1
Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
ESTUDO DA RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM
POPULAÇÕES DE NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE
CAPRINOS DO MUNICÍPIO DE CANSANÇÃO, BAHIA
Simone Lopes Borges
Salvador - Bahia
2013
2
SIMONE LOPES BORGES
ESTUDO DA RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM POPULAÇÕES DE
NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE CAPRINOS DO MUNICÍPIO DE
CANSANÇÃO, BAHIA
Dissertação apresentada à Escola de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Federal da Bahia, como requisito para a
obtenção do título de Mestre em Ciência
Animal nos Trópicos, na área de Saúde
Animal.
Área
de
veterinária
Concentração:
Orientadora: Prof. Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida
Co-Orientadora: Prof. Dra. Mariana Borges Botura
Salvador – Bahia
2013
Parasitologia
3
SIMONE LOPES BORGES
ESTUDO DA RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM POPULAÇÕES DE
NEMATOIDES GASTRINTESTINAIS DE CAPRINOS DO MUNICÍPIO DE
CANSANÇÃO, BAHIA
Dissertação defendida e aprovada pela comissão examinadora em 19 de fevereiro de
2013.
Comissão Examinadora:
___________________________________________
Profª. Drª Maria Angela Ornelas de AlmeidaUniversidade Federal da Bahia
Orientadora
___________________________________________
Prof. Dr. George Rêgo Albuquerque
Universidade Estadual da Santa Cruz
____________________________________________
Profª. Drª Silvia Lima Costa
Universidade Federal da Bahia
SALVADOR-BA
FEVEREIRO - 2013
4
BIOGRAFIA DO AUTOR
SIMONE LOPES BORGES - filha de Sostenes Carvalho Borges e Maria Suzana Lopes
Borges nasceu em 01 de outubro de 1981, na cidade de Conceição do Coité, no estado da Bahia.
Iniciou o curso de graduação em Medicina Veterinária 01 de março de 2005 e em 05 de agosto
de 2010 concluiu a graduação. Em 01 de março de 2011, ingressou na Pós-graduação em
Ciência Animal nos Trópicos pela Universidade Federal da Bahia, sob orientação da professora
Dra. Maria Angela Ornelas de Almeida, defendendo a dissertação de mestrado em 19 de
Fevereiro de 2013.
5
Este trabalho é dedicado a minha mãe Maria
Suzana Lopes Borges por exercer fundamental
apoio em todas as etapas de minha formação
profissional,
propiciando
coragem
e
determinação para continuar e superar os
obstáculos impostos.
6
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me proporcionado força e coragem para conclusão de mais uma etapa da vida.
A meus pais, Sóstenes Carvalho Borges e Maria Suzana Lopes Borges, meus irmãos Rodrigo
Lopes Borges, Malena Lopes Borges e Mary Jose Lopes Carneiro, e demais familiares por todo
carinho, confiança, assim como, a compreensão da necessidade da ausência nas diversas datas
comemorativas.
A minha orientadora, Professora Maria Angela Ornelas de Almeida pela confiança, amizade e
paciência desde a época de iniciação cientifica.
A minha Co-orientadora Mariana Borges Botura, por estar sempre disponível nos momentos de
necessidade, assim como sugestões relevantes nesse trabalho desenvolvido.
Aos colegas de profissão e amigos formados durante essa trajetória, Sabrina Lambert, Sandra
Nishi, Barbara Paraná, Lívia Ribeiro, Carlos José Souza Filho, Hélimar Lima e Natalia pela
ajuda na execução das etapas do experimento e paciência de conviver durante esses momentos
estressantes.
Ao laboratório de Toxicologia (LATOX) da Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia, pela
concessão dos equipamentos necessários para desenvolvimento da pesquisa.
A coordenação Aperfeiçoamento de pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da
bolsa de estudos.
7
LISTA DE FIGURAS
REFERENCIAL TEÓRICO
Página
Figura 1.
Distribuição da população caprina no Brasil (FAO, 2010)
04
Figura 2.
Situação da resistência anti-helmíntica no Nordeste Brasileiro
18
8
LISTA DE GRÁFICOS
CAPÍTULO 1
Gráfico 1.
Média e desvio padrão do percentual de inibição, por
Página
36
tiabendazole, da eclosão de ovos de nematódeos
gastrintestinais de caprinos entre as áreas Alto Lindo,
Morada Nova, Nova Vida e Belo Monte
Gráfico 2.
Média e desvio padrão do percentual de migração de
larvas de nematódeos gastrintestinais de caprinos após
incubação com ivermectina
37
9
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1.
Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos
Página
31
e percentuais de eficácia de anti-helmínticos por áreas do
município de Cansanção
Tabela 2.
Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos
33
e percentuais de eficácia da moxidectina e closantel na área
de Belo Monte do município de Cansanção.
Tabela 3.
Eficácia (%) do albendazole, levamisole, ivermectina para
34
os gêneros Haemonchus e Trichostrongylus de caprinos
Tabela 4.
Percentuais de eficácia da ivermectina pelo Teste de
38
Migração Larvar, por áreas do município de Cansanção
Tabela 5.
Concentração efetiva (CE50) de thiabendazole para o Teste
de Eclosão de Ovos e CE50 e coeficiente de determinação
(R2) para ivermectina para o Teste de Migração Larvar
39
10
BORGES, S.L. Estudo da resistência anti-helmíntica em populações de nematoides
gastrintestinais de caprinos do município de Cansanção, Bahia. Salvador, Bahia, 2013,
73pg. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade Federal da Bahia.
RESUMO
A produção de caprinos, no nordeste brasileiro, apresenta uma importante função social e
econômica, sendo responsável por geração de emprego e renda para os pequenos produtores. No
entanto, os rebanhos caprinos são acometidos por helmintos gastrintestinais que afetam o
desempenho desses sistemas pecuários, necessitando de medidas de controle das parasitoses
para evitar as perdas econômicas, decorrentes da morbidade e mortalidade dos animais. O
controle das verminoses gastrintestinais tem sido realizado com antiparasitários de amplo
aspecto e poder residual. Contudo, a dosificação inadequada e a frequência constante de
tratamentos têm causado a seleção de populações de parasitos geneticamente resistentes aos
anti-helmínticos. A resistência parasitária é observada quando há perda de eficácia de composto
químico contra os parasitos, após sucessivos tratamentos. Esse estudo foi promovido com
objetivo de estimar a resistência anti-helmíntica aos benzimidazois e avermectinas através dos
testes de Eclosão de ovos, de migração larvar em ágar modificado e de Redução da Contagem
de Ovos nas Fezes em caprinos no município Cansanção no estado da Bahia. Nematódeos
resistentes aos benzimidazois, lactonas macrociclicas, levamisole e closantel foram encontrados
em rebanhos caprinos em região semiárida em teste in vivo e in vitro, e a alta frequência de
resistência foi registrada em diferentes áreas de estudo.
Palavras chaves: BZs, lactonas macrocíclicas, pequenos ruminantes, resistência, testes in vivo,
testes in vitro
11
BORGES, S.L. Study of anthelmintic resistance in populations of goat gastrointestinal
nematodes in the municipality of Cansanção, Bahia. Salvador, Bahia, 2013, 73pg.
Dissertation (Master's degree of Animal Science in Tropics) – School of Veterinary Medicine
and Livestock, Federal University of Bahia, 2013
SUMMARY
In the northeastern Brazil, goat production has an important social and economic function,
generating employment and income for small farmers. However, goat herds are affected by
gastrointestinal helminths that reduce the performance of these livestock systems, requiring
control measures to prevent parasitic economic losses, arising from the morbidity and mortality
of animals. The control of gastrointestinal worms have been conducted by using broad spectrum
antiparasitic drugs and residual power. However, inadequate dosage and constant treatments
have caused the selection of populations of genetically resistant parasites to anthelmintics. The
parasitic resistance is observed when there is a loss of efficacy of a chemical compound against
the parasite, after successive treatments. This study was promoted with the objective of estimate
anthelmintic resistance to benzimidazoles and avermectins through Egg Hatch Inhibition, Larval
Migration inhibition and Faecal egg count reduction test in goats in Cansanção municipality in
the state of Bahia . Nematodes resistant to benzimidazoles, macrocyclic lactones, levamisole
and closantel were found in goat herds in semiarid region by in vivo and in vitro tests, and high
frequency of resistance was recorded in different areas of study.
Palavras chaves: BZS, macrocyclic lactones, small ruminants, resistance, in vivo tests, in vitro
12
SUMÁRIO
Estudo da resistência anti-helmíntica em populações de nematoides
......... Página
gastrintestinais de caprinos do município de Cansanção, Bahia
Introdução .............................................................................................................................. 14
Referencial Teórico .............................................................................................................. 17
1. Caprinocultura no Brasil e no Nordeste ............................................................................... 17
2.Nematódeos gastrintestinais ................................................................................................. 19
3. Fatores que influenciam o parasitismo dos caprinos ........................................................... 20
4. Anti-helmínticos .................................................................................................................. 25
4.1. Mecanismo de ação e desenvolvimento da resistência ..................................................... 25
5. Resistência anti-helmíntica .................................................................................................. 29
5.1. Problemática da Resistência ............................................................................................. 29
5.2. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vivo ........................................... 30
5.3. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vitro .......................................... 32
Objetivo .................................................................................................................................. 37
Capítulo 1
Resistência anti-helmíntica múltipla em rebanhos caprinos no bioma caatinga
Resumo ......................................................................................................................... 38
Abstract ......................................................................................................................... 38
Introdução ..................................................................................................................... 39
Material e Métodos ....................................................................................................... 40
13
Resultado ...................................................................................................................... 44
Discussão ...................................................................................................................... 44
Conclusão ..................................................................................................................... 54
Referências Bibliográficas ............................................................................................ 55
Considerações Finais .................................................................................................. 59
Referências Bibliográficas ......................................................................................... 60
14
INTRODUÇÃO
A produção de caprinos, no nordeste brasileiro, apresenta uma importante função social
e econômica, sendo responsável por geração de emprego e renda para os pequenos
produtores.
A caprinocultura é uma atividade estratégica para o desenvolvimento da região
Nordeste, apesar de apresentar ainda níveis muito pobres de desempenho. O centro geral
do efetivo caprino encontra-se nesta região (98% da população), sendo a Bahia o maior
estado produtor, seguido de Pernambuco, Piauí, Ceará e Paraíba (IBGE, 2010). Porém,
quando se analisa a evolução da população caprina, verifica-se uma assimetria, com
queda expressiva nos últimos anos, em virtude da substituição de caprinos pelos ovinos
em algumas regiões e a introdução e desenvolvimento da agricultura irrigada,
principalmente nos polos de fruticultura.
Associados a estes fatores, o sistema de produção de caprinos sofre com a deficiência
alimentar e o elevado parasitismo dos animais, dois grandes entraves para a
sustentabilidade desta atividade. Outro problema em potencial para caprinocultura é a
fragilidade do bioma caatinga, pela degradação dos seus recursos físicos e bióticos,
especialmente o déficit hídrico. O produtor convive com ambientes completamente
opostos, no período das chuvas ou de seca prolongados, com alto índice de morbidade e
mortalidade dos animais.
Sem dúvida alguma a infecção por nematoides gastrintestinais (NGIs) é um dos grandes
gargalos para exploração caprina. Os rebanhos caprinos são acometidos por helmintos
gastrintestinais que afetam o desempenho desses sistemas pecuários, necessitando de
medidas de controle das parasitoses para evitar as perdas econômicas (JACKSON e
MILLER, 2006). No estudo de diagnóstico da Situação de Saúde da População Caprina
do Município de Cansanção, Bahia, 99% dos 100 pecuaristas familiares questionados,
15
indicaram a verminose como principal problema de saúde dos animais (dados não
publicados).
As nematodeoses gastrintestinais constituem uma dos principais problemas sanitários a
pecuária, e são causadas especialmente pelos gêneros Haemonchus, Trichostrongylus,
Strongyloides e Oesopagostomum. As infecções são geralmente mistas e os animais
podem apresentar perda de peso, diarreia, desidratação, anemia, redução da produção de
leite e alterações reprodutivas (VIEIRA, 2005).
Diante destes fatos o controle de parasitos é uma das estratégias para garantir a
sustentabilidade da cadeia produtiva caprina e para isto dispomos de tecnologias
básicas, sociais e inovadoras. Contudo, a pesquisa sobre parasitoses de caprino é muito
pobre quando comparada a espécie ovina e nem sempre o modelo ovino é apropriado
para caprinos. Por outro lado, as diretrizes do Programa Nacional de Sanidade dos
Caprinos e Ovinos sobre a forma de intervenção no processo Saúde-doença, tratam as
parasitoses como doença de manejo, portanto não é necessário o controle sanitário
oficial, pois não impõem restrições ao comércio de animais e seus produtos, ficando
este controle a cargo do produtor.
Um dos grandes desafios para o controle de nematoides é a escolha de critérios de
seleção de caprinos, para o tratamento anti-helmíntico. Vários indicadores como os
parasitológicos, patofisiológicos e de desempenho produtivo, vem sendo estudado,
objetivando dificultar o desenvolvimento da resistência anti-helmíntica, em virtude da
ocorrência da resistência múltipla em vários rebanhos caprinos no Brasil (BARRETO et
al. 2005; LIMA, M. et al. 2010; VIEIRA e CAVALCANTE, 1999; MELO et al. 2009)
O anti-helmíntico é um componente indispensável nos programas de controle de NGIs,
contudo poucos registros de medicamentos anti-helmínticos discrimina o caprino
(RINALDI et al., 2012) e a alta frequência de tratamentos e uso de subdoses (KUMSA e
16
ABEBE, 2009) e a rotação contínua de bases químicas tem favorecido o surgimento da
resistência (BARNES e DOBSON, 1990).
A resistência parasitária é observada quando há perda de eficácia de composto químico
contra os parasitos, após sucessivos tratamentos (CONDER e CAMPBELL, 1995), com
redução da carga parasitária inferior a 95% (MOLENTO et al., 2004). No tratamento
das nematodeoses são empregados principalmente os três grupos de anti-helmínticos:
benzimidazóis, que se ligam à β-tubulina e evitam a polimerização dos dímeros de
tubulina em microtúbulos, e também inibem a fumarato-redutase e o transporte de
glicose; imidazotiazóis que são agonistas de receptores de acetilcolina e provocam
contração muscular e paralisia e as lactonas macrocíclicas e milbemicinas, que abrem
canais de cloro direcionados por glutamato e ocasionam paralisia da neuromusculatura,
inclusive da faringe (AYRES e ALMEIDA, 1996; COLES et al., 2006).
Apesar da complexidade destes mecanismos de ação, o tratamento anti-helmíntico não
elimina todos os nematoides adultos suscetíveis do hospedeiro (LEIGNEL e
HUMBERT, 2001). Assim sendo, os helmintos que sobrevivem à utilização constante
desses medicamentos passam esta característica a sua progênie, assegurando o
desenvolvimento progressivo de populações resistentes (PAPADOPOULOS, 2008;
PRICHARD, 2001)
Diante deste panorama, várias metodologias vêm sendo aplicadas para o diagnóstico da
resistência parasitária aos anti-helmínticos, pois o conhecimento da distribuição da
resistência é necessário para redução do impacto da infecção parasitária nas criações de
caprinos, por melhoria do manejo e racionalização da pecuária. Por este motivo, no
presente estudo testamos a eficácia de benzimidazois, lactonas macrocíclicas,
levamisole e closantel para nematoides de caprinos em região semiárida.
17
REFERENCIAL TEÓRICO
1. Caprinocultura no Brasil e no Nordeste
A caprinocultura é uma das atividades econômica explorada mundialmente, com um
rebanho estimado de 745 milhões de cabeças (FAO, 2010). O Brasil possui
aproximadamente 9,3 milhões, distribuídos em todas as regiões do país, mas com maior
concentração na região Nordeste (98%) (Fig. 01), com destaque para o Estado da Bahia
que possui o maior rebanho do país, com cerca de 2,8 milhões, o que representa 30,6%
do efetivo nacional, seguida de Pernambuco (18,6%), Piauí (14,9%) e Ceará (11%)
(IBGE, 2010).
Figura 1: Distribuição da população caprina no Brasil (FAO, 2010).
Uma série de aspectos justifica esse número de caprinos no nordeste brasileiro, entre
estes se destacam a capacidade de adaptação ao ambiente semiárido e a função
socioeconômica por consistir em uma fonte de renda complementar de subsistência dos
criadores, oportunidades de emprego e fixação do homem no campo (MORAES NETO
et al., 2003). Além disso, esta atividade não exige altos investimentos em infraestrutura
18
e na aquisição de animais, além de apresentar rápido retorno do capital investido
(NOGUEIRA FILHO; ALVES, 2002).
No estado da Bahia, 80% dos rebanhos de caprino concentram-se na região do
semiárido, sendo as principais regiões produtoras são Remanso, Casa Nova, Curaçá,
Juazeiro, Uauá e Monte Santo. O município de Cansanção possui o segundo maior
rebanho de caprinos do território do sisal, com 36.127 cabeças, estando em primeiro
lugar o município de Monte Santo (87 mil) (SEI, 2010).
Os principais produtos da caprinocultura na Bahia são a carne e a pele/couro, possuindo
um grande diferencial competitivo no mercado de carne, por ser considerada pela
comunidade internacional (OIE), zona livre de aftosa, podendo comercializar seus
produtos para outros estados e países. Porém, um fator limitante da comercialização está
relacionado com a qualidade e a uniformidade dos produtos oferecidos, visto que é
estimado que mais de 90% do abate total da carne de caprinos ainda é clandestino,
contribuindo inclusive para riscos para a saúde dos consumidores (CONAB, 2006).
Apesar de numericamente expressiva, a caprinocultura baiana tem apresentado níveis
reduzidos de desempenho, baixo padrão racial dos animais, difusão tecnológica
incipiente, inadequada assistência técnica e gerencial, desarticulação dos atores da
cadeia produtiva, inexistência de estudos de mercados, baixo nível de capacitação dos
produtores, limitados recursos forrageiros e hídricos, carência de laboratórios
especializados e sem falar na baixa qualidade das peles que veem contribuindo
significativamente para que os resultados da exploração de caprinos no Nordeste não
sejam compensatórios e não apresentem competitividade, considerando as exigências
crescentes do mercado globalizado (NOGUEIRA FILHO e ALVES, 2002;
ROSANOVA, 2004).
19
Esses problemas acontecem principalmente, por haver um grande percentual de
rebanhos caprino em posse de pequenos produtores, sendo explorados em sistema
extensivo onde são adotadas práticas inadequadas de manejos alimentar e sanitário e por
deficiência na difusão de tecnologias economicamente viáveis à região para a atividade
pecuária. Desta forma, se faz necessário promover o uso de tecnologias adequadas,
visando melhorias na produção, sustentabilidade e no desenvolvimento local e regional,
gerando excedentes para os subsistemas de produção, processamento e distribuição
(NETO et al., 2011; ROSANOVA, 2004).
2. Nematódeos gastrintestinais de caprinos
Em criações extensivas de caprinos, o parasitismo gastrintestinal é um dos maiores
obstáculos na obtenção de bons índices zootécnicos (RINALDI et al., 2012) sendo estes
responsáveis por perdas econômicas (SILVA et al., 2003). Caprinos da região nordeste
do Brasil são mais frequentemente parasitados por Haemonchus contortus,
Trichostrongylus
colubriformis,
Strongyloides
papillosus
e
Oesophagostomum
columbianum (VIEIRA et al., 1997), sendo que o gênero Haemonchus tem maior
ocorrência nos rebanhos caprinos (ALMEIDA, et al. 1997; LIMA, M. et al., 2010;
MELO et al., 2003). As alterações fisiológicas e comportamentais mais comuns
observadas em ruminantes parasitados com nematódeos relacionam-se a disfunção
gástrica, diminuição da ingestão de alimentos e consequentemente perda de peso e
mudanças nos metabolismos energético, proteico e mineral levando a diarreias e em
alguns casos a morte do animal (FOX et al., 1993; SARGISON et al., 2012).
Haemonchus contortus é também mais prevalente nos caprinos de regiões temperadas
(HOSTE et al., 2010; RINALDI et al., 2007). Este parasito tem ação espoliativa sobre a
mucosa do abomaso e devido seu habito hematófago podem causar anemia severa,
edema submandibular, ascite e letargia (TAYLOR et al., 2010). Em relação ao gênero
20
Trichostrongylus, duas espécies acometem os caprinos, T.axei e T. colubriformis que se
localizam, respectivamente, no abomaso e intestino delgado e causam diarreias
prolongadas e como consequencia perda rápida de peso (Bizimenyera et al., 2006).
Outro nematódeo frequente em caprinos é o genero Oesophagostomum, cuja as larvas
migram pela mucosa do intestino, levando a formação de nódulos, em decorrência de
reação inflamatória com presença de neutrófilos e macrófagos (NWOSU et al., 2012). A
infecção por este nematódeo provoca nesses animais uma diarreia esverdeada, rápida
perda de peso e prostração (TAYLOR et al., 2010).
3. Fatores que influenciam o parasitismo dos caprinos
As interações de fatores alimentar, ambiental e imunitário, regulam o complexo sistema
da relação hospedeiro-parasita-ambiente nas infecções parasitárias (HOSTE et al.,
2008).
Em condições de semiárido nordestino, os caprinos são criados em sua maioria em
sistemas extensivos, alimentando-se de vegetações nativas e demonstram um
comportamento seletivo quando comparados a ovinos, ingerindo além de gramíneas,
espécies arbustivas principalmente em períodos de seca (HOSTE et al., 2001). Por
possuírem dietas compostas por forrageiras arbustivas, as espécies caprinas são mais
vulneráveis a infecções por nematódeos gastrintestinais (NGI) do que ovinas,
provavelmente por não terem sidos expostos durante o processo de domesticação a
cargas parasitárias elevadas (COSTA JÚNIOR et al., 2005).
VLASSOFF et al. (1999) afirma que alguns fatores como frequência de exposição e
idade dos caprinos quando acometidos por helmintoses levam precocemente a sinais
clínicos da infecção. Isso ocorre, devido pequenos ruminantes naturalmente infectados
21
responderem imunologicamente de maneiras distintas ao parasitismo por NGI ainda que
compartilhando o mesmo pasto.
Outro fator que favorece o parasitismo é a gestação. Fêmeas preenhes mostram-se mais
susceptíveis às infecções parasitárias em decorrência de uma resposta imunológica
menos eficiente para promover condições de crescimento seguro ao feto. No entanto, no
terço final de gestação a imunodeficiência favorece a infecção por nematódeos e as
fêmeas apresentam maior taxa de excreção de ovos nas fezes, o que aumenta a
contaminação das pastagens e, por conseguinte dos neonatos. Conforme relatado por
Pinto et al. (2008) que as maiores contagens de OPG foram coincidentes com a maior
concentração de partos, existindo uma relação direta entre a eliminação de ovos de
nematódeos gastrintestinais em fêmeas da espécie caprina próximo ao parto.
Trabalhos realizados por Hennessy (1993) e Sangster (1991) mostraram que os
comportamentos farmacocinéticos de medicamentos anti-helmínticos de amplo espectro
são diferenciados entre as espécies de pequenos ruminantes. Caprinos apresentam
biotransformação mais acelerada e consequentemente uma menor biodisponibilidade
sistêmica dos anti-helmínticos sob os nematódeos em relação aos ovinos, o que explica
que a pratica de sub-dosagens induzem parcialmente taxas de eficácia reduzidas aos
tratamentos com anti-helmínticos (SILVESTRE et al. 2002a). Hennessy (1997) e
Torres-Acosta (2008) sugerem a necessidade de administrar doses mais elevadas em
cabras para alcançar uma maior eficácia. No entanto, Hennessy (1997) sugerem dupla
aplicação do medicamaneto em caprinos, sendo administrada outra dose, 12 horas após
a primeira aplicação garantindo assim que o principio ativo permaneça mais tempo
presente no plasma.
Fenômenos relacionados ao parasito podem garantir seu desenvolvimento e
sobrevivência, a exemplo da Hipobiose, mecanismo pelo qual NGIs asseguram sua
sobrevivência no hospedeiro. Com metabolismo reduzido, larvas podem permanecer
inativas por meses, a espera de condições favoráveis de crescimento (COSTA, 2011).
22
Quando as condições climáticas melhoram, a maturação dessas larvas se normaliza
promovendo uma rápida contaminação do pasto (ROMERO e BOERO, 2001). Segundo
Vieira et al. (1997) esse mecanismo é comum em regiões tropicais e subtropicais e em
períodos secos.
A capacidade de gerar o maior número de indivíduos possíveis ao longo do tempo se
caracteriza o potencial biótico de uma espécie de parasita (ARMOUR, 1980). Espécies
de nematódeos possuem taxas de posturas que foram moldadas conforme a sua
adptações ao ambiente. A exemplo, o gênero Haemonchus apresenta a maior oviposição
entre helmintos, entre 5.000 e 10.000 ovos por dia (ROMERO e BOERO, 2001).
As condições climáticas favoráveis ao desenvolvimento e sobrevivência dos NGIs no
semiárido nordestino, ocorrem em meados da estação chuvosa e início da estação seca.
Desta forma, tratamentos preventivos são capazes de impedir a ocorrência de surtos por
reduzir a contaminação das pastagens no período de crescimento das larvas (COSTA et
al., 2009). Entre os fatores ambientais que influenciam a atividade de eclosão de ovos e
desenvolvimento de larvas infectantes destacam-se a temperatura, umidade e índices
pluviométricos
(STROMBERG,
1997),
sendo
estes
parâmetros
climáticos
determinantes no processo de desenvolvimento do ovo e da infectividade das larvas
(O'CONNOR et al., 2006).
Smith (1990) mostrou que larvas de H. contortus levaram 16 dias para eclodirem a 10°C
e que o aumento da temperatura para 37,8 °C reduziu o tempo de eclosão para 2,5 dias.
De acordo com Zajac (2006) faixas de temperaturas variando de 10°C a 36°C e clima
quente e úmido são ideais para o desenvolvimento dos estagios larvais de
Trichostrongylideos. Conforme este último autor, a depender das espécies de parasitas e
das condições climáticas a eles atribuídas, larvas infectantes de NGIs podem sobreviver
no pasto por longos períodos, uma vez que a bainha que envolve os estádios infectantes
capacitam os parasitas a resistir a condições adversas do ambiente.
23
Para prolongar a sobrevivência em variações drásticas impostas pelo ambiente, larvas de
nematódeos de ruminantes utilizam a anidrobiose como um comportamento adaptativo
(CROWE e CROWE, 1992), esses parasitos são capazes de tolerar até sete ciclos de
dessecação e reidratação sem influenciar no desenvolvimento de larvas no meio
ambiente (LETTINI e SUKHDEO, 2006).
A associação de métodos alternativos e a utilização correta dos anti-helmínticos para
controlar as infecções são preconizados, como a menor frequência de tratamentos, sem
evitar por completo a exposição dos ruminantes aos parasitas, uma vez que este contato
é necessário para o estímulo à resposta imune dos primeiros (CEZAR et al. 2008;
FLOATE, 2006; MARTÍNEZ e LUMARET, 2006; VIEIRA e CAVALCANTE, 1999).
Também foi observado que animais em pastejo restrito apresentavam uma curva de
reinfestação helmíntica menos ascendente do que em pastejo livre, sendo assim, a
restrição do pastejo nos horários de maior teor de umidade no pasto, em função de uma
menor ocorrência de larvas infectantes, apesar de não propiciar isoladamente um
controle efetivo, pode ser adotada como prática complementar, ao uso de antihelmínticos, no controle da infecção por helmintos (SANYAL, 1993; RODA et al.,
1995; CUNHA et al., 1997). Esses resultados corroboram com os estudos de Herd et al.
(1984), Banks et al. (1990) e Reinecke (1994) que obtiveram resultados positivos no
controle da infestação helmíntica com a associação de rotação de pastagens e restrição
do horário de pastejo, possibilitando a diminuição na frequência de uso de
medicamentos anti-helmínticos.
Por outro lado, em sistemas semi-intensivos de produção pode ocorrer um aumento
significativo na frequência das helmintoses gastrintestinais em caprinos, pois a
introdução de pastagens cultivadas proporcionam sombreamento e evita a dessecação de
ovos e larvas, além do aumento das lotações e a inserção de raças importadas com maior
produtividade e sensibilidade em relação a raças nativas (COSTA et al. 2011).
24
Outro método para diminuir o risco de infecção parasitária de caprinos é a integração de
animais e culturas em um único sistema, permitindo, por exemplo, que a agricultura
reduza o número de larvas no pasto (MOLENTO, 2009) ou alternar o pastoreio de
animais ruminantes com não ruminantes, uma vez que, não havendo perigo de infecção
cruzada, contribuindo para o que se chama de “diluição de larvas infectantes” na
pastagem (MOLENTO, 2004). Outra forma interessante para reduzir a infecção
parasitária é a utilização de forrageiras adequadas para corte, obtidas em áreas sem
pastoreio, para produção de concentrado, silagem ou feno, nos quais larvas L3 não
sobrevivem (TORRES-ACOSTA e HOSTE, 2008).
Dentre as alternativas no controle de verminose gastrintestinal, pode-se destacar o
método FAMACHA que proporcionou uma economia de vermífugos da ordem de 40%,
em relação ao método estratégico. Além disto, a rotina de avaliação e identificação dos
animais do rebanho necessários para correta utilização deste método, possibilitou
identificar 10% de animais sensíveis, que necessitaram de vermifugação cinco ou mais
vezes durante o período experimental. São esses animais, os principais responsáveis
pela contaminação do rebanho e aumento dos gastos com vermífugos (MEDEIROS et
al., 2008).
Sob condições de criação intensiva, a ocorrência maciça de endoparasitas obriga o
controle da infecção por meio do uso de anti-helmínticos a cada três a quatro semanas
(BANKS et al., 1990), exigindo maior atenção na aplicação desses químicos, a fim de
evitar o desenvolvimento de resistência anti-helmíntica (RA), a exemplo da rotação
anual dos vermífugos; seleção de antiparasitários após realização de testes de RA;
determinação correta do peso dos animais a serem tratados; evitar a subdose; restringir o
alimento antes do tratamento, pois promove redução da motilidade gastrintestinal
permitindo uma melhor absorção e maior permanência do medicamento no organismo
animal (CÉZAR et al., 2008; COSTA et al., 2009; MOLENTO, 2005).
25
4. Anti-helmínticos
Vários princípios ativos de anti-helmínticos vêm sendo utilizados no tratamento das
helmintoses gastrintestinais, dentre os quais se pode destacar os grupos químicos:
benzimidazóis, avermectinas, imidazotiazoles e salicilanilidas (BORGES, 2003).
Produtos anti-helmínticos de diferentes princípios ativos tem sido utilizados e a não
eficiência tem evoluído à medida que essas drogas são lançados no mercado (BORGES,
2003). O uso indiscriminado de fármacos tem selecionado populações de parasitas
resistentes aos principais grupos químicos.
4.1. Mecanismo de ação e desenvolvimento da resistência
Benzimidazóis (BZs)
Os benzimidazóis (tiabendazol, albendazol, febendazol, mebendazol, oxfendazol,
oxibendazol) e pró-benzimidazóis (febantel, tiofanato, netobimim) possuem ação
antinematódeo e em geral têm alta eficácia contra estágios adultos e imaturos (em
desenvolvimento ou inibido) de nematódeos gastrointestinais e pulmonares de
ruminantes e é ovicida (LANCEY, 1988). Seu mecanismo de ação é baseado no
impedimento da formação de microtúbulos do parasito. A ligação dos benzimidazóis
seletivamente a subunidade tubulina-β do parasito modifica o padrão da sua
despolimerização para formação dos microtúbulos, interrompendo processos vitais para
a função celular, como a divisão mitótica, transporte de nutrientes e alterações na forma
da célula (ALMEIDA e AYRES, 2006 ; MARTIN, 1997).
Oxberry (2001), Martin (1997) e Lacey (1987) relatam que os BZs, agem inibindo a
polimerização da tubulina, está responsável pela síntese de microtúbulos do parasita.
26
Em células eucarioticas, os microtúbulos desempenham uma variedade de funções
incluindo de motilidade e secreção celular, absorção de nutrientes e transporte celular,
mitoses e meiose (CALVISTON e HOLZBAUR, 2006, SARGISON 2012). O
desequilíbrio provocado pelo BZs à tubulina livre no citoplasma das células intestinais,
promovem a interrupção na formação de microtubulos, o que ocasiona alterações na
homeostasia nas células de nematódeos (BRUCE, 1987; KÖHLER, 2001).
Segundo Prichard (1973), os benzimidazóis também inibem a enzima fumarato redutase
e causam uma menor captação da glicose pelas células intestinais dos nematódeos, e
como via compensatória, o organismo desses parasitas utiliza de suas reservas
energéticas, ocasionando a morte do mesmo por inanição.
Os benzimidazoles são comumente utilizados no controle de infecções por nematódeos
gastrintestinais em ruminantes, e como consequência o aparecimento de nematódeos
resistente. A resistência aos benzimidazóis está associada à mutação nos genes para βtubulina; causando a perda de receptores de ligação de alta afinidade para os
benzimidazóis e, deste modo, o seu efeito sobre a polimerização da β-tubulina.
Diferentes mutações na proteína alvo, a β-tubulina está associada à resistência a este
composto, só para o H. contortus são conhecidos três variedades de mutação. A
alteração em um único nucleotídeo TTC (fenilalanina) para TAC (tirosina) no
aminoácido 200 da β-tubulina; fenilalanina para tirosina ou histidina no aminoácido
167, ou a substituição do ácido glutâmico por alanina na posição 198 (Kwa, et al. 1994).
Waller, et al. 1996 relatam a resistência aos BZN respectivamente no Uruguai, Paraguai
e Argentina. Em um estudo realizado por Torres-Acosta et al. (2003) foi demonstrado a
resistência aos BZD em fazendas de caprinos no México.
27
Imidazotiazois e Piramidinas
Conhecidas como medicamentos agonistas colinérgicos, os imidazotiozóis (levamisol,
tetramisol) e tetrahidropirimidinas (pirantel, morantel) se ligam aos receptores
nicotínicos de acetilcolina (AChRs) presentes em nervos e superficie dos músculos dos
nematódeos (MARTIN et al., 2005; ROBERTSON et al., 2000), causando paralisia
espástica nos parasitas (CHARVET et al., 2012; MARTIN et al., 1998). A ligação
desses grupos quimicos aos receptores de acetilcolina altera abertura dos canais iônicos,
promovendo a entrada exagerada de cálcio para as células musculares dos nematóides
(PUTTACHARY et al., 2010). O excesso de cálcio no citoplasma dessas células
induzem contrações contínuas (ROBERTSON et al., 2010) facilitando a expulsão do
parasita (KOLHER et al., 2001). Segundo Bogan e Armour (1987) são larvicidas,
porém perdem eficácia sobre larvas em hipobiose.
A resistência ao levamisol, morantel e pirantel, segundo Prichard (2008) pode ter
ocorrido em virtude de modificações nos receptores nicotínicos. Kohler et al. (2001)
sugere que cepas resistentes ao levamisol possuem uma menor resposta contrátil que
cepas sensíveis, podendo ser explicado por um menor tempo de abertura dos canais
iônicos.
Lactonas macrocíclicas
O modo de ação das avermectinas (ivermectina) e milbemicinas (moxidectina) incluem
paralisia flácida por aumentar a permeabilidade das células musculares dos nematódeos,
mediada pela ligação entre o anti-helmíntico e receptores GABA que promovem a
abertura dos canais de cloro (MARTIN et al., 1999). Outro efeito é a inibição da
alimentação pelo parasita em decorrencia do bloqueio da bomba faríngea (GEARY et
28
at.,1993). Em um estudo realizado com H.contortus, Paiement et al., (1999) sugeriram
que o bombeamento da faringe é inibido pelo glutamato. Sangster (1996) relata haver
diferenças na ingestão de alimentos em resposta a ação da ivermectina entre cepas
resistentes e susceptíveis. Os anti-helmínticos dessa classe agem contra nematódeos
adultos e em larvas em hipobiose (BOGAN e ARMOUR, 1987).
Os mecanismos de desenvolvimento da resistência as avermectinas, ainda não é
completamente entendido, porém sabe-se que essa resistência está associada a vários
genes, e estes parecem codificar subunidades especificas presentes no músculo
faringeais e não faringeais dos canais de cloro com o portão glutamato (KOHLER et al.,
2001).
Os mecanismos pelos quais os parasitos desenvolvem resistência frente à exposição às
macrolactonas parecem estar associados à: (a) alteração de conformação dos canais de
cloro; e (b) expressão da proteína de membrana conhecida como glicoproteína-P (P-gp).
A P-gp atua como uma bomba de efluxo em diversos tipos celulares e está envolvida na
regulação da concentração de anti-helmínticos dentro das células. Assim, a P-gp pode
reduzir a concentração intracelular destas macrolactonas favorecendo a seleção de
nematódeos mutantes. Nas cepas de H. contortus resistentes a ivermectina e
moxidectina, se observou a ligação destes medicamentos a P-gp, permitindo maior
efluxo destes produtos e, conseqüentemente, diminuição da sua concentração no interior
das células do sistema nervoso do parasito (LESPINE et al., 2008; LE JAMBRE et al.,
2000; LANUSSE et al., 2008).
Estudo realizado por Xu et al. (1998) mostrou a alta expressão de glicoproteina A em
cepas de H. contortus resistentes a ivermectina. Outro estudo realizado por Prichard;
Roulet (2007) mostraram que tratamentos com ivermectina e moxidectina selecionaram
a expressão de cinco glicoproteinas (A, B, C, D e E) em larvas adultas de Haemonchus
sp.
29
Salicilanilidas
O mecanismo de ação das salicilanilidas inclue paralisia epástica por promover o
aumento de íons de cálcio nas celulas musculares dos parasitos. Este grupo quimico
atuam sobre parasitas hematófagos, reduzindo as reações mitocondriais envolvidas no
transporte de elétrons e assim a sintese de ATP. O meccanismo de resistência ainda não
foi bem esclarecido (SPINOSA et al., 2011).
5. Resistência anti-helmíntica (RA)
5.1. Problemática da resistência
Os parasitos gastrintestinais causam grandes perdas econômicas, devido à redução da
produtividade, aumento da mortalidade dos animais, além de gastos com antihelmínticos e mão-de-obra. Desta forma, as infecções por NGIs são as maiores
limitações na criação de pequenos ruminantes, e o controle dessas parasitoses e suas
consequências representam cerca de 30% com gastos com anti-helmíntico (IFAH
Relatório Anual, 2009; http//:www.ifahsec.org).
A utilização inadequada dos anti-helmínticos para a profilaxia de infecções NGIs pode
favorecer o estabelecimento de populações de parasitas resistentes (GETACHEW et al.
2007) e de acordo com Conder e Campbell (1995) a RA é entendida como a
diminuição de sensibilidade da ação de um medicamento dentro de uma população de
parasitas, sobrevivendo apenas os parasitas resistentes ao medicamento.
30
A manutenção da pressão de seleção levará a morte de parasitas sensíveis,
sobrevivência das espécies mais resistentes numa determinada população e consequente
contaminação das pastagens com larvas resistentes (PAPADOPOULOS, 2008). No
entanto, a resposta dos nematódeos aos tratamentos anti-helminticos está associada à
diversidade genética do parasito e algumas espécies, como Haemonchus contortus,
apresentam uma alta diversidade genética, permitindo a rápida seleção de parasitos
resistentes, que transmite os alelos responsáveis pela resistência à sua progênie
(PRICHARD, 2001).
5.2. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vivo
O teste de redução na contagem de ovos nas fezes (TRCOF) é o teste mais utilizado
para o diagnóstico da RA in vivo devido sua fácil aplicabilidade (DEMELER et al.,
2010). Este teste se baseia na porcentagem de redução da contagem de ovos nas fezes
antes e após tratamento com anti-helmíntico. No mapa é mostrada a situação da
resistência antihelmintica em alguns estados do Nordeste Brasileiro.
Figura 2: Situação da resistência anti-helmíntica no Nordeste Brasileiro
(Fonte : http://www.redebrasileira.com/mapas/regioes/nordeste.asp).
31
A resistência de nematódeos aos diversos anti-helmínticos está presente nos rebanhos de
caprinos brasileiros. No Estado da Bahia, Barreto et al. (2005) verificaram que os
caprinos de corte da região semiárida apresentaram resistência múltipla às principais
bases químicas da anti-helmínticos, com variação de eficácia de 17% a 100% para
ivermectina, de 0% a 97% para albendazole, de 66% a 100% para levamisole e de 0% a
100% para abamectina.
Lima, M. et al. (2010) avaliaram a eficácia de produtos anti-helmínticos à base de
moxidectina, ivermectina, albendazole e levamisole em propriedades de criação caprina
em sistemas semi-intensivo e intensivo no estado de Pernambuco, encontrando
percentuais eficácia de 11 e 61 %, 14 e 76% e 67 e 89% nos rebanhos tratados com
albendazole, ivermectina e levamisole, respectivmente, enquanto a moxidectina a 1%
foi a única recomendada por apresentar percentuais indicativos de eficácia.
No levantamento sobre a resistência anti-helmíntica em rebanhos caprinos no Estado do
Ceará, Vieira e Cavalcante (1999) constataram que sete (20,6%) apresentaram
resistência aos imidazotiazóis, seis (17,6%) aos benzimidazóis e a resistência múltipla
foi notada em 12 (35,3%) rebanhos. Neste mesmo Estado, Melo et al. (2003) confirmou
a ocorrência de resistência aos anti-helmínticos em propriedades comerciais de criação
de caprinos, com 87,5% de nematódeos resistentes ao oxfendazole, 75% ao levamisole e
37,5% à ivermectina.
Em Mossoró, no Rio Grande do Norte, Coelho et al.(2010) demonstraram que os
rebanhos caprinos criados extensivamente apresentavam 90% de resistência antihelmíntica ao albendazole contra 43,3% da ivermectina. A redução na contagem de
ovos nas fezes (TRCOF) pós-tratamento mostrou variação na sua eficácia de 43% a
100% para ivermectina e 29% a 100% para albendazole.
32
A eficiência do albendazole, ivermectina e moxidectina foram avaliadas por meio de
coletas de fezes realizadas antes e pós-tratamento em caprinos da zona da mata do
Estado de Alagoas, no qual foi verificada variação no 7º, 14º e 21º dia pós-tratamento
da eficácia de 97,89%, 71,2% e 80%, para albendazole, respectivamente, 98,74%,
88,3% e 87% para ivermectina e de 83,6%, 96% e 96,3% para moxidectina (AHID et
al., 2007).
Chagas et al. (2013) avaliaram o grau de resistência do Haemonchus (isolado Embrapa
2010), por meiodo teste de redução da contagem de ovos nas fezes (TRCOF),
constatando que este isolado ovino mostrou-se sensivel ao triclorfon, closantel e
levamisole com percentual de redução de ovos nas fezes superiores a 90% apartir do 7º
dia pós tratamento, no entanto múltipla resistência foi revelado pela baixa eficácia aos
tratamentos com albendazole (-26%), ivermectina (12%) e moxidectina (88%).
Thomaz-Soccol et al. (2004) estimaram uma alta prevalência de resistência aos antihelmínticos no estado do Paraná de 88,1%, 78,6% e 56,4%, respectivamente, para o
benzimidazois, ivermectina e closantel.
5.3. Detecção da Resistência anti-helmíntica por ensaios in vitro
Nos últimos 30 anos, foram produzidos vários testes in vitro para a detecção de
resistência (Taylor et al., 2002). Os testes in vitro têm mostrado eficiência para detecção
do desenvolvimento de resistência anti-helmíntica (VARADY et al. 1999), isso devido
há não interferência do hospedeiro no estabelecimento da infecção pelo parasita. Além
disso, apresentam vantagem de facilidade de execução, baixo custo e rapidez
(MACEDO et, al 2009). Entre os testes in vitro utilizados para a avaliação da atividade
anti-helmíntica destacam-se os testes de inibição da eclosão de ovos, do
desenvolvimento larvar e da migração larvar.
33
Teste de eclosão de ovos (TEO)
Este teste pretende avaliar o desenvolvimento de ovos após a incubação com produtos
com ação ovicidas (COLES et al., 1992).
Várady et al. (2007) testaram isolados resistentes e sensíveis de H. contortus aos BZs,
constataram que em todos os isolados sensíveis os valores de DE50 foram semelhantes
(< 0,05 µg/mL-1) enquanto que isolados resistentes variaram de 0.1 a 0.5 µg/mL-1.
Em estudo realizado em ovinos na Eslováquia por Várady et al. (2006) buscou-se
detectar a presença de resistência dos NGI aos benzimidazois por meio do teste de
eclosão de ovos, sendo detectados três rebanhos resistentes (EC50 > 0,1µg/mL de TBZ)
ao BZs sendo EC50 estimado em 0,190 µg/mL de TBZ.
Na Etiópia foi avaliada a susceptibilidade de H. contortus de ovinos aos antihelmínticos por inibição de eclosão de ovos. Foi observado que na concentração mais
alta (0.25µg/mL) as médias dos percentuais de inibição de ovos foram 84,90%, 78,77%,
76,66%, 78,89%, respectivamente, para ivermectina, albendazole, triclobendazole e
tetramisole. Os valores em µg/mL do CE50 variaram de 0,024 para albendazole, 0,039
para triclobendazole, 0,045 para tetramisole e 0,0355 para ivermectina (BELEW et al.,
2012).
Demeler et al. (2012) mediram a validação dos testes in vitro TEO e TML, detectando a
resistência anti-helmíntica dos NGI em rebanhos de bovinos leiteiros no Norte da
Alemanha. Foram comparados os resultados dos TRCOFs mostrados por Demeler et al.
(2009) com os resultados previamente obtidos dos Teste de eclosão de ovos e teste de
migração larval utilizando respectivamente os anti-helmínticos tiabendazol (TBZ) e a
ivermectina (IVM). No TEO foi achado CE50 de 0,027 a 0,038 µg / mL de TBZ, sendo
34
que no TRCOF com albendazole a eficácia foi de 100% mostrando susceptibilidade dos
nematódeos aos benzimidazois. Para a ivermectina a eficácia reduzida em algums
rebanhos pós-vermifugação, mostrou grandes variações no CE50 no TML, que
apresentaram valores de 124 a 929 nM no 7° e entre 525 e 924 nM no 14° dia para
larvas de Cooperia oncophora, o que indicou que o decréscimo na eficácia da
ivermectina pelo TRCOF foi correlacionada com o aumento do valor da CE50.
Teste de migração larvar (TML)
Este teste se baseia na exposição de larvas a diferentes concentrações de antihelmínticos com ação sobre motilidade das larvas (DEMELER et al. 2010).
El-Abdellati et al. (2010) relataram a resistência de nematódeos a lactonas macrociclicas
ao acompanharem novilhas durante quatro anos consecutivos. Para isso, utilizaram
TRCOF e TML. Larvas de C.oncophora resistentes (CoIVR07 e CoIVR08) a
ivermectina e moxidectina foram isoladas após os testes de redução da contagem de
ovos nas fezes e posteriormente avaliados pelo TML confirmando o potencial deste
testes para diferenciar isolados, nos quais altos valores de CE50 de 542 nM (CoIVR07)
e 698 nM (CoIVR08) foram encontrados para os isolados resistentes comparados ao
baixo valor (120nM) do isolado susceptivel(CoSusc).
Demeler et al. (2010) avaliou isolados resistentes e susceptíveis de larvas de Ostertagia
ostertagi, C. oncophora e H. contortus obtidos de infecçõoes experimentais de bovinos
e ovinos. Seis diferentes laboratórios distribuídos em cinco países utilizaram o mesmo
protocolo de TML para verificar a possibilidade de variações nos resultados. Para os
gêneros Cooperia e Haemonchus foi confirmada resistência dos isolados resistentes em
todos os laboratórios e estes isolados mostraram os maiores valores de CE50 de 886,4
35
nM para C.oncophora e de 7679 Nm para H.contortus, enquanto a CE para os
susceptíveis foi de 107nM para C.oncophora e de 914 nM para H.Contortus. Para o
gênero Ostertagia foram utilizadas apenas isolados susceptíveis que apresentou CE50
equivalente a 307 nM.
No Mato Grosso do Sul, Almeida et al. (2013) obteve a eficácia a ivermectina
empregando o TML em isolados de campo de Cooperia spp que infectava bovinos.
Os valores de CE50 encontrados variaram de 2,5 a 11,35 nM para os sete isolados de
campo resistentes.
Kotze et al. (2006) observou a sensibilidade TML por meio de combinação larvas
resistente (HcMOX-R) com larvas suscetíveis (Kirby) em três experimentos com
distintas proporções de larvas na detecção de resistência para H. Contortus. TMLs
também
foram
realizados
separadamente
com
populações
puras
de
larvas
(sensiveis/resistentes) para servir de comparação as populações mistas. Foram
mostrados neste experimento que populações mistas que continham proporções maiores
de indivíduos resistentes apresentavam percentuais superiores de migração.
Teste de desenvolvimento larvar (TDL)
Várady et al., (2007) avaliaram pelo teste de Desenvolvimento Larvar (TDL) a
resistência com isolados resistentes e susceptíveis de H.contortus aos benzimindazóis,
verificando que os isolados resistentes foram de 4,3 a 63,1 vezes mais tolerante ao
fármaco do que os isolados sensíveis.
36
Utilizando isolados BZs resistentes e susceptíveis de H.contortus, Bártiková et al.(2010)
compararam o flubendazole nesses isolados pelo TDL, sendo o tiabendazole utilizado
como anti-helmíntico de referência. Os valores da concentração letal de 50% da
população (CL50) para flubendazole (0,0039) foram menores quando comparados ao
tiabendazole (0,0051) para cepa de Haemonchus sensíveis ao BZs. O mesmo fato foi
observado nos isolados resistentes a BZs, onde o CL50 foi menor para flubendazole
(0,0109) do que para o tiabendazole (0,0190). Nesse estudo, o anti-helmíntico
flubendazole, mostrou-se mais eficaz em cepas resistentes de Haemonchus.
Sobre as larvas de C. oncophora e O.ostertagi resistentes e susceptíveis foram aplicados
TML e TDL, no qual pôde ser comprovada a capacidade de detectar e confirmar
resistência dessas larvas. Foram testados os anti-helmínticos ivermectina e tiabendazole
no TDL e ivermectina para TML. Quando utilizado o TBZ observaram que entre os
isolados de C. oncophora resistentes e susceptíveis não havia diferença significativa,
sendo seus respectivos EC50 de 0,0056 µg/mL e 0,0051 µg/mL no TDL. Utilizando a
IVM sob as mesmas larvas, foram observados maiores valores de EC50 (16,3 nM) tanto
no TDL quanto para o TML com EC50 de 621nM em larvas C. oncophora resistentes.
Todos os anti-helmínticos utilizados (IVM, TBZ e LEV) mostraram ter EC50 maiores
em larvas de O.ostertagi susceptíveis do que em C. oncophora susceptível (DEMELER
et al. 2010)
37
OBJETIVO
OBJETIVO GERAL
Testar a eficácia de benzimidazóis, lactonas macrocíclicas, levamisole e closantel para
nematoides de caprinos em região semiárida.
38
CAPÍTULO 1
_____________________________________________________________________
Resistência anti-helmíntica múltipla em rebanhos caprinos no bioma caatinga
Multiple anthelmintic resistence in goat herds in the caatinga biome
Simone Lopes Borges1, Mariana Borges Botura2, Hélimar G. de Lima1, Lívia Ribeiro
Mendonça1, Sabrina Mota Lambert1, Alex Aguiar de Oliveira1, Bárbara Maria Paraná da
Silva Souza1, Juliana Macedo Viana1, Sandra Mayumi Nishi1, Maria Angela Ornelas de
Almeida1.
1
Universidade Federal da Bahia (UFBA), Salvador, BA, Brasil; 2Universidade Estadual
de Feira de Santana, Feira de Santana, BA, Brasil.
Resumo
A utilização de anti-helmnticos por longos periodos como principal medida de controle
das parasitoses gastrintestinais, levou a ineficácia aos benzimidazois e lactonas
macrocíclicas. A capacidade de teste de eclodibilidade de ovos (TEO) e do teste de
migração Larval (TML) em condições de campo foi avaliada em populações naturais de
nematódeos de caprinos criados no bioma caatinga e o teste de redução na contagem de
ovos nas fezes (TRCOF). Os resultados indicaram baixa eficácia dos albendazole,
levamisole, ivermectina, moxidectina e closantel contra nematódeos gastrintestinais de
caprinos, o que caracteriza resistência múltipla.
Palavras-chave: Nematódeos; benzimidazole; avermectina; imidazotiazole; ruminante.
Abstract
The use of anthelmintic drugs for long periods as the main measure control of
gastrointestinal parasits has led to the inefficacy of benzimidazoles and macrocyclic
lactones. The ability Egg Hatch Inhibition Test (EHT) and Larval Migration inhibition
39
Test (LMT) were evaluated under field conditions in natural populations of goat
nematodes raised at caatinga bioma and the Faecal egg count reduction test (FECRT).
The
results
suggest
low
efficacy
of
albendazole,
levamisole,
ivermectin, moxidectin and closantel against goat GI nematodes characterizing
occurrence of multidrug resistance.
Key words: Nematodes; benzimidazole; avermectin; imidazothiazoles; ruminant.
Introdução
O bioma caatinga se distingue por médias de temperaturas elevadas, baixos índices de
pluviosidade, sendo a caprinocultura desenvolvida por pequenos e médios produtores,
em sistema de manejo extensivo. Como conseqüência verifica-se alteração na estrutura
biológica e ecológica da caatinga e interferência no o controle das parasitoses, uma vez
que a circulação dos animais favorece mudanças nas populações de parasitos com
introdução de cepas resistentes (SILVESTRE et al., 2002a, SILVESTRE et al. 2002b).
A complexidade do controle das helmintoses em pequenos ruminantes é cada vez maior
em consequência da resistência de nematódeos gastrintestinais (NGI) aos antihelmínticos. O alto índice de endemismo de nematódeos resistentes no bioma caatinga
tem modificado a dinâmica da produção caprina por maior parasitismo dos animais e
ineficiência do controle antiparasitário. No nordeste brasileiro a resistência de
nematódeos aos imidazotiazoles, benzimidazois e lactonas macrociclícas vem sendo
cada vez mais documentada (LIMA, M. et al., 2010; LIMA,W. et al., 2010; VIEIRA;
CAVALCANTE, 1999).
A resistência múltipla ocorre pela exposição dos parasitos aos vários grupos químicos e
como uma consequência da habilidade da população de trichostrongilídeos de se
adaptar. Os fatores que influenciam a seleção de populações resistentes incluem o uso
indiscriminado e excessivo de anti-helmínticos, a falta de biossegurança nas
40
propriedades, freqüente circulação de animais entre rebanhos e insuficientes
procedimentos de quarentena para os recém-chegados (HOWELL et al., 2008).
A resistência anti-helmíntica para caprinos ainda não é bem documentada mundialmente
ao contrário dos ovinos. Poucos estudos foram realizados com caprinos criados em
condições semiáridas, em pastagens comunais, e um número existentes destes estudos
foram desenvolvidos no nordeste brasileiro (LIMA, M. et al., 2010; LIMA,W et al.,
2010; PEREIRA et al., 2000; RODRIGUES et al., 2007) e na África (KUMSA;
ABEBE, 2009;WARUIRU et al., 1998).
Nos estudos a campo, o Teste de Redução da Contagem de Ovos nas Fezes (COLES et
al., 1992) é o mais amplamente empregado, obtendo-se resultados que indicam a
ocorrência de resistência parasitária múltipla em caprinos (ZAJAC; GIPSON, 2000). Os
testes de Eclosão de Ovos e de Desenvolvimento Larvar são frequentemente utilizados
para a detecção in vitro da resistência anti-helmíntica (VÁRADY et al. 2007), enquanto
o Teste de Migração Larvar em Ágar foi mais empregado para avaliação de extratos de
plantas em pequenos ruminantes (BOTURA et al., 2013,ALONSO-DÍAZ et al., 2008) e
em bovinos (ALMEIDA et al., 2013; DEMELER et al., 2012).
Outros métodos para detecção da resistência têm sido desenvolvidos, mas seu uso para
diagnóstico em caprinos a campo ainda não foi empregado, sendo este o primeiro
estudo, que avaliou a resistência parasitária de caprinos por meio de testes in vitro.
Outro objetivo foi verificar a resistencia pelo Teste de Redução da Contagem de Ovos
nas Fezes em rebanhos caprino do semiarido baiano.
Material e Métodos
O município de Cansanção, situado no bioma caatinga, com área de 1.324,9 km²,
apresenta tipos climático semiárido e árido, e médias anuais de temperatura e
41
precipitação pluviométrica de 23,6ºC e 477 mm, respectivamente (CPRM – Serviço
Geológico do Brasil, 2005).
Teste de Redução da Contagem de Ovos nas Fezes (TRCOF)
Foram entrevistados 100 caprinocultores familiares, sendo selecionados doze,
distribuídos em quatro áreas: Alto Lindo (rebanho 1), Morada Nova (rebanho 2), Nova
Vida (rebanho 3 a 9) e Belo Monte (rebanho 10 a 12), conforme o número mínimo de
animais disponíveis no rebanho para realização dos testes. Participaram do estudo 430
animais, sendo 10,7% machos e 89,3% fêmeas. De cada rebanho foram separados
aleatoriamente de 30 a 40 animais, sem raça definida, de seis a 18 meses, mantidos em
regime extensivo e infectados naturalmente por nematódeos gastrintestinais. Os animais
estavam em estado de higidez adequado e não foram tratados com anti-helmíntico por
no mínimo 60 dias antes do teste.
Apenas os animais com contagem de ovos por grama de fezes (OPG) superior a 200,
foram incluídos no experimento e distribuídos em grupos de oito a 10 indivíduos, para
tratamento com albendazole (ABZ) (5 mg/kg de peso vivo, via oral - Aldazol®/Vallée );
ivermectina (IMV) (0,2 mg/kg, via oral –Ivomec ovino®/Merial); levamisole (LEV) (5
mg/kg, oral - Ripercol®/Fort Dodge); moxidectina (MXD) (0,2 mg/Kg, via oral Cydectin/Fort Dodge) e closantel (10 mg/Kg-via oral-Diantel®/Irfa). Como não há
indicação na bula para tratamento em caprinos, usou-se a dose recomendada para
ovinos. Em um grupo de caprinos não se efetuou o tratamento, servindo como controle.
As amostras de fezes foram coletadas de cada animal no dia do tratamento e 14 dias
após, sendo processadas para contagem de ovos e de larvas de 3º estádio obtidas de
coproculturas (UENO; GONCALVES, 1998). A população de nematódeos é
considerada resistente quando a redução da contagem de ovos após o tratamento for
inferior ou igual a 90% (VERCRUYSSE et al., 2001)
42
Teste de Eclosão de Ovos (TEO), Coles et al. (1992) modificado por Chagas et al.
(2008)
Para a avaliação in vitro foram realizadas pool das amostras de fezes dos caprinos por
áreas.
As fezes obtidas diretamente da ampola retal de caprinos foram estocadas
anaerobicamente no período máximo de 24 h. A suspensão de ovos foi obtida por
homogeneização das amostras das fezes com água destilada e filtrada em tamis de 1
mm, 100, 55 e 25 µm e os ovos coletados na última malha e centrifugados a 1500 xg
durante cinco minutos (HUBERT; KERBOEUF, 1984). Ao sedimento adicionou-se
solução saturada de cloreto de sódio para centrifugação nas condições anteriores. O
sobrenadante foi filtrado no tamis de 25µm, lavado em água destilada para recuperação
dos ovos, e 2 mL da suspensão foi ajustada para 100 ovos/ 20µL.
As concentrações do tiabendazole foram avaliadas por experimentos pilotos, usando o
protocolo de von Samson-Himmelstjerna et al. (2009) modificado. Nos testes foram
usadas as concentrações de 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 e 0,8 µg tiabendazole (TBZ)/mL
e como controles água destilada e solução aquoso de dimetilsulfóxido (DMSO).
Para realização do teste foram utilizados 100 ovos/poço, sendo adicionado uma solução
de 0.5% de TBZ e 7% de meio nutritivo em um volume total de 2 mL. A preparação do
meio nutritivo foi baseado em Hubert; Kerbouef, (1992) e modificado por Bizimenyera
et al. (2006) com Escherichia coli liofilizada (ATCC 9637 Sigma). Foram feitas 10
repetições para cada concentração do TBZ e controles. Após a incubação das placas a
26 ºC em B.O.D., por 48 horas, foi acrescido gotas de lugol e os ovos e larvas de 1º
estádio foram contados de cada poço, utilizando o microscópio invertido.
A resistência é demonstrada quando a concentração efetiva (CE) para 50% de inibição
da eclosão (CE50) é superior a 0,1 µg/mL de TBZ (COLES et al., 1992).
43
Teste de Migração Larvar em Ágar modificado (TML), Molento; Prichard (2001)
As larvas 3º estádio (L3) obtidas das coproculturas do TRCOF foram desembainhadas
com solução de hipoclorito de sódio a 1,5%, durante 30 minutos, e em seguida lavadas
três vezes com solução aquosa centrifugando em 1500 xg por cinco minutos. As larvas
foram resuspendidas em solução tampão fosfato (PBS) 0,2M (pH7,4) e então
distribuídas em microplacas de 24 poços (400 larvas/0,5 mL/poço). A cada poço foi
adicionado o mesmo volume das diferentes concentrações de IVM ( 1; 5; 10; 50; 100;
500 e 1000 nM) (DEMELER et al., 2010), e como controle foi utilizado uma solução
de PBS com DMSO a 0,1%. A placa foi incubada a 26ºC em estufa B.O.D por seis
horas e após este período acrescido 1 mL de solução de ágar (1,4%) a 35ºC, sendo a
solução final (2mL) transferida para uma placa de Petri com um cilindro sobreposto a
duas telas de nylon, sendo que a menor tela possui abertura de 38 µm contendo água
destilada congelada. As placas foram novamente incubadas a 26°C, expostas a uma
fonte de luz incandescente (60 Watts) por 18 horas. As larvas que migraram do ágar
para a porção aquosa foram transferidas para um tubo tipo Falcon, centrifugadas a 1500
xg por cinco minutos. O sobrenadante foi descartado, mantendo-se um volume final de
2 mL da solução com as larvas. Para quantificação usou-se uma alíquota homogênea de
200 µL, sendo o número de larvas multiplicado por 10. Para cada concentração e
controle foram realizadas 10 replicatas.
Análise dos dados
Os resultados do OPG e do percentual de larvas obtidos no TRCOF foram analisados
pelo programa RESO 2.01 (CSIRO), para determinação dos percentuais de eficácia dos
anti-helmínticos.
44
O percentual de eficácia do TML foi calculado pela fórmula: E = [(Mc – Mtr)/Mc] x
100, onde Mc corresponde a média aritmética do número de larvas contada no grupo
controle, e Mtr é a média aritmética do número de larvas contadas no grupo tratado,
utilizando o Microsoft Excel software.
Os resultados in vitro (TEO e TML) foram comparados pelo teste ANOVA seguido
Tukey (5%). A CE50 (concentração efetiva), para ambos os testes, foi calculada por
análise de regressão não linear pelo programa GraphPrism, versão 5.0
Resultados e Discussão
Analisando o questionário respondido pelos produtores, verificou-se que a frequência
anual de desparasitação variou de um a quatro, que em 77 % dos rebanhos o vermífugo
é aplicado a todos os animais na mesma ocasião, e para isto, o peso dos animais é
estimado visualmente para cálculo da dosagem do medicamento por 100% dos
criadores. Também se constatou o uso mais frequente das avermectinas (72,7%), e
posteriormente os imidotiazóis e benzimidazois (54,5%).
Teste In Vivo
A resistência múltipla anti-helmíntica foi demonstrada em rebanhos caprinos do
município de Cansanção, Bahia. Os valores do OPG variaram de 560 a 1455 no grupo
controle, com média de 897,4, indicando, em geral, uma infecção moderada (Tabela 1).
As médias dos percentuais de eficácia dos rebanhos foram 33,3%, 29,6% e 54,6% para
ABZ, IVM e LEV respectivamente. Não houve diferença estatística entre as médias de
OPG dos animais dos grupos controle e tratado, e os diferentes anti-helmínticos e as
áreas.
45
Tabela 1. Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos e percentuais de
eficácia de anti-helmínticos por áreas do município de Cansanção.
OPG
Áreas Rebanho
Controle
Alto
Lindo
Morada
Nova
Albendazole
Eficácia
OPG
(%)
Ivermectina
Eficácia
OPG
(%)
Levamisole
Eficácia
OPG
(%)
1
1411
664
53
968
31
-
-
2
815
517
37
400
51
-
-
Nova
Vida
3
4
5
6
7
8
9
685
831
785
830
1320
1455
595
461
750
67
842
1028
1100
1413
33
0
92
0
22
24
0
360
1219
195
619
737
2185
1046
47
0
75
25
44
0
0
61
286
312
2233
422
600
450
91
66
60
0
68
59
24
Belo
Monte
10
11
12
851
631
560
897,4
317
356
389
658,7
63
44
31
33,3
730
444
345
770,7
14
30
38
29,6
747
143
560
581,4
12
77
89
54,6
Média
A resistência de NGI ao ABZ foi observada em todas as áreas, e apenas um rebanho
apresentou redução da contagem de ovos de 92%, porém, o limite inferior do intervalo
de confiança a 95% foi 55%, o que indicou resistência. A ineficácia do anti-helmíntico
albendazole ocorrido nesse estudo foi condizente com os resultados de Lima, W. et al.
(2010), onde rebanhos caprinos da região do Cariri Paraibano, obtiveram baixas
eficácias pós-tratamento durante o período seco. Quando Melo et al. (2009) utilizou a
dose duplicada do produto obteve uma média de eficácia de 68,4 % para oxfendazole,
diferindo da eficácia obtida do TRCOF em Cansanção (33,3%). Este resultado também
diverge de estudo prévio de Ahid et al. (2007) na Zona da Mata em Alagoas, no qual,
encontraram sensibilidade para o ABZ no 7° dia pós vermifugação. Embora os estudos
tenham sido desenvolvidos em rebanhos na região nordeste, deve-se considerar que a
46
taxa de desenvolvimento da resistência parasitária aos anti-helmínticos varia
geograficamente (LEIGNEL e HUMBERT, 2001; SAEED et al., 2010).
Em relação à ivermectina, verificou-se em 83,3% dos rebanhos eficácia inferior a 50%.
Uma das possíveis justificativas para esses resultados é o fato de que a maioria (72,7%)
dos animais eram frequentemente tratados com ivermectina, conforme informações
obtidas dos produtores. Diferentemente, em outra área do nordeste brasileiro, de 30
rebanhos caprinos amostrados, somente um, teve o percentual de redução do OPG de
43%, nos demais o percentual de eficácia foi superior a 56% (COELHO et al., 2010 ).
Na análise dos estudos realizados com caprinos no semiárido paraibano pode-se
perceber a evolução da redução da eficácia do levamisole, uma vez que Rodrigues et al.
(2007) verificaram eficácias superiores a 94,2%, qualificando os nematódeos como
moderadamente sensíveis, e posteriormente, Lima, W. et al. (2010) registraram no
mesmo Estado, a eficácia de 79% no período seco e 69% no período chuvoso. Nos
rebanhos dos assentamentos Nova Vida e Belo Monte, as médias de eficácia foram de
52,6% e 59,3%, respectivamente, o que indica essa tendência à resistência.
A moxidectina e closantel foram testados na última área (Belo Monte), em virtude da
ineficácia dos demais anti-helmínticos testados (Tabela 2). As eficácias a MXD foram
69%, 80% e 97%, deste modo, apenas um dos três rebanhos foi encontrado NGI
suscetível. Em Pernambuco, Lima, M. et al. (2010) registraram que a MXD não atingiu
o nível necessário indicativo de eficácia, que foi de 91% em rebanhos caprinos. No
entanto, Rodrigues et al. (2007) descreveram que nas fêmeas caprinas tratadas com
MXD por via oral, os percentuais de eficácia foram de 92,8, 88,7 e 89,8 aos 7, 14 e 21
dias após o início do tratamento, respectivamente, e nos machos de 92,6, 96,2 e 98,1.
No nosso estudo coletamos as amostras de fezes no 14º dia do tratamento, sendo a
maioria fêmea, o que confirmam estes resultados.
As maiores eficácias encontradas neste estudo para a MDX, apesar de não totalmente
efetivas, podem ser esclarecidas pelo menor uso deste grupo químico ou por seu perfil
47
farmacocinético, mais lipofílica do que outros endectocidas e maior biodisponibilidade
no organismo animal, o que explica a maior área sob a curva de concentração
plasmática como descrito por Lespine et al. (2012). A redução da contagem de ovos nas
fezes de caprinos tratados com ivermectina foi muito baixa. A IVM e MXD estão na
mesma classe de anti-helmíntico (avermectina-milbemicina), mas a maior potência de
MXD produz elevada eficácia in vivo contra parasitas resistentes a ivermectina em
caprinos (HOWELL et al., 2008), embora estes autores destaquem que a resistência é
uma característica da classe do medicamento e não do fármaco específicamente.
Foi evidenciada ainda a ocorrência da resistência ao closantel nas três propriedades de
Belo Monte, com eficácias de 0%, 63% e 85%. Este produto também não foi eficaz
contra T. colubriformis e H. contortus de ovinos (ALMEIDA et al., 2010).
Tabela 2. Médias das contagens de ovos nas fezes (OPG) de caprinos e percentuais de
eficácia da moxidectina e closantel na área de Belo Monte do município de Cansanção.
Área
Belo Monte
Média
Rebanho
Moxidectina
OPG
Closantel
Controle
OPG
Eficácia (%)
OPG
Eficácia (%)
10
851
260
69
932
0
11
631
21
97
231
63
12
560
111
80
85
85
681
131
75
416
49
Apesar de não haver diferença estatística entre os níveis de resistência de NGI entre as
áreas estudadas, percebe-se que estas foram mais semelhantes entre os rebanhos mais
próximos, como observado por CALVETE et al. (2012), onde auto correlação espacial
positiva para resistência parasitária foi encontrada entre os rebanhos localizados dentro
de 30 km. O sistema de manejo semelhantes entre os produtores, assim como o uso dos
mesmos grupos de anti-helmínticos e práticas similares de frequência e via de
administração dos fármacos pode ser uma razão para justificar nossos resultados.
48
Entre outros pontos a serem destacados, vale ressaltar o modelo de produção da região
semiárida, o qual é predominantemente extensivo com os animais, sendo criados em
pastagens comunais. Embora se acredite que este sistema exerça uma menor pressão de
seleção sobre cepas de parasitos (CALVETE et al., 2012), neste estudo este fato não foi
observado. Associado a isto, a movimentação de animais entre as áreas por pastejo ou
compra e venda, provavelmente favoreça a circulação e estabelecimento de parasitos
resistentes (SILVESTRE et al., 2002).
Para o gênero Haemonchus, a eficácia foi baixa entre os medicamentos testados,
constatando-se apenas em um rebanho a eficácia de 98% para o albendazole, e em outro
de 95% para ivermectina (Tabela 3). Em relação ao gênero Trichostrongylus, existiu a
resistência para os diferentes grupos químicos, com baixos níveis de eficácia para a
ivermectina, seguido do albendazole e levamisole. Poucas larvas do gênero
Oesophagostomum, foram observadas nas coproculturas, por este motivo não se
analisou a eficácia.
Tabela 3. Eficácia (%) do albendazole, levamisole, ivermectina para os gêneros
Haemonchus e Trichostrongylus de caprinos.
Haemonchus
Áreas
Trichostrongylus
Frequência
ABZ
LEV
de larvas
Frequência
de larvas
ABZ
LEV
IVM
91,9
98
-
65
8,1
2
-
1
Morada Nova
79,3
61
-
95
20,7
39
-
5
Nova Vida
66,7
27,1
2,9
15,7
33,2
72,9
86,6
81
Belo Monte
6,5
11,3
3,3
34
93,5
88,7
96
66
Alto Lindo
IVM
ABZ= albendazole; LEV= levamisole e IVM= ivermectina
Estes resultados revelam a dificuldade da indicação de medicamentos anti-helmínticos
para controle de nematódeos gastrintestinais de caprinos, visto o desenvolvimento da
49
resistência dos nematódeos mais frequentes na região para os três principais grupos
químicos.
Estes eventos sinalizam que a prática do uso contínuo de várias bases químicas, diversas
vezes por ano, e a subdosagem, têm proporcionado à seleção de nematódeos resistentes
(CALVETE et al., 2012; KUMSA e ABEBE, 2009). A subdosagem pelo emprego de
doses recomendadas para ovinos é evidentemente praticada, uma vez que poucos
registros de medicamentos anti-helmínticos discrimina o caprino (RINALDI et al.,
2012). A comparação da exposição à endectocidas entre caprino e ovino, mostrou que
existem particularidades das espécies em termos de cinética dos anti-helmínticos, e esta
diferença é devido a menor biodisponibilidade em caprinos, por maior capacidade de
biotransformação, quando comparado a outras espécies (LESPINE et al., 2012). Porém,
quando a dosagem foi ajustada para 0,3 mg/kg de ivermectina, via oral, em caprinos,
constatou-se a ausência de resistência (PARAUD et. al., 2010).
Teste de eclosão de ovos (TEO)
A inibição da eclosão de ovos variou de 9,4% a 99% nos rebanhos das diferentes áreas.
Apenas na maior concentração de tiabendazole (0,8 µg/mL), foi observada eficácia
superior a 95%, com exceção das amostras oriundas dos caprinos de Nova Vida. As
duas maiores concentrações do anti-helmíntico foram associadas (p <0,05) a elevação
das percentagens de inibição da eclosão de ovos como mostrado no gráfico 1.
Avaliando as áreas, observou-se maiores percentuais de inibição de eclosão nas quatro
maiores concentrações do TBZ para Alto Lindo, sugerindo uma possível menor
resistência. As médias de inibição dos controles variaram de 8,8 ± 1,3 a 9,8±1,3
(Gráfico 1). Não foram observadas diferenças estatísticas entre controles das diferentes
áreas.
50
Gráfico 1. Média e desvio padrão do percentual de inibição, por tiabendazole, da
eclosão de ovos de nematódeos gastrintestinais de caprinos entre as áreas Alto Lindo,
Morada Nova, Nova Vida e Belo Monte.
a ab a
b
a
a
b
b
a
b
a
b
c c
a
a
b
a
b
c
a
a
b
c
c
b
b
b
Letras diferentes nas colunas indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
A CE50 para TEO variou de 0,3 a 0,5 µg/mL (Tabela 5). Considerando que, a
concentração efetiva para 50% de inibição da eclosão é superior a 0,1 µg/mL de TBZ
(COLES et al., 1992), observa-se que 100% dos rebanhos apresentaram resistência antihelmíntica ao TBZ, e o mesmo foi constatado no TRCOF. Estes resultados se
assemelham ao de Maingi; Bjørn; Dangolla (1998), quando verificaram que na maioria
das propriedades caprinas (90%) declaradas resistentes ao BZs pelo TRCOF, os valores
da CE 50 foram superiores a 0,1µg/mL de TBZ. Vale ressaltar que, a concentração de
0,3µg/mL de TBZ no TEO, pode ser considerada o limiar da dose discriminante para H.
contortus (VÁRADY et al., 2006).
Teste de migração larvar (TML)
As médias dos percentuais de migração das larvas variaram de 28,2 a 85,4 nas
diferentes áreas (Gráfico 2). O percentual do controle diferiu estatisticamente de todas
51
as concentrações de ivermectina, com o menor percentual de 92,2±4,5. Uma análise dos
resultados permite observar uma resposta dose dependente, exceto na concentração 50
nM da área de Nova Vida. Foi notado entre áreas que a partir da concentração 100 nM,
houve uma diminuição do percentual de migração, entretanto, de modo geral não houve
diferença estatística. A eficácia foi baixa em todas as concentrações (Tabela 3).
Em relação a CE50, houve uma variação expressiva entre os locais (Tabela 4), mas em
áreas próximas, como Alto Lindo e Morada Nova, as CE50 foram mais altas do que
para Nova Vida e Belo Monte. Este fato pode está relacionado com a presença de
infecções mistas de NGI encontradas no campo. Conforme Kotze et al. (2006), o TML é
um ensaio útil para monitorar no campo situações onde há predominância de H.
contortus, pois áreas nas quais o T. colubriformis são mais ocorrentes o teste tem seu
uso limitado.
Gráfico 2: Média e desvio padrão do percentual de migração de larvas de nematódeos
gastrintestinais de caprinos após incubação com ivermectina.
Letras diferentes nas colunas indicam diferença estatisticamente significativa (p<0,05).
52
Os valores de CE50 variaram entre os estudos, de 0,34 a 0,5 µM e de 0,8 a 2,6 µM para
isolados de H. contortus suscetíveis e resistentes a IVM, respectivamente (GILL et al.,
1991). Por outro lado, a concentração de 4 µM para IVM foi estimada para CE50 contra
cepas selecionadas de H. contortus para IVM (IVF17), sendo a eficácia de 55%
(MOLENTO e PRICHARD, 2001).
Também foi demonstrado por DEMELER et al. (2012) que a concentração de IVM
adequada para populações mistas de parasitos variou de 0,5 a 50 µM, e valores CE50
obtidos de vários animais em único rebanho e área variaram consideravelmente (199 a
283 nM). No Brasil, as CE50 obtidas de sete isolados de campo de Cooperia spp
resistentes a IVM foram de 2,5 a 11,35 nM (ALMEIDA et al., 2013).
Tabela 4. Percentuais de eficácia da ivermectina pelo Teste de Migração Larvar, por
áreas do município de Cansanção.
Concentrações
(nM)
1
5
10
50
100
500
1000
% de Eficácia
Alto Lindo
Morada Nova
Nova Vida
Belo Monte
10
11
12
25
40
56
68
21
25
33
47
48
52
72
21
28
38
66
47
57
55
21
27
27
51
56
61
62
O coeficiente de determinação (R2) para tiabendazole e ivermectina das curvas de doseresposta, variaram de 0,59 a 0,89 e 0,56 a 0,94 respectivamente. Com população mista
de NGI a curva de melhor qualidade foi obtida em Alto Lindo para ambos os antihelmínticos, provavelmente em virtude do maior frequência de larvas de Haemonchus
nos cultivos e os valores de R2de 0,94 (TBZ)e 0,89 (IVM), o certifica a qualidade da
curva dose-resposta. Para isolados de Cooperia sp., no Brasil, a média de R2 foi 0,83
(0.74–0.87) (ALMEIDA et al., 2013).
53
Tabela 5. Concentração efetiva (CE50) de thiabendazole para o Teste de Eclosão de
Ovos e CE50 e coeficiente de determinação (R2) para ivermectina para o Teste de
Migração Larvar.
Tiabendazole (µg/mL)
Áreas
Ivermectina (nM)
R2
CE50
R2
Alto Lindo
CE50
0,30
0,94
181,5
0,89
Morada Nova
0,47
0,85
132,9
0,59
Nova Vida
0,50
0,83
16,2
0,81
Belo Monte
0,48
0,56
46,6
0,82
A comparação entre os valores de CE50 pelo TML para IVM e os dados da eficácia do
TRCOF gerou uma razoável correlação entre os isolados de H. contortus (GILL et al.,
1991), no atual estudo, também confirmamos a resistência para IVM pelo TRCOF e a
baixa eficácia pelo TML. Estes resultados apresentam a possibilidade de utilizar o TML
para avaliar a eficácia da ivermectina com populações mistas de NGI oriundas do
campo, no qual exista predominância do gênero Haemonchus como citado por Kotze et
al. (2006).
Os resultados do TRCOF e dos testes in vitro foram comparáveis em estudo a campo
(DEMELER et al., 2012). No presente estudo encontraram-se níveis elevados de
resistência de NGI de caprinos, predominantemente infectados pelos generos
Haemonchus e Trichostrongylus, ao ABZ, LEV, IVM, MXD e CLS. No entanto, outros
estudos utilizando isolados de nematódeos susceptíveis e resistentes, são necessários
para definição do ponto de corte para resistência aos anti-helmínticos com populações
naturais.
54
Conclusão
Nematódeos resistentes aos benzimidazois, lactonas macrociclicas, levamisole e
closantel foram encontrados em rebanhos caprinos em região semiárida em teste in vivo
e in vitro, e a alta frequência de resistência foi registrada em diferentes áreas de estudo.
Agradecimentos
A FAPESB (Edital PRONEN) pelo financiamento da pesquisa e a CAPES pela bolsa de
mestrado concedida.
55
Referências bibliográficas
AHID, S.M.M.; CAVALCANTE, M.D.A.; BEZERRA, A.C.D.S.; SOARES, H.S.;
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CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os resultados deste estudo indicaram que rebanhos caprinos do município de
Cansanção, Bahia apresentaram baixos níveis de eficácia indicando resistência múltipla
aos benzimidazois, lactonas macrocíclicas, levamisole e closantel.
A alta frequência de vermifugação, a via de administração do fármaco, a estimativa
visual do peso de animais, a utilização de subdosagens, o uso prolongado dos mesmos
grupos químicos podem ter sido os principais fatores que propiciaram a circulação e
estabelecimento de parasitas resistentes.
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