
Araújo, E. H de., 1979, “Contribuição para o estudo do cultivo de Aspergillus niger NRRL 337em
meio contendo farinha de mandioca como principal fonte de carbono: influência do pH e da
temperatura no cultivo realizado em fermentador”. Tese de Mestrado,UFU, Uberlândia, MG.
Borzani, W.; Lima, U. de A. e Aquaroni, E., 1975, “Engenharia Bioquímica”, Edgard Blücher Ltda,
Brasil, Vol. 3.
Miller, G. K., 1959, “Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar”,
Anal. Chem.,Vol. 31.
Paolucci, A. A .P., 1991, “Formulação de um meio de cultura a base de soro de queijo para
produção de lactococcus lactis sp Lactis”. Tese de Mestrado, UFV, Viçosa, MG.
Scott, R., 1986, “Whey. In: Cheesemaking Practice”. London: Elsevier Applied Science.
Villela, G.G; Bacila, M. e Tastaldi, H.,1978, “Bioquímica”, Guanabara Koogan, Brasil.
MILK WHEY FERMENTATION BY ASPERGILLUS NIGER TO ENZIME
PRODUCTION
Izabela Cortes Cardoso
Faculdade de Engenharia Química, Universidade Federal de Uberlândia. Av. João Naves de Ávila, 2121, Bloco 1K
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Keila Cristiane Pereira
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Nathacha Kare Gonçalves Silva
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Raquel Chamone Barbosa
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Vicelma Luiz Cardoso
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Ubirajara Coutinho Filho
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Abstract: The milk whey is a raw material that, many times, is threw away in the environment
providing pollution and degradation. This pollution can be reduced, or even though eliminated,
using the milk whey to produce materials that has a commercial value. In this meaning the enzymes
production appear like an interesting alternative, because they have a big global sales in biological
market as catalytic material where they develop an important function, not only to the living beings,
but also to the vary sectors of the world market like pharmaceutical, food production and waste
treatment. This work has the objective to analyze the use of the whey milk in the enzymatic
production Aspergillus niger enzymes. For that it was evaluated the enzymes production of
cellulase, lactase e sucrase in the milk whey fermentation in the different strains of the mentioned
fungi. The obtained results suggest that A. niger grows adequately in the milk whey producing
considerable quantities of enzymes and cell mass in forty eight hours fermentations.
Keywords: Aspergillus niger, enzime, fermentation, milk whey.
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