1. Identificação da Proposta
Título do Projeto
Coordenador do Projeto
Instituição Executora
Instituição Colaboradora
Edital
Temas
Polissacarídeos de plantas da Caatinga: avaliação do potencial
anti-inflamatório e antinociceptivo
Prof. Dr. Draulio Costa da Silva
E-mail: [email protected]
Telefone: (87) 8853 4448
Universidade Federal Vale do São Francisco – UNIVASF
Universidade Federal do Ceará – UFC
Universidade Federal do Piauí - UFPI
Edital Facepe 15/2012 - Auxílio a Projetos de Pesquisa
Apq – Facepe
Propriedades farmacológicas de polissacarídeos vegetais;
Química de macromoléculas
RESUMO
O presente projeto visa contribuir com o conhecimento sobre o potencial farmacológico de
polissacarídeos pécticos isolados de frutos e sementes de plantas medicinais do Bioma Caatinga, um
bioma exclusivamente brasileiro e pouco estudado quanto a suas características de fauna e flora.
Considerando os aspectos e potencialidades terapêuticas de plantas nativas dessa região e a pequena
atenção que vem sendo dada aos seus polissacarídeos constituintes, busca-se investigar
inicialmente, as propriedades farmacológicas de duas espécies medicinais, Amburana cearensis
(Allemão) A.C. Sm (Fabaceae) e Caesalpinia férrea Mart. (Caesalpiniaceae), do ponto de vista dos
efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo de seus polissacarídeos de parede celular, além de
conhecer os principais aspectos químicos e estruturais dessas macromoléulas.
Palavras-chave:
antinociceptivo.
Polissacarídeos
vegetais,
pectinas,
efeito
anti-inflamatório,
efeito
2. Qualificação do principal problema a ser abordado
Durante eras as plantas têm fornecido ao homem uma ampla lista de itens que suprem as
suas necessidades mais básicas como a alimentação e combustível. Mais do que isso, os vegetais
têm formado a base de um sofisticado sistema medicinal, com uma grande variedade de
propriedades terapêuticas muitas vezes fortalecidas pelo conhecimento empírico ao longo do tempo.
Esse interesse vem sendo elaborado nas últimas décadas na forma de um processo contínuo de
procura e desenvolvimento de novos medicamentos sustentado pela credibilidade que a ciência tem
oferecido às novas drogas derivadas desses elementos naturais, a partir da constatação experimental
da pesquisa científica baseada nas observações, informações e costumes populares (HANDAM;
AFIFI, 2004; FABRICANT; FARNSWORTH 2001).
As plantas são fontes importantes de novas drogas com potencial efeito terapêutico.
Diversas novas moléculas com atividades biológicas interessantes derivadas de plantas medicinais
já foram identificadas (AMANLOU et al, 2005). São muitos os relatos de atividades farmacológicas
de extratos e frações de diferentes órgãos vegetais com registros na literatura científica e com uso
na medicina popular. As plantas têm se tornado fontes importantes de novas drogas de potencial
efeito analgésico com efeitos comparáveis aos da morfina (AMANLOU, et al, 2005). Metabólitos
secundários de plantas têm auxiliado no entendimento dos mecanismos e processos de transmissão
e tratamento da dor, uma vez que permitem caracterizar tipos de receptores e identificar os ligantes
envolvidos no mecanismo de nocicepção, e oferecem alternativas para diversos tratamentos de
desordens incluindo as de origem neuropática e neurogênica (CALIXTO et al, 2000; 2001). Sob
outro aspecto, um elevado número de componentes identificados e isolados de plantas
demonstraram efeito anti-inflamatório significativo e tem sido separados em grupos de acordo com
seus efeitos farmacológicos, o mecanismo de ação e outras propriedades importantes (SOUZA et al,
2011; PEREZ, 2001).
O Brasil apresenta uma das maiores biodiversidades de vegetais do planeta, e pelo
menos a metade das espécies pode possuir alguma propriedade terapêutica útil à população
(MATOS, 1994). A Caatinga é o bioma menos estudado do Brasil e um tipo vegetacional semiárido único, ocorrendo quase que exclusivamente na região Nordeste do país (ALBUQUERQUE;
ANDRADE, 2002). Estudos têm enfatizado o potencial bioativo e os benefícios terapêuticos de
plantas medicinais da Caatinga, como demonstrado na revisão de Silva et al (2012), corroborando
com o conhecimento e o uso popular.
Contudo, dentre esses estudos, há poucos relatos sobre carboidratos derivados de
plantas. A maioria enfatiza a ação terapêutica de compostos secundários derivados dos vegetais. Por
outro lado, é importante considerar o potencial terapêutico de polissacarídeos de plantas,
principalmente os de natureza péctica, os quais têm se revelado possuidores de uma variedade de
propriedades biológicas com interesse farmacológico. As pectinas compõem um grupo de
heteropolissacarídeos complexos e dotados de diferentes propriedades terapêuticas protegendo
contra doenças cardiovasculares, obesidade, diabetes e câncer (SILVA et al, 2011; JANEBRO et al,
2010; LYON, REICHERT, 2010; MELLO, LAAKSONEN, 2009; PROSKI, 2000; DANSB, 1998;
CHAU, HUANG, 2005). Além disso, são dotadas de atividade imunomoduladora via ativação do
sistema complemento, com ativação e indução de quimiotaxia de linfócitos que iniciam uma série
de eventos por parte das células imunológicas (LEUNG et al, 2006).
Polissacarídeos imunomoduladores possuem origens variadas, e podem ser encontrados
em bactérias, fungos, algas e plantas (LEUNG et al, 2006). De acordo com a composição, existem
três grandes grupos de polissacarídeos modificadores da resposta biológicas: β-(1→3)-D-glucanos,
α/β-(1→4)-mananos e os heteropolissacarídeos com alto grau de ramificação (LIU et al, 2006). Os
polissacarídeos de composição heterogênea são caracteristicamente derivados de pectinas de plantas
(GUO et al, 2000; YANEVA et al, 2002; EBRINGEROVA et al, 2003).
Pectinas são polissacarídeos com alto grau de solubilidade em água, ricos em ácido
galacturônico o que lhes confere um caráter ácido (LEUNG et al, 2006), desse modo, o conteúdo de
ácido urônico ou glucurônico pode ser usado como parâmetro para caracterização dessa classe de
molécula. São considerados polissacarídeos formados de hidrocolóides com ocorrência natural em
plantas superiores, sendo muito usadas na indústria de alimentos devido a sua capacidade de formar
géis e atuarem como estabilizante e emulsificante (WINNING et al, 2007). Na célula, as pectinas
estão relacionadas com proteção e com a manutenção do meio iônico, modificando a difusão de
íons pela parede celular e regulando sua porosidade (BUCKERIDGE, TINÉ, 2000).
Quimicamente, as pectinas são misturas de polissacarídeos complexos com a
predominância de homogalacturonanas que são polímeros lineares com unidades repetidas de ácido
galacturônico unidas por ligações glicosídicas α-(1→4), formando longas cadeias (CAPEL et al,
2006), nas quais grupos ácidos podem estar metil-esterificados ou O-acetiladas em C-2 e C-3.
Ramnogalacturonanas constituem a região ramificada das pectinas sendo divididas em dois tipos:
ramnogalacturonanas I (RG-I) e ramnogalacturonanas II (RG-II). RG-I consiste de uma cadeia
principal de unidades alternantes de ácido D-galacturônico ligadas por ligações glicosídicas α(1→4), e ramnose ligadas por α-(1→2), a qual se ligam cadeias laterais neutras tais como
arabinanas e arabinogalactanas (De VRIES, 1988). RG-II é o menor e mais complexo
polissacarídeo péctico das paredes celulares vegetais (VIDAL et al, 2000). Contém uma alta
proporção de unidades de ramnose ligadas (1→3) e (1→2,3,4) como unidades terminais
(VORAGEN et al, 1995).
As arabinanas são polissacarídeos que apresentam uma cadeia principal de unidades
furanosídicas de L-arabinose unidas por ligações glicosídicas α-(1→5), com ramificações ligadas a
várias unidades da cadeia principal na posição O-2 e/ou O-3 (PÉREZ, MAZEAU; Du PENHOAT,
2000).
As arabinogalactanas ocorrem em duas formas estruturalmente diferentes. As
arabinogalactanas do tipo I têm uma cadeia linear de unidades piranosídicas de D-galactose ligadas
β-(1→4) com 20-40% de unidades furanosídicas de L-arabinose ligadas α-(1→5) presentes em
cadeias laterais curtas conectadas na posição O-3 das unidades de galactose (PÉREZ et al, 2000;
VORAGEN et al, 1995). Já as arabinogalactanas do tipo II são polissacarídeos altamente
ramificados, com cadeias de unidades de β-D-galactopiranose unidas por ligações (1→3) e (1→6).
As ligações (1→3) predominam nas cadeias internas, enquanto que as ligações (1→6) ocorrem
principalmente nas cadeias externas, que são geralmente terminadas por unidades Larabinofuranosil e em algum grau por unidades L-arabinopiranosil (VORAGEN et al, 1995).
Essas moléculas são consideradas farmacologicamente ativas uma vez que modificam a
resposta biológica, inclusive melhorando a resposta imune (LEUNG et al, 2006), com efeitos
moduladores in vivo e in vitro (SILVA et al, 2012; PAULSEN, 2001; INNGJERDINGEN et al,
2005).
Uma vez agentes imunomoduladores e ativadores celulares os polissacarídeos pécticos
são capazes de auxiliar as reações de defesa imunológica, bem como, as respostas inflamatórias
(SILVA et al, 2011; 2012). A inflamação aguda é considerada um fenômeno fisiológico do corpo
aliado às componentes do processo imunológico, frente à invasão de algum agente estranho nocivo.
Pode ainda, ser desencadeada a partir de outros fatores, dentre os quais, lesões causadas por
substâncias químicas, ou fatores de caráter físico, como luz ultravioleta e calor, por exemplo. Em
outras palavras, trata-se de uma resposta natural de defesa, embora possam ocorrer casos em que a
resposta inflamatória se manifesta contra elementos inócuos, ou mesmo, contra os próprios tecidos
do corpo, como em doenças auto-imunes. Nesse caso, faz-se uso de agentes anti-inflamatórios ou
imunossupressores (RANG et al, 2004).
Apesar do recente progresso no desenvolvimento de novas drogas com fins
terapêuticos, ainda existe uma busca intensa por anti-inflamatórios potentes e com menores efeitos
colaterais. Nesse aspecto, os polissacarídeos de plantas representam uma boa alternativa como
novos agentes anti-inflamatórios, como demonstrado por Popov et al, (2007), aliado ao fato de que
nos vegetais a maioria dos polissacarídeos encontrados é relativamente não tóxica e apresenta
poucos efeitos colaterais, que é o maior problema associado a polissacarídeos imunomoduladores
bacterianos e compostos sintéticos (OVODOV, 1998; SHERENESHEVA et al, 1998).
Tais efeitos podem estar relacionados à ação imunomoduladora das pectinas (SILVA et
al, 2011; LEUNG et al, 2006), embora seu mecanismo ainda seja desconhecido (YE; LIM, 2010).
Um estudo sobre o efeito da pectina de Citrus na produção de citocinas por macrófagos humanos
mostrou a propriedade do polissacarídeo em inibir a secreção de interleucinas (IL-1 e IL-06)
(SALMAN et al, 2008).
Recentemente, mostrou-se que algumas pectinas são capazes de reduzir a secreção de
interleucinas pró-inflamatórias e também de TNF-alfa regulando a resposta inflamatória por
moderar a produção de citocinas e imunoglobulinas (YE; LIM, 2010), além de diminuírem a
atividade da enzima mieloperoxidase (SILVA et al, 2011) o que sugere a propriedade de inibição do
influxo celular como a migração de neutrófilos para o sítio de inflamação (FRODE, MEDEIROS,
2001). Há evidências que mediadores pró-inflamatórios como o próprio TNF-alfa e algumas
interleucinas ajudam a aumentar a extensão do local ou o processo inflamatório sistêmico
(MIZGERD et al, 2001).
Considerando os estudos sobre o potencial terapêutico de compostos isolados de
plantas, algumas espécies podem ser mencionadas a partir de trabalhos etnobotânicos, como o
desenvolvido por Gomes et al (2007) no Vale do São Francisco, com plantas medicinais
comercializadas em feiras livres na região do Pólo Petrolina-Juazeiro. Dentre as espécies
amostradas, Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. (umburana de cheiro) e Caesalpinia ferrea
(pau-ferro) foram encontradas em diversas feiras livres, e são espécies nativas consideradas de alto
potencial medicinal (GOMES et al, 2007), sendo a espécie A. cearensis (Allemão) A.C. Sm. bem
relatada em diversos estudos quanto ao efeito anti-inflamatório e antinociceptivo de diferentes
compostos secundários (OLIVEIRA et al, 2009; SILVA et al, 2012).
Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. (Fabaceae) é uma árvore que pode atingir até
9 metros de altura, apresenta casca do tronco lisa, folhas alternas e pequenas flores. Os frutos são
uma cápsula globosa com 1,5 cm de diâmetro liberando uma única semente rígida. Pela fenologia
desta espécie, seus frutos amadurecem 4-5 meses após o início da estação chuvosa (março-maio)
(MAIA, 2004). Essa planta é usada popularmente no tratamento de problemas respiratórios e como
expectorante, sendo as sementes usadas contra inflamações e dores reumáticas (ALBUQUERQUE
et al, 2010). Demonstrou-se que a casca e as sementes de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm. são
dotadas de efeitos anti-inflamatório, antitussivo e antiespasmódico (BRAGA, 1976; CORREA,
1984). Lotufo et al (2003) comprovaram a ação anti-inflamatória de IKPF, um flavonóide isolado
da casca dessa planta, frente ao TNF-alfa, além de efeito antitumoral in vitro. A ação antiinflamatória de IKPF também foi demonstrada em ratos por Leal et al (2009), além de outros
compostos secundários obtidos da casca de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm. com efeito antiinflamatório in vivo sendo capazes de inibir a migração de leucócitos e neutrófilos para a cavidade
peritoneal de ratos sob indução de diferentes agentes flogísticos como carragenina, serotonina,
histamina e N-formilmetil-leucil-fenilalanina (LEAL et al, 2003). Também foi demonstrado o
potencial antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico da casca de A. cearensis
(Allemão) A.C. Sm. in vivo (OLIVEIRA et al, 2009; LEAL et al, 2011). Contudo, há uma escassez
de trabalhos que tratem de possíveis efeitos anti-inflamatório e antinociceptivo dos polissacarídeos
de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm.
A espécie Caesalpinia férrea Mart. (Caesalpiniaceae) é uma planta de porte arbóreo, de
frutos indeiscentes com elevada quantidade de sementes, que ocorre do Ceará à Bahia. Sua floração
acontece na época chuvosa e no período de transição chuvosa-seca, seguida pela produção dos
frutos (MAIA, 2004). Essa espécie tem sido ainda pouco relatada por suas propriedades medicinais,
contudo há registros de uso popular da entrecasca, frutos e raízes para o tratamento de diabetes e
como agente cicatrizante, antidiarréico e antitérmico (MAIA, 2004). Recentemente, demonstrou-se
que os polissacarídeos extraídos dos frutos de C. ferrea Mart. possuem ação anti-inflamatória em
ratos contra diferentes agentes flogísticos de natureza osmótica e celular, também relacionada à
imunomodulação, e que a atividade detectada possa estar ligada ao conteúdo de ácido urônico do
polissacarídeo isolado (PEREIRA et al, 2012).
Assim, mesmo considerando os polissacarídeos de plantas como agentes potencialmente
terapêuticos, seu estudo para essa aplicabilidade, em relação a alguns aspectos, como a atividade
anti-inflamatória, por exemplo, ainda é modesto (PEREIRA, 2011), ao se comparar com os
registros de outros compostos primários e secundários originados de vegetais.
Diante do exposto, é interessante investir nos estudos de aplicação de polissacarídeos
vegetais na busca de novas drogas anti-inflamatórias e antinociceptivas, sobretudo de espécies
comumente utilizadas na medicina popular.
Desse modo, e considerando as propriedades anti-inflamatórias para as espécies de
plantas medicinais aqui descritas, bem como, as diversas propriedades biológicas de interesse
terapêutico dos polissacarídeos vegetais, o presente projeto traz como proposta um estudo dos
aspectos químicos e das ações anti-inflamatória e antinociceptiva de amostras de polissacarídeos
obtidos das espécies Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. e Caesalpinia férrea Mart. de
maneira a evidenciar suas potencialidades farmacológicas, bem como proporcionar um melhor
conhecimento dos mecanismos de ação estudados por Pereira et al, (2012) em relação aos
polissacarídeos de C. férrea Mart., através da utilização de outros modelos de inflamação, de
maneira a melhor compreender o modo de ação dessas moléculas.
3. Objetivos e metas
3.1. Objetivo Geral
Avaliar os aspectos químicos e o potencial bioativo em relação aos efeitos anti-inflamatório e
antinociceptivo dos polissacarídeos isolados de frutos e/ou sementes das espécies vegetais da
Caatinga Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm. e Caesalpinia ferrea Mart. in vivo e in
vitro.
3.2. Objetivos específicos
Isolar os polissacarídeos dos frutos e/ou sementes das espécies vegetais A. cearensis
(Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.;
Caracterizar quimicamente as amostras de polissacarídeos obtidas através da determinação do
teor de carboidratos, ácido urônico e proteínas solúveis;
Realizar fracionamento das amostras obtidas através de cromatografia em coluna de troca
iônica;
Estimar a massa molar das amostras de polissacarídeos isolados por meio de cromatografia de
exclusão molecular;
Caracterizar estruturalmente os polissacarídeos isolados através de métodos espectroscópicos
(Espectrofotometria na Região do Infravermelho - FT-IR; Ressonância Magnética NuclearRMN);
Avaliar o efeito antinociceptivo dos polissacarídeos isolados através dos modelos de
contorções abdominais induzidas por ácido acético (writhing test), teste da placa quente (hotplate test) e teste da formalina;
Avaliar o efeito anti-inflamatório dos polissacarídeos isolados através dos modelos de edema
de pata induzido por agentes flogísticos de natureza osmótica e celular;
Avaliar o efeito anti-inflamatório dos polissacarídeos isolados através dos modelos de
inflamação in vivo e in vitro: efeito sobre a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal
induzida por agente quimiotático indireto (Cf) e direto (fMLP); Dosagem de citocinas; Ensaio
para mieloperoxidase (MPO);
Avaliar a ação dos polissacarídeos sobre parâmetros macroscópicos, microscópicos e peso
úmido em animais com colite por ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS).
Verificar a ação dos polissacarídeos sobre a atividade da MPO no colón de animais com colite
por TNBS.
Verificar a influência do polissacarídeo sobre a produção de citocina IL-1β e TNF-α no cólon
de animais com colite induzida por TNBS.
Verificar a influência dos polissacarídeos extraídos sobre a atividade de malondialdeido
(MDA) e glutationa reduzida (GSH) no colón de animais com colite por TNBS.
3.3. Metas
Determinação de métodos de extração e fracionamento dos polissacarídeos de frutos e/ou
sementes da espécie Amburana cearensis (Allemão) A.C. Sm;
Obtenção dos polissacarídeos dos frutos e/ou sementes da espécie Amburana cearensis
(Allemão) A.C. Sm;
Obtenção dos polissacarídeos dos frutos e/ou sementes da espécie Caesalpinia ferrea Mart.;
Determinação das características químicas das amostras de polissacarídeos isolados das
espécies A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.
Aplicação dos polissacarídeos isolados em modelos de estudo de atividade antinociceptiva e
anti-inflamatória in vivo e in vitro;
Contribuir para o melhor entendimento do efeito anti-inflamatório dos polissacarídeos de C.
ferrea Mart. demonstrado por Pereira et al (2012), usando diferentes modelos de inflamação;
Contribuir para o estudo de potencialidades terapêuticas de polissacarídeos de plantas
medicinais nativas da Caatinga.
4. Metodologia
4.1. Material vegetal
Os frutos das espécies A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart. serão
coletados no município de Petrolina-PE e áreas próximas. O material coletado será devidamente
identificado a nível de espécie e suas exsicatas confeccionadas serão depositadas em herbários
vinculados à instituições de ensino e pesquisa das Universidades Federal do Vale do São Francisco
(UNIVASF) e Federal do Ceará (UFC).
4.2. Animais
Ratos Wistar pesando entre 150 e 250 g e camundongos Swiss (20-25 g) provenientes
do Biotério Central da UNIVASF e da Universidade Federal do Piauí (UFPI) serão mantidos em
condições adequadas de luz e temperatura, recebendo água e ração ad libitum até a realização dos
experimentos. Todos os tratamentos e procedimentos cirúrgicos serão realizados de acordo com o
guia de cuidado em uso de animais de laboratório do National Institutes of Health (Bethesda, MD,
USA). Os protocolos utilizados nos trabalhos serão executados de acordo com os padrões éticos
estabelecidos pelos Comitês de Ética das referidas Universidades. O presente projeto foi
apresentado ao órgão CEUA (Comissão de Ética em Uso de Animais) que apresentará seu parecer
em reunião ordinária que ocorrerá em outubro de 2012, cujo documento de comprovação de
submissão consta no Anexo I.
4.3. Extração dos polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.
4.3.1 Extração dos polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm
As vagens e sementes serão estudadas separadamente. O material será lavado com água
destilada e seco em estufa à 40 ºC. Protocolos de extração dos polissacarídeos dos frutos serão
testados de acordo com o proposto por Yapo e Kofi (2006) com algumas modificações. As amostras
serão trituradas em moinho analítico para obtenção de um pó, o qual será suspenso em metanol
absoluto (1:50, p/v), homogeneizado (76 ºC, 2 h) e filtrado em funil de placa sinterizada G3. O
resíduo será lavado com solução etanólica (etanol 80%) e acetona sucessivamente, até total
clarificação. Em seguida, será seco em estufa a 40 ºC e denominado sólidos insolúveis em álcool
(SIA).
Partindo do material obtido (SIA), serão realizadas extrações em água a 30 ºC e
acidificada a pH 4,0 com ácido nítrico 1M. Após etapas de filtração e centrifugação (3000 g/ 20
min, a 20 ºC), o material será mantido em contato com etanol absoluto (4 volumes) a 4 ºC por 24 h
para precipitação de pectinas presentes na solução. Após diálise e nova centrifugação, o material
será liofilizado e denominado pectina extraída em água (PEA). Procedimentos de extração em
ácidos diluídos poderão também ser empregados.
A extração dos polissacarídeos das sementes de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm será
conduzida de acordo com o método estabelecido por Pereira et al (2012). O tegumento será retirado
e triturado. O pó obtido será mantido em contato com metanol absoluto (1:50, p/v), homogeneizado
(76 ºC, 2 h) e filtrado em funil de placa sinterizada G4. A porção insolúvel será suspensa na mesma
proporção (1:50, p/v) em NaOH 0,1 M (97 °C, 2 h) e centrifugada (3000 x g, 15 min, 25 °C). O
sobrenadante alcalino será neutralizado com HCl 1 M, precipitado com quatro volumes de etanol
absoluto e centrifugado (3000 x g, 15 min, 25 °C). O precipitado será dialisado contra água
destilada, novamente centrifugado e o sobrenadante final, liofilizado e denominado Polissacarídeos
Totais (PLT).
4.3.2 Extração dos polissacarídeos de C. ferrea Mart.
A extração dos polissacarídeos das sementes de C. ferrea Mart. será conduzida como
apresentado no ítem 4.3.1 para as sementes de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm de acordo com
Pereira et al (2012).
4.3.3 Fracionamento dos polissacarídeos em cromatografia de troca iônica
Os PLT de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm C. ferrea Mart. serão dissolvidos em água
destilada (1:2, p/v) e aplicados em coluna cromatográfica de troca iônica previamente equilibrada
com água destilada. A eluição (60 mL/h) ocorrerá com concentrações crescentes de NaCl (0,1; 0,25;
0,5; 0,75; 1,0 e 1,25 M) para liberação dos polissacarídeos ácidos. As frações majoritárias serão
dialisadas, liofilizadas e utilizadas nas analises químicas.
4.3.4 Análises químicas dos PLT e das frações polissacarídicas de A. cearensis (Allemão)
A.C. Sm e C. ferrea Mart.
Determinação de carboidratos totais:
O teor de açúcar total será avaliado pelo método do fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS et
al, 1956) em espectrofotômetro a 490 nm. A concentração de carboidratos totais será estimada em
relação a uma curva padrão de D-galactose;
Determinação de ácido urônico:
O conteúdo de acido urônico será determinado pelo método de Blumenkrantz e AsboeHansen (1973) em espectrofotômetro a 520 nm. A concentração de acido urônico será estimada em
relação a uma curva padrão de ácido D-galacturônico;
Dosagem de proteínas:
A quantidade de proteínas será mensurada pelo método de Bradford (1976) em
espectrofotômetro a 595 nm. A concentração de proteínas será estimada em relação a uma curva
padrão de albumina sérica bovina (BSA).
4.3.5 Métodos espectroscópicos das amostras polissacarídicas obtidas
Cromatografia de Exclusão Molecular de Alta Performance (HPSEC):
O pico de massa molar das amostras será determinado por HPSEC usando cromatógrafo
Shimadzu LC-10AD com detectores de índice de refração (RID-6A) e ultravioleta (SPD-10AV;
ƛ=280 nm). A análise será realizada utilizando-se coluna Ultrahidrogel (7,8 x 300 mm), com fluxo
de 0,5 mL/min, solução de polissacarídeo de concentração 0,1% (p/v), água como solvente, NaNO3
0,1 M como eluente e temperatura ambiente. O volume injetado de amostra será de 50 µl. A massa
molar do polissacarídeo será estimada usando pululanas como padrão.
Espectroscopia na Região do Infravermelho (FT-IR):
Os espectros FT-IR serão realizados com pastilhas KBr em espectrofotômetro FT-IR
Shimadzu 8300, com resolução de 2 cm-1.
Ressonância Magnética Nuclear (RMN):
Espectros 1D (1H e
13
C) de soluções de polissacarídeos a 3% (p/v) em D2O a 343 K
serão realizados em espectrômetro BRUKER, modelo AVANCE-DRX-500. 2,2-dimetilsilapentano5-sulfonato de sódio (DSS) será usado como padrão interno (0.00 ppm para 1H).
4.4. Testes de atividade biológica
4.4.1 Testes de atividade antinociceptiva:
Teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético (Writhing test):
Esse teste será conduzido de acordo com a metodologia de Koster et al (1959). As
soluções de polissacarídeos e respectivos controles serão administrados aos camundongos 30 min
(via intraperitoneal) ou 60 min (via oral) antes do início dos experimentos. Água destilada será
usada como controle negativo (0,1 mL/10g) e ácido acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo) ou
diclofenaco (25-50 mg/kg, via oral) como padrões positivos. Após o período pré-determinado os
animais receberão injeção intraperitoneal de ácido acético (0,6%, 0,1 mL/10g). Serão mantidos em
recipiente para observação e contagem do número de contorções abdominais (writhing) por um
período de 20 min após o qual se avaliará o possível efeito antinociceptivo.
Teste da placa quente (Hot-plate test):
A metodologia seguirá o protocolo de Woolfe e MacDonald (1944). Camundongos
Swiss (20-25 g) serão selecionados para avaliação de suas reações ao estímulo termal (salto ou
lambedura das patas quando a temperatura da placa atingir os 55 ºC). O tempo de latência ao
estímulo nos animais será registrado imediatamente antes e 30, 60, 90 e 120 min. após a
administração das soluções de polissacarídeos e controles positivo e negativo por um período
máximo de 40 s. de modo a evitar lesões nas patas dos animais. Água destilada será usada como
controle negativo (0,1 mL/10g) e ácido acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo) ou diclofenaco (2550 mg/kg, via oral) como padrões positivos.
Teste da formalina:
Esse teste será realizado segundo o método descrito por Dubuisson e Dennis (1977) e
modificado por Hunskaar et al (1985). Os animais serão tratados com as soluções de
polissacarídeos e respectivos controles 30 min (via intraperitoneal) ou 60 min (via oral) antes do
início dos experimentos. Água destilada será usada como controle negativo (0,1 mL/10g) e ácido
acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo) ou diclofenaco (25-50 mg/kg, via oral) como padrões
positivos. Cada camundongo será submetido a uma injeção subplantar de 40 µL de formalina 1%
(v/v), na pata traseira direita. O tempo gasto pelo animal lambendo a pata será registrado durante
dois períodos após a injeção de formalina: 0-5 minutos (fase inicial ou primeira fase) e de 20-25
min (fase tardia ou segunda fase). O teste será realizado à temperatura de 25 °C na ausência de
fatores estressantes, como sons, odores e alta luminosidade.
4.4.2 Testes de atividade antiedematogênica e anti-inflamatória:
Modelo de edema de pata
O modelo de edema de pata será realizado segundo o método descrito por Winter et al
(1962). As patas direitas traseiras dos animais terão seus volumes medidos (mL) por meio de
pletismógrafo. Os animais serão tratados por via oral (v.o) ou intraperitoneal (i.p) com as soluções
de polissacarídeos ou volumes de 10 mL/kg de água destilada nos grupos controle negativo,
enquanto o grupo controle positivo será tratado com ácido acetilsalicílico (200 mg/kg, subcutâneo)
ou diclofenaco (25-50 mg/kg, v.o). Sessenta minutos após administração, os animais receberão uma
injeção subcutânea (s.c.) intraplantar (0,1 mL/pata) de diferentes agentes flogísticos e o volume das
patas mensurado por pletismometria imediatamente antes (tempo zero) e 30, 60, 120, 180, 240 e
300 min após o estimulo, sendo calculado como a diferença entre o volume (mL) deslocado pelas
patas nos tempos determinados após o estimulo (VF) e antes do estimulo (V0). No caso dos agentes
inflamatórios carragenina (Cg) e dextrano (Dx), amostras de tecidos das patas serão retiradas para
dosagem de atividade da enzima mieloperoxidase (MPO).
Ensaio para mieloperoxidase (MPO):
Mieloperoxidase é uma enzima presente predominantemente nos grânulos azurófilos
dos neutrófilos e tem sido utilizada como um marcador quantitativo da infiltração de neutrófilos nos
processos inflamatórios em vários tecidos, entre eles o trato gastrintestinal. Para realização do
experimento, 50 a 100 mg de tecido subplantar dos animais tratados com os polissacarídeos, serão
colocados num tampão de potássio com 0,5% de brometo de hexadecitrimetilamônio (pH 6,0; 50
mg de tecido por mL) e posteriormente homogeneizados num Politron. A seguir, o homegenato será
centrifugado a 14000 rpm por 2 minutos. A atividade da MPO por mg de tecido será aferida através
da técnica descrita por Bradley et al (1982), utilizando 0,0005% de peróxido de nitrogênio como
substrato para a MPO. A unidade da atividade de MPO será definida como aquela capaz de
converter 1 mmol de peróxido de nitrogênio em água em 1 minuto.
Avaliação do efeito dos polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea
Mart. sobre a migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal induzida por agente
quimiotático indireto (Cf) e direto (fMLP)
Os animais tratados com as soluções de polissacarídeos e controles positivo e negativo
receberão inicialmente os polissacarídeos (1, 3, 10 e 30 mg/kg) por via intraperitoneal. Após 1 h, os
estímulos inflamatórios carragenina (300 µg/cavidade) e fMLP (300 nmol/cavidade), dissolvidos
em 1 mL de salina estéril, serão administrados. Após 4 horas, será avaliada a migração de
neutrófilos. Para tanto, os animais serão sacrificados por deslocamento cervical e as células
presentes na cavidade peritoneal serão coletadas através da lavagem desta utilizando 5 mL de salina
contendo 5 Ul/mL de heparina. Os abdomens dos animais serão levemente massageados, e através
de uma incisão serão coletados cerca de 3 mL de fluido peritoneal.
As contagens total e diferencial dos leucócitos serão realizadas conforme metodologia
descrita previamente por Souza e Ferreira (1985). Neste procedimento, 20 µL do fluido coletado de
cada animal serão diluídos em 380 µL do reagente de Turk e posteriormente usados para a
contagem total de leucócitos em câmara de Neubauer. A contagem diferencial das células será
realizada através de esfregaços corados em lâminas. Para tanto, 50 µL do exsudato será
centrifugado em citocentrífuga a 400 x g, durante 10 minutos, e após este processo os esfregaços
serão corados pelo método de hematoxilina-eosina (HE) e as células contadas através de
microscopia óptica, sendo os resultados expressos como a média ± E.P.M. do número de células x
103/mL de fluido peritoneal. Parte do fluido peritoneal será utilizado para posterior dosagem de
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e IL-1β).
Dosagem de citocinas:
As concentrações de TNF-α e IL-1β serão medidos do fluido peritoneal dos animais
usando a técnica de ELISA como descrito por Souza et al (2001). Segmentos da mucosa gástrica
serão obtidos e estocados em tampão para citocinas contendo anti-proteases em freezer -70 ºC. Os
tecidos serão homogeneizados com PBS, contendo anti-proteases. A amostra será centrifugada por
10 min em 3000 x g e o sobrenadante será imediatamente usado pelo ensaio de ELISA com
anticorpos específicos para interleucinas.
Modelo de doença de Crohn induzido por ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e da colite
induzida por etanol a 50% em ratos.
Inicialmente, os animais passarão por um processo de preparação do cólon.
Permanecerão 16 a 18 hrs recebendo somente água ad libitum. Posteriormente, serão submetidos à
limpeza do cólon por enema com 20 mL de solução salina a 0,9%, 1 hora antes do procedimento.
As colites serão induzidas pela administração de TNBS (20%, 20 mg diluídas em álcool a 50%,
num volume de 0,8 ml), que simula experimentalmente a doença de Crohn, ou etanol (50%, num
volume de 0,4 mL), via transanal. O grupo controle receberá apenas salina (0,9%, num volume de
0,4 mL). Para a indução das colites ou não, os animais serão previamente anestesiados e
posicionados em decúbito lateral esquerdo. Onde será introduzido, por via retal, um catéter de
polietileno nº 6 até 8 cm da margem anal para a injeção das soluções. O animal permanecerá
suspenso pela cauda, de cabeça pra baixo, por 30 seg. para evitar o retorno da solução.
Tratamentos dos animais com as frações polissacarídicas de A. cearensis (Allemão) A.C.
Sm e C. ferrea Mart.
Os ratos com colite induzida por etanol ou TNBS serão pré e pós-tratados durante três
dias com as soluções de polissacarídeos nas dosagens de 30, 60 e 90 mg/kg. Ao final do terceiro dia
de tratamento todos os animais serão sacrificados e retirados os seus colóns para posterior análise.
Os grupos experimentais serão compostos de grupo salina, grupo etanol, grupo etanol +
Polissacarídeo (30, 60 ou 90 mg/kg), grupo TNBS, grupo TNBS + Polissacarídeo (30, 60 ou 90
mg/kg).
Avaliação do peso úmido dos colóns de animais com ou sem colite e tratados com os
polissacarídeos de A. cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. ferrea Mart.
Após o sacrifício dos animais e antes da análise macroscópica dos escores de lesão
dos cólons de animais com ou sem colite, serão retirados fragmentos medindo 1 cm de
comprimento cada um, dos cólons dos animais. Posteriormente, os fragmentos serão pesados e os
resultados expressos pela unidade peso úmido / cm de lesão.
Avaliação dos escores macroscópicos e microscópicos de lesão
Os animais serão sacrificados 3 dias após a indução das colites por deslocamento
cervical. Nesse momento, será feita uma incisão mediana com abertura na cavidade peritoneal.
Após a identificação do reto e cólon, será isolada uma extensão de 5 cm. A peça será aberta
longitudinalmente, lavada com soro fisiológico e distendida sobre uma superfície plana para uma
avaliação do escore macroscópico seguindo a técnica descrita por Morris (1989) e do escore
microscópico seguindo a técnica descrita por Appleyard e Wallace (1995).
Ensaio para mieloperoxidase no colon de animais com ou sem colite e tratados com os
polissacarídeos de A. Cearensis (Allemão) A.C. Sm e C. Ferrea Mart.
Resumidamente, 50 a 100 mg de colón de animais com ou sem colite e tratados ou não
com PLS (30, 60 e 90 mg/kg), serão colocados num tampão 1 (NaCl 0,1 M + NaEDTA 0,015 M/L
de NaPO4 0,02 M em pH 4,7). Posteriormente, homogeneizados num Politron (13000 rpm). Sendo
centrifugados a 15 minutos (3000 rpm). Logo após, o sobrenadante será retirado e o precipitado,
novamente centrifugado no tampão 1 e colocado para centrifugar nas mesmas condições. O
sobrenadante será, mais uma vez, retirado e, então, o precipitado homogeneizado (Politron - 13000
rpm) em um tampão 2 [HTAB (0,05%)/200 ml de NaPO4 0,05M]. A próxima etapa será colocar
esse homogenato para congelar e descongelar em nitrogênio líquido (2X). Posteriormente, o
homegenato será centrifugado a 10000-20000 rpm por 15 minutos. Finalmente, o sobrenadante será
pipetado na placa (5-10 µl) + 45 µl de NaPO4 0,08M e mais a solução de leitura [TMB 25 µl (5
min) + H2O2 100 µl (5 min)]. A reação será finalizada com o acréscimo de H2SO4 50 µl (4M) e lida
em um leitor de placa a 450 nm. Assim, o infiltrado neutrofílico será obtido a partir de uma curva
padrão de neutrófilos.
Dosagem de TNF- α, ILl-1β e IL-10:
Fragmentos do colón de animais com ou sem colite e tratados ou não com os
polissacarídeos (30, 60 e 90 mg/kg) serão retirados rapidamente para dosagem de TNF- α, IL-1β e
IL-10. Os fragmentos serão adicionados em um tampão inibidor de protease (500 µL de tampão
para cada 100 mg de tecido) e depois processados em um homogeneizador de tecido e centrifugados
a 3000 rpm a 4 ºC por 10 min. Posteriormente, o sobrenadante será coletado e incubado com 2
µg/ml de anticorpo (anticorpo de captura) diluído em tampão de bicarbonato (pH 8.2), 100 µL por
poço por 24 horas a 4 ºC. A placa será lavada com PBS -Tween 20 a 0,1%. A reação será bloqueada
com albumina bovina 1% diluída em tampão de lavagem, 100 µL por poço por 2 horas à
temperatura ambiente. Posteriormente, a placa será novamente lavada usando a mesma solução. A
placa será incubada com a curva padrão das citocinas (TNF- α, IL-1β e IL-10) diluídas em tampão
de lavagem e com as amostras de tecido do estômago a serem dosados, 100 µL por poço por 24
horas a 4 ºC. A placa será novamente lavada e depois incubada com o anticorpo biotinilado
(1:1000) diluído em tampão de lavagem contendo 1% de soro de carneiro por 1h à temperatura
ambiente. Novamente a placa será lavada e depois incubada com avidina peroxidase (DAKO)
diluída 1:5000 em tampão de lavagem, 100 µL por poço por 15 minutos à temperatura ambiente. A
placa será lavada e incubada com O-fenilenediamina diidrocloreto (OPD) em tampão substrato, 100
µL por poço, no escuro à temperatura ambiente por um período que varia de 5 a 20 minutos
dependendo da citocina. A reação será parada com 150 µL por poço de H2SO4 1M. A intensidade
da coloração será medida em espectrofotômetro a 490 nm e os resultados serão expressos como
média ± EPM da quantidade de TNF-α, IL - 1β e IL-10 em pg/ml (TAVARES-MURTA, et al,
1998).
Avaliação da glutationa reduzida (GSH):
A glutationa reduzida é um tripeptídeo composto de glutamato, glicina e cisteína,
existente em praticamente todas as células de mamíferos. Exibe um grande número de funções
essenciais para a célula, incluindo transporte de aminoácidos, catálise enzimática e proteção contra
os efeitos deletérios de radicais livres endógenos e metabólitos tóxicos (MEISTER, 1991). O
método de Sedlak e Lindsay (1968) será utilizado para análise de glutationa nas amostras de colóns
de animais com ou sem colite e tratados ou não com os polissacarídeos (30, 60 e 90 mg/kg). Para
determinação dos níveis de grupos sulfidrílicos não-protéicos, uma amostra de 50 a 100 mg da
mucosa intestinal dos animais será homogeneizada em 1 mL de EDTA 0.02 M para cada 100 mg de
tecido. Alíquotas de 400 µL do homogeneizado serão misturadas a 320 µL de água destilada e a 80
µL de ácido tricloroacético (TCA) a 50% para precipitação de proteínas. Os tubos serão
centrifugados por 15 minutos a 3000 rpm a 4º C. A um total de 400 µL do sobrenadante serão
adicionados 800 µL de tampão Tris 0,4 M (pH 8.9) e 20 µL de DTNB (reagente de Ellman) 0,01 M.
A mistura será então agitada por 3 minutos e a absorbância lida a 412 nm em espectrofotômetro. As
concentrações de grupos sulfidrílicos não-protéicos serão expressas em µg de NP-SH/g de tecido.
Avaliação dos níveis de malondialdeido (MDA):
Os níveis de malondialdeído na mucosa intestinal de colóns de animais com ou sem
colite e tratados ou não com os polissacarídeos (30, 60 e 90 mg/kg) serão determinados pelo método
de Mihara e Uchiyama (1978). Fragmentos da mucosa intestinal (300 mg) serão homogeneizados
com KCl gelado 1.15% para preparar 10% de homogenato. Meio mililitro (0.5 mL) desse
homogenato será pipetado dentro de um tubo de centrífuga de 10 mL, 3 mL de H3PO4 (1%) e 1 mL
de uma solução aquosa de ácido tiobarbitúrico aquoso (0.6%) onde serão acrescentados. Os tubos
foram aquecidos por 45 min. em um banho de água fervente e a mistura reacional será então
resfriada em um banho de água gelada, seguida da adição de 4 mL de n-butanol. Os conteúdos serão
misturados por 40 segundos com um misturador "vortex", centrifugados a 1200 x g por 10 min. e a
absorbância da camada orgânica será mensurada em 520 e 535 nm. Os resultados serão expressos
em mmol/g de fragmentos umedecidos.
4.5. Análises Estatísticas
Os resultados obtidos serão analisados mediante análise estatística não paramétrica
utilizando o teste de Kruskal-Wallis e/ou Mann-Whitney (nível de significância da análise de 5% e
1%). Também será empregado o programa GraphPad PRISM 5.04 for Windows, onde os resultados
serão expressos como média ± erro padrão da média (EPM) utilizando ANOVA para comparações
entre grupos distintos e teste t pareado para comparação com o mesmo grupo. A significância será
considerada quando a possibilidade de ocorrência da hipótese nula foi igual ou inferior a 5% (p ≤
0,05).
5. Principais contribuições científicas ou tecnológicas da proposta
O projeto Polissacarídeos de plantas da Caatinga: avaliação do potencial anti-inflamatório
e antinociceptivo contribuirá cientificamente através da divulgação de resumos e artigos científicos
a serem publicados em periódicos com bom fator de impacto, fortificando a formação
interdisciplinar de discentes de iniciação científica e a consolidação de grupos de pesquisa.
Concomitantemente, auxiliará na estruturação da pesquisa na UNIVASF (e em outras Instituições
de Ensino Superior), a qual se encontra em expansão, ampliando a participação da citada
universidade no cenário científico, sendo de extrema relevância para o desenvolvimento da pesquisa
na região do semiárido nordestino. É importante considerar que um número ainda reduzido de
trabalhos que proporcionem um maior conhecimento e entendimento a respeito do potencial
terapêutico de polissacarídeos de espécies vegetais nativas do ambiente semiárido brasileiro, foram
realizados na região de estudo deste projeto. Além disso, o presente projeto proporcionará a
inclusão e o intercâmbio entre jovens e experientes pesquisadores com ampla experiência na área de
atuação proposta, além de expandir as possibilidades de conhecimento de jovens estudantes de
iniciação científica, os quais poderão futuramente ingressar em cursos de Pós-graduação com uma
experiência de atuação mais solidificada, contribuindo, desse modo, para o desenvolvimento
regional do semiárido nordestino.
6. Orçamento detalhado
Rubrica
Valor total
estimado (R$)
Detalhamento
58.078,79
Centrífuga refrigerada de bancada rotação até 18.000
rpm; Rotor angular 30º com tampa, para 6 tubos de 50
(i) Capital
Equipamentos e
material permanente
mL, velocidade de 10.000 rpm; Bomba de vácuo ¼ HP;
Módulo isolador 220V.
JUSTIFICATIVA: Os itens apresentados são necessários
para os procedimentos de extração, fracionamento e
obtenção final das amostras de polissacarídeos a serem
empregados nos testes químicos e de atividade
biológica.
Pletismômetro para patas de ratos e camundongos;
Placa quente (hot-plate).
JUSTIFICATIVA: Os itens apresentados são necessários
para os ensaios de atividade antiedematogênica e
antinociceptiva em animais.
Atualmente, o laboratório destinado a essas atividades
não possui tais equipamentos.
(ii) Passagens
5.040,00
Terrestre: Petrolina-Teresina-Petrolina/TeresinaParnaíba-Teresina; Petrolina-Fortaleza-Petrolina;
Aéreas: Petrolina-Recife-Petrolina/ Petrolina – a definir
- Petrolina
JUSTIFICATIVA: o valor apresentado será utilizado nas
visitas dos pesquisadores e estudantes de iniciação
científica durante a execução do projeto na forma de
intercâmbio e integração para discussão dos resultados
e encaminhamentos a serem tomados pela equipe
executora. Também será empregado no custo de
deslocamentos durante eventos de divulgação científica
como congressos, reuniões anuais e a jornada de
iniciação científica FACEPE 2013/2014.
(iii) Diárias
3.944,43
JUSTIFICATIVA: o valor apresentado será utilizado nas
visitas dos pesquisadores e estudantes de iniciação
científica durante a execução do projeto, além do custo
de deslocamentos durante eventos de divulgação
científica.
(iv) Bolsas
8.640,00
JUSTIFICATIVA: concessão de duas cotas de BIC no valor
de R$ 360,00 cada, por um período de 24 meses. Esse
recurso atenderá estudantes de graduação da UNIVASF
durante a execução de suas atividades propostas no
projeto.
(v) Bens de custeio
Reagentes para
extração, obtenção e
11.645,50
Ácido D-galacturônico, D-Galactose, Meta-hidroxifenil,
DEAE Sephacel, Tetraborato de sódio, Ácido clorídrico,
Ácido sulfúrico, Ácido fosfórico, Acetona, Etanol
absoluto, Metanol, Álcool Iso-propílico, Ácido
tricloroacético, Folin- reagente de fenol, Fenol líquido,
Tetraborato de sódio, Coomassie Blue G-250, Fosfato de
sódio monobásico, Fosfato de potássio monobásico.
análise química das
amostras de
polissacarídeos.
JUSTIFICATIVA: Esses itens de alto custo são
imprescindíveis à execução das atividades. Sua
aquisição permitirá desenvolver todas as etapas
necessárias à obtenção das amostras para avaliação de
seus atributos químicos, estruturais e funcionais.
Reagentes padrões
para ensaios de
atividade
antiedematogênica
e antinociceptiva.
2.081,00
Reagentes padrões
para ensaios de
atividade antiinflamatória in vivo e
in vitro.
6.171,00
Reagentes químicos e padrões certificados (Carragenina,
Dextrana, Zimosan, Histamina, Serotonina, Bradicinina,
Prostaglandina E2, L-arginina, Indometacina, entre
outros).
JUSTIFICATIVA: Esses itens são imprescindíveis à
execução das atividades de avaliação do efeito
antiedematogênico e antinociceptivo nas diferentes
amostras obtidas. Além disso, essa etapa fornecerá
subsídio para a compreensão do modo de ação dos
polissacarídeos estudados nos modelos testados.
Reagentes químicos e padrões certificados: Brometo de
hexadecitrimetilamônio, Anticorpos anti-citocinas,
substratos para reações enzimáticas (OPD, DNTB),
indutores de inflamação.
JUSTIFICATIVA: Esses são imprescindíveis à execução
das atividades de avaliação do efeito anti-inflamatório
in vivo e in vitro. Sua utilização permitirá avaliar o
mecanismo de ação pelo qual as moléculas em estudo
promovem um evento ou resposta anti-inflamatória nos
modelos de estudo propostos.
Consumíveis para
análises
espectroscópicas
(RMN)
Consumíveis de uso
geral
986,00
Tubos de RMN 5 mm 7 Lg 500 Mhz (5/Cx) Norell Dlm4.100; Água Deuterada (D,99.9%) b(100g) Cil.
JUSTIFICATIVA: A técnica de ressonância magnética
nuclear permitirá avaliar a natureza estrutural das
amostras químicas de polissacarídeos. Sua realização
será de grande contribuição para a obtenção dos
objetivos deste projeto.
4.852,38
Reagentes de grau analítico, plásticos e vidrarias,
seringas, membranas de diálise, clusters de membrana,
sistemas de filtração, membranas de filtração, cubetas de
vidro, plástico e quartzo, mangueiras e conexões para
sistema de cromatografia líquida e gasosa.
JUSTIFICATIVA: tais itens serão adquiridos durante o
início e, se necessário, durante o andamento do
projeto. Os materiais adquiridos serão repassados aos
laboratórios participantes do projeto mediante
solicitação do responsável.
Serviços de terceiros
Total
3.990,00
Manutenção de equipamentos, serviços de impressão de
pôsteres, correção de artigos na língua inglesa por
revisores especializados.
105.429,10
JUSTIFICATIVA: esse valor será destinado ao pagamento
de serviços para eventual conserto de aparelhos ou
calibração dos mesmos. Também será empregado para
a confecção de pôsteres para os eventos de divulgação
científica. Alguns periódicos exigem para publicação a
correção dos manuscritos por revisores especializados
na língua inglesa, desse modo, parte do recurso será
destinada a tal fim.
7. Cronograma
7.1 Cronograma Físico Trimestral
Etapas trimestrais
Ano 01
Ano 02
(2012-2013) (2013-2014)
1º 2º 3º 4º 5º 6º 7º 8º
Levantamento bibliográfico.
X X X X X X X
Aquisição de bens de capital e material de consumo.
X X
Atividades de campo nas áreas de coleta do material vegetal.
Processamento e determinação dos protocolos de extração dos
polissacarídeos dos frutos e/ou sementes.
Extração e fracionamento dos polissacarídeos das espécies de estudo.
Análise das propriedades químicas das amostras polissacarídicas (teor
de ácido urônico, proteína e carboidrato).
Ensaios de atividade biológica das frações polissacarídicas obtidas
(atividades antiedematogênica e antinociceptiva).
Ensaios de atividade biológica das frações obtidas (atividade antiinflamatória in vivo e in vitro).
Análises químicas e espectroscópicas das frações polissacarídicas
obtidas (FT-IR, HPSEC, RMN).
Compilação de dados, confecção de resumos, divulgação de
resultados em eventos, e preparação de manuscritos dos artigos.
Confecção do relatório técnico final.
X X
X X X
X X X X X
X X X
X X X X X
X X X X X
X X X
X X X X
X
X Considerar a fenologia das espécies propostas no estudo em relação ao período de frutificação
das
mesmas.
8 Identificação dos participantes do projeto
Participante
Dr. Dráulio Costa da Silva Coordenador
Dr. André Luiz dos Reis
Barbosa - Pesquisador
Dr. Jand-Venes Rolim
Medeiros - Pesquisador
Cargo/ Instituição
Professor Adjunto (Área de atuação: Bioquímica)/ Universidade
Federal do Vale do São Francisco (UNIVASF), Petrolina,PE.
Professor efetivo do Colegiado de Ciências Biológicas desde
janeiro de 2009. Doutor em Bioquímica pela Universidade
Federal do Ceará com tese defendida e aprovada em agosto de
2011. Tem experiência na área de bioquímica de macromoléculas,
isolamento, caracterização e aplicação farmacológica de
polissacarídeos vegetais.
http://lattes.cnpq.br/5694984173742159
Professor Adjunto (Área de atuação: Farmacologia)/ Universidade
Federal do Piauí (UFPI). Doutor em Farmacologia pela
Universidade Federal do Ceará. Desenvolve trabalhos na área de
inflamação geral e do trato gastrintestinal além de estudar
mecanismos moleculares envolvidos na fisiopatologia da dor
aguda de caráter inflamatório e dor crônica.
http://lattes.cnpq.br/4988298209243763
Professor Adjunto (Área de atuação: Farmacologia)/ Universidade
Federal do Piauí (UFPI). Doutor em Farmacologia pela
Universidade Federal do Ceará. Tem experiência na área de
Farmacologia, com ênfase em Farmacologia do Trato
Gastroinestinal e Inflamação, atuando principalmente nos temas
inflamação, úlcera gástrica, mucosite.
http://lattes.cnpq.br/9633014722855515
Drª. Regina Célia Monteiro
de Paula - Pesquisadora
Professora Associada (Área de atuação: Química de
biopolímeros/Universidade Federal do Ceará (UFC). Tem
experiência na área de Química, com ênfase caracterização e
modificação de polissacarídeos, nano- e micropartículas de
biopolímeros para liberação de fármacos.
http://lattes.cnpq.br/5685898279302235
Drª. Jeanny da Silva Maciel Pesquisadora
Professora Adjunta (Área de atuação: Química de Biopolímeros)/
Universidade Federal do Ceará (UFC). Doutora em Química
Inorgânica pela Universidade Federal do Ceará. Atua
principalmente nos seguintes temas: polissacarídeos regionais,
géis, sistema de liberação de fármacos e modificação de
polissacarídeos.
http://lattes.cnpq.br/9484470414986626
A definir - estudante
Estudante de graduação/ Universidade Federal do Vale do São
Francisco (UNIVASF)
A definir - estudante
Estudante de graduação/ Universidade Federal do Vale do São
Francisco (UNIVASF)
9. Indicação de colaboração ou parceria já estabelecida com outros centros de
pesquisa na área
Os procedimentos de extração, fracionamento, caracterização química (teor
de carboidratos, proteínas e ácido urônico) e determinação de algumas das atividades
biológicas propostas para as amostras de polissacarídeos obtidas serão realizadas no
Laboratório de Bioquímica/Ecologia Química (coordenado pelo Prof. Dr. Draulio Costa
da Silva) do Núcleo de Ecologia Molecular (NecMol) da Universidade Federal do Vale
do São Francisco (UNIVASF), em Petrolina, Pernambuco. Esse núcleo conta com
infraestrutura laboratorial para o desenvolvimento das análises biquímicas e químicas
além de aplicação das amostras em modelos de edema, inflamação e antinocicepção,
sendo necessária a aquisição de alguns equipamentos para a realização destes últimos.
Os procedimentos de caracterização química [métodos espectroscópicos
(FT-IR) e estimativa da massa molar (HPSEC)] das amostras obtidas serão realizados
no Laboratório de Polímeros do Departamento de Química Orgânica e Inorgânica da
Universidade Federal do Ceará (UFC), sob a supervisão da Professora Drª Regina C. M
de Paula. As análises de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) serão realizadas no
Centro Nordestino de Aplicação e Uso de Ressonância Magnética Nuclear
(CENAUREMN) na Universidade Federal do Ceará em Fortaleza, sob a supervisão da
Professora Drª. Jeanny da S. Maciel.
Os ensaios de atividade anti-inflamatória in vivo e in vitro descritos na
metodologia desta proposta serão realizados no Laboratório de Farmacologia do
Campus Ministro Reis Velloso da Universidade Federal do Piauí, Parnaíba, PI, sob a
supervisão dos Professores Doutores Jand-Venes Rolim Medeiros e André Luiz dos
Reis Barbosa.
10. Disponibilidade efetiva de infraestrutura e de apoio técnico para o
desenvolvimento do projeto
O presente projeto contará com infraestrutura e logística do Núcleo de
Ecologia Molecular (NecMol), um setor da UNIVASF. Neste complexo de laboratórios
constam equipamentos e materiais que auxiliarão na execução das atividade propostas.
Estão disponíveis para uso equipamentos como sistema de purificação de água osmose
reversa, destilador, deionizador, estufas de esterilização e secagem e forno mufla, além
de vidrarias e uma certa quantidade de reagentes. Em relação ao Laboratório de
Bioquímica/Ecologia Química, o mesmo conta com sistema de cromatografia a baixa
pressão com coletor de frações e bomba peristáltica, bomba de vácuo, banho ultratermoestático, evaporador rotativo, liofilizador, refrigerador, espectrofotômetro,
balanças analítica e de precisão, potenciômetro, cubas e fonte para eletroforese, agitador
mecânico, chapa aquecedora, capela de exaustão de gases, agitador magnético e
agitador de tubos.
O Laboratório de Polímeros da Universidade Federal do Ceará conta com
ótima infraestrutura para execução das atividades relacionadas à caracterização química
e estrutural das moléculas em estudo. Estão disponíveis os equipamentos,
espectrofotômetro FT-IR Shimadzu 8300 e cromatógrafo Shimadzu LC-10AD, para
citar alguns. Para as análises de Ressonância Magnética Nuclear será utilizada a
infraestrutura do CENAUREMN através do espectrômetro BRUKER, modelo
AVANCE-DRX-500.
Para os ensaios de atividade anti-inflamatória, o Laboratório de
Farmacologia (UFPI) conta com todos os equipamentos necessários à sua execução,
como leitora de microplacas, freezer, refrigerador, centrífuga de bancada, microscópio,
espectrofotômetro e agitadores.
11. Referências Bibliográficas
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Anexo I – Comprovante da submissão para a Comissão de Ética no Uso de Animais