ARTIGO DE REVISÃO
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Abordagem genética da resistência anti-helmíntica em Haemonchus
contortus
Genetic approach of anthelmintic resistance in Haemonchus contortus
Ana Carolina Fonseca Lindoso Melo* e Claudia Maria Leal Bevilaqua
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias-Universidade Estadual do Ceará, Av. Paranjana,
1700 Itaperi CEP 60740-000, Fortaleza, Ceará, Brasil
Resumo: A resistência a anti-helmínticos é relatada em várias
partes do mundo. Haemonchus contortus é o mais prevalente nematóide nos diversos relatos de resistência. Assim sendo, uma
revisão é apresentada sobre resistência anti-helmíntica principalmente em H. contortus. Atenção particular é dada ao desenvolvimento genético da resistência, diferenças fisiológicas entre
parasitos resistentes e sensíveis, diversidade genética em H. contortus, mecanismos de resistência às drogas, e o diagnóstico da
resistência utilizando técnicas de biologia molecular.
Palavras-chave: Haemonchus contortus, ovino, caprino, resistência, anti-helmíntico.
Summary: Anthelmintic resistance is reported in many parts of
the world. Haemonchus contortus is the most prevailing nematode recorded in several reports about resistance. Therefore, a
review is presented on anthelminthic resistance concerning in
H. contortus. Particular attention is given to genetic development resistance, physiological differences among resistant and
sensible parasites, genetic diversity in H. contortus, resistance
mechanisms drugs, and the diagnosis by using of molecular biology techniques.
Key-words: Haemonchus contortus, sheep, goat, resistance, anthelmintic.
Introdução
O parasitismo por nematóides gastrintestinais causa
menor eficiência na cadeia produtiva de pequenos ruminantes (Coop e Kyriazakis, 2001) pois provoca diminuição na produção de carne, leite, além de elevada
mortalidade do rebanho no período chuvoso (Pinheiro
et al., 2000). O controle de nematóides gastrintestinais
é largamente baseado no uso supressivo e terapêutico
de anti-helmínticos (Charles et al., 1989). Falhas neste
tipo de controle são o primeiro sinal do aparecimento
de resistência anti-helmíntica (Sangster, 2001).
*Correspondência: Av. Visconde do Rio Branco, 3350 CEP:
60055-172, Fortaleza-CE. Telefone: 51 85 3101.9853; FAX: 51
85 3101.9840; e-mail: [email protected]
Dentre os ruminantes, a resistência anti-helmíntica
tem maior prevalência entre os nematóides de ovinos
e caprinos. Este fato pode ser explicado em parte pela
maior freqüência de tratamentos e ainda por diferenças
fisiológicas entre pequenos e grandes ruminantes (Geary et al., 1999).
O primeiro relato de resistência a anti-helmínticos
utilizados contra nematóides gastrintestinais de ovinos
foi com o tiabendazol (Drudge et al., 1964). Este problema disseminou-se pelo mundo inteiro (Waller et al.
1995; Waller et al., 1996; Chartier et al., 1998). Contudo, ocorre geralmente em áreas com verões chuvosos
e onde o parasito H. contortus é endêmico, principalmente Austrália, África do Sul e América do Sul (Waller et al., 1995).
A primeira manifestação da resistência em uma população de nematóides é o aumento de indivíduos capazes de sobreviver a uma dose de anti-helmíntico que
seria letal para a maioria dos nematóides de uma população sensível da mesma espécie. O aumento de resistência é o resultado de trocas gênicas causadas pelo
cruzamento daqueles que sobreviveram a exposição à
droga (Echevarria, 1996). Os organismos resistentes
passam os seus alelos para os seus descendentes. A
freqüência e intensidade do tratamento, aliada a maior
ou menor disseminação dos alelos para resistência na
população de parasitos, determinam a taxa de seleção
da resistência (Prichard, 2001).
Os nematóides ditos resistentes apresentam diferenças quando comparados com os sensíveis. Algumas
características relacionadas com a patogenicidade são
mais pronunciadas (Hennon, 1993). Essas disfunções
podem ser letais em alguns parasitos (Prichard, 2001).
O parasito abomasal, H. contortus, é o maior responsável pelo rápido desenvolvimento da resistência em
nematóides de pequenos ruminantes (Sangster, 2001),
provavelmente, devido ao seu alto potencial biótico
(Echevarria e Trindade, 1989), grande variabilidade
genética e por albergar o alelo que causa a diminuição da susceptibilidade a uma droga (Blackhall et al.,
1998).
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Melo, A.C. e Bevilaqua, C.M.
Mecanismos de resistência às drogas
Os mecanismos de resistência podem ser específicos ou sem especificidade. Os mecanismos específicos
estão associados à ação da droga anti-helmíntica, enquanto os outros se referem a alterações no receptor da
droga ou na modulação da concentração do fármaco
(Wolstenholme et al., 2004).
Os anti-helmínticos benzimidazóis (BZ) ligam-se a
tubulina alterando o equilíbrio tubulina/microtúbulo
(Lacey, 1988). Microtúbulos são organelas citoplasmáticas que movimentam o cromossomo durante a
divisão celular e partículas celulares, formam o citoesqueleto da célula (Martin, 1997). Acredita-se ainda que
a modulação da concentração da droga mediada pelas
p-glicoproteínas no receptor alvo pode ser um outro
potencial mecanismo de resistência (Kerboeuf et al.,
2003), assim como acontece para as lactonas macrocíclicas. As p-glicoproteínas são proteínas transmembranárias que têm um papel protetor contra xenobióticos
potencialmente tóxicos ingeridos na dieta (Schwab et
al., 2003). Estas proteínas que são produtos do gene
MDR1, aparentemente removem seus substratos da
dupla camada de lipídeos da membrana para o espaço
extracelular, agindo como bombas de efluxo de xenobióticos (Molento e Prichard, 1999).
Estudos de populações de H. contortus resistente e
sensível aos benzimidazóis indicaram a existência de
diferenças específicas do DNA genômico destas populações (Roos et al., 1990). Kwa et al. (1994) demonstraram que a resistência aos benzimidazóis envolve
uma mutação no aminoácido 200 e 167 (Silvestre &
Cabaret, 2002) (Fenilalanina/Tirosina) do gene isotipo
1 ß-tubulina, que parece ser o maior implicado no mecanismo da resistência anti-helmíntica aos benzimidazóis.
As lactonas macrocíclicas, avermectinas e milbemicinas, interagem seletivamente e com alta afinidade
com os canais cloreto com portão glutamato (Arena et
al., 1991; Arena et al., 1992). O fluxo de íons cloreto nos neurônios presumivelmente causa a paralisia e
morte de nematóides e artrópodes. Os íons cloreto carregados negativamente hiperpolarizam o potencial de
repouso do neurônio resultando em inibição e paralisia
do organismo (Shoop et al., 1995). Todas as informações disponíveis até o presente momento indicam que
as milbemicinas têm o mesmo modo de ação que as
avermectinas (Shoop et al., 1993; Arena et al., 1995).
Determinados genes que codificam proteínas envolvidas no transporte ou metabolismo podem ser causa
da resistência apesar de não desempenharem qualquer
papel no mecanismo de ação da droga (Prichard e Tait,
2001). O primeiro gene associado com a resistência as
lactonas macrocíclicas em H. contortus codificava a
P-glicoproteína-A (Blackhall et al., 1998). A eficácia
da ivermectina e moxidectina contra parasitos selecionados resistentes a essas drogas foi substancialmente
aumentada, em animais experimentalmente infectados,
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após utilização de anti-helmínticos associados com
agentes reversores de resistência múltipla (Molento e
Prichard, 1999).
O levamisol atua sobre receptores musculares nicotínicos da acetilcolina nos nematóides causando paralisia espástica, ou seja, excitatória (Levandoski et al.,
2003).
Estudos in vitro com levamisol sobre H. contortus e
T. colubriformis concluíram que a resistência aos imidotiazóis ocorre devido a alteração farmacológica dos
receptores de acetilcolina (Sangster, 1999). A extensão
de sítios de ligação de alta afinidade do receptor da droga é similar entre isolados de H. contortus resistentes
e sensíveis, mas existem diferenças entre os sítios de
baixa-afinidade (Sangster et al., 1998). Nesses sítios,
os parasitos resistentes têm menor afinidade com a droga e mais sítios ligantes, o que possivelmente reflete
um aumento na propensão para a dessensibilização do
receptor para o levamisol.
Desenvolvimento genético
da resistência anti-helmíntica
A resistência apresenta três componentes: estabelecimento, desenvolvimento e dispersão. O estabelecimento da resistência é amplamente influenciado pelo
tamanho e diversidade da população e taxa de mutação
do gene envolvido (Sutherst & Comins, 1979). Quanto
mais elevados estes fatores, maior será a probabilidade da existência do alelo para a resistência (Geary et
al., 1999). O desenvolvimento da resistência deve-se
ao uso do agente seletivo, neste caso, o anti-helmíntico (Sutherst e Comins, 1979). A grande freqüência
de tratamentos seleciona para resistência diminuindo a
vida útil do fármaco (Barnes e Dobson, 1990). Por último, o processo de dispersão dos genes na população
é realizado pela migração e fluxo gênico (Humbert et
al., 2001). Logo, os processos de desenvolvimento e
dispersão são influenciados pela biologia e manejo dos
parasitos responsáveis pela resistência.
O aparecimento de cepas de nematóides resistentes
a anti-helmínticos pode ser explicado pela teoria da
evolução, que tem como ponto básico a seleção natural, ou seja, os indivíduos mais adaptados sobrevivem
para se reproduzir (Griffiths et al., 1998). A população
susceptível de nematóides contém uma subpopulação
de indivíduos com capacidade genética para sobreviver ao tratamento que originará a próxima geração de
nematóides desta população. O desenvolvimento da
resistência a uma droga geralmente acontece dentro de
cinco a oito gerações após a introdução da nova classe
de composto (Grant, 2001). Sendo aproximadamente
um ano o intervalo máximo de uma geração de nematódeos gastrintestinais em ruminantes (Prichard et al.,
1980).
Em nematóides gastrintestinais, existem três hipóteses que explicam o aparecimento de alelos para resistência aos benzimidazóis. A primeira hipótese ba-
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seia-se nas migrações e fluxo gênico. As migrações
introduzem diferentes freqüências gênicas provenientes da população de origem e através do fluxo gênico
esses genes são incorporados ao conjunto gênico da
nova população. Esse mecanismo provoca a dispersão de alelos de uma população para outra (Silvestre
e Humbert, 2002). Na segunda hipótese, os alelos para
resistência estão presentes na população por um longo
período como um alelo raro (Roos et al., 1990), essa é
uma das explicações para a grande prevalência da resistência aos benzimidazóis. A última hipótese seria a
de mutações espontâneas (Humbert et al., 2001) que
podem ser oriundas de uma variedade de fontes sendo
os erros na replicação do DNA e lesões espontâneas os
mais freqüentes (Griffiths et al., 1998), contudo todos
os tipos de mutação espontânea causam uma mudança
abrupta e hereditária do caráter.
Os fatores que determinam a taxa de seleção são:
dominância dos alelos para resistência, o número e
freqüência inicial dos genes envolvidos, a diversidade
genética da população, a relativa adaptabilidade dos
organismos resistentes e a oportunidade para recombinação genética (Sangster, 2001; Coles, 2005).
Em estudos realizados com Teladorsagia circumcincta, determinou-se que a resistência aos benzimidazóis é controlada por um ponto de mutação no gene da
ß-tubulina (Elard et al., 1996). Em H. contortus, observou-se que para o levamisol e ivermectina parece ser
controlada poligenicamente. A hereditariedade destes
genes é autossômica e recessiva. Nos benzimidazóis,
acredita-se que seja incompletamente recessiva, com
apenas uma mutação pontual no gene da ß-tubulina
(Dobson et al., 1996; Sangster et al., 1998; Prichard,
2001). Contudo, Le Jambre et al. (2000) afirmam que
em H. contortus os espécimes resistentes a ivermectina, apresentam um gene dominante, altamente controlado por apenas um gene, também autossômico. Neste
caso o desenvolvimento da resistência é mais rápido
(Barnes et al., 1995).
Em populações onde ainda não existam alelos da
resistência ou estes apresentem baixa prevalência, o
conhecimento dos fatores que determinam a sua maior
seleção pode possibilitar o controle do desenvolvimento da resistência, bem como a disseminação destes alelos.
Diversidade genética em H. contortus
Os nematóides não são igualmente susceptíveis ao
desenvolvimento da resistência. Alguns fatores, obrigatoriamente, devem estar atuando em conjunto para
que uma população de organismos resistentes possa
ser selecionada pela pressão da droga. Dentre estes, o
mais importante é a diversidade genética da população
tratada, pois a droga não cria organismos resistentes,
apenas seleciona os indivíduos que carreiam um alelo
do gene ou genes que reduz a susceptibilidade a uma
droga. A resistência só pode surgir se o alelo para a
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resistência estiver presente na população tratada. Logo,
quanto mais elevada for a diversidade genética de uma
espécie, maior será a probabilidade da existência deste
alelo (Geary et al., 1999).
H. contortus tem uma taxa de mutação do DNA
mitocondrial dez vezes maior que nos vertebrados e
o DNA nuclear extremamente diverso. Este parasito
mostra grande variabilidade genética, tanto em uma
população quanto entre populações geograficamente
separadas, sendo encontrado em diferentes espécies de
ruminantes desde os trópicos úmidos até as áreas de
clima com temperaturas mais frias. Além disso, apresenta uma alta prolificidade, sua fêmea pode eliminar
mais que 10.000 ovos por dia. O tamanho da sua população efetiva é enorme, sendo mais encontrada no meio
do que nos seus hospedeiros (Prichard, 2001). A alta
diversidade genética associada ao elevado tamanho da
população efetiva é uma condição ideal para a disseminação da resistência (Geary et al., 1999).
Alguns destes aspectos foram evidenciados. Cepas
de H. contortus isoladas em áreas geográficas diferentes com condições climáticas diversas apresentaram
diferenças no que diz respeito a morfometria dos machos, proporções entre a morfologia das fêmeas e freqüências aloenzimáticas (Saulai et al., 2000).
Diferenças fisiológicas entre
os parasitos resistentes e sensíveis
Alguns estudos têm sido realizados a fim de comparar esta característica entre indivíduos resistentes e
sensíveis. O nematóide de vida livre Caenorhabditis
elegans vem sendo utilizado como modelo para estudos de desenvolvimento e mecanismos da resistência
(Geary e Thompson, 2001; Hashmi et al., 2001). Neste
parasito, observa-se que os indivíduos resistentes apresentam disfunções na mobilidade, ovoposição, músculo da faringe, entre outras características, que chegam a
ser letal para esse parasito, mas parecem ser irrelevantes em outras espécies (Prichard, 2001).
Em contraste a estas observações, o parasito H.
contortus selecionado para resistência, apresenta, simultaneamente, genes que influenciam em outras características fisiológicas como a patogenicidade, poder
infectante e sobrevivência dos estágios de vida livre
(Hennon, 1993).
Este fato foi evidenciado em cepa resistente ao tiabendazol. Esta cepa mostrou-se superior na capacidade de estabelecer-se no animal, foi mais patogênica
e produziu uma maior quantidade de ovos. Estas características elevam-se com o aumento da resistência.
Neste estudo, os fatores relacionados aos estágios de
vida livre não foram afetados pelo grau de resistência
(Maingi et al., 1990). Resultados semelhantes foram
observados na 1ª geração de uma população de H. contortus resistente a benzimidazóis, a qual apresentou
maior hematofagismo e capacidade de estabelecimento
nos animais (Melo, dados não publicados).
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Nesta mesma população, observaram-se diferenças
no que se refere ao sucesso de seus ovos em produzir
larvas infectantes, tendo maior porcentagem de desenvolvimento a 23°C e 65% de umidade ponderal. No
entanto, a população sensível obteve maior sucesso no
desenvolvimento a 32°C e 35% de umidade ponderal,
quando comparada a resistente (Melo, dados não publicados). Essas características podem ser uma saída para
a manutenção dos alelos de resistência na população.
Por fim, H. contortus resistente a ivermectina apresenta a estrutura do anfídio anormal e de difícil identificação individual dos neurônios desta estrutura (Freeman et al., 2003). Contudo, são necessários mais trabalhos para determinar a influência deste fato no processo
de resistência às lactonas macrocíclicas.
Simultaneamente à seleção artificial através dos antihelmínticos, existe a seleção natural que permite que
os mais adaptados sobrevivam. Estes dois processos
podem ser os responsáveis pela manutenção dos alelos
do tipo selvagem, que caracteriza a susceptibilidade à
droga, e do alelo mutante que dá ao parasito a possibilidade de sobreviver ao tratamento anti-helmíntico, neste caso de populações trichostrongilídeas, mas que em
outras populações é deletério em outras características.
Observando os resultados citados, pode-se sugerir que
os resistentes tenham um tipo de comportamento mais
agressivo que possivelmente diminui a freqüência alélica do mutante devido a uma morte prematura do hospedeiro, e através de mecanismos como a capacidade
de sobreviver e maior manutenção dos estágios de vida
livre, disseminar seus alelos na população. Ao contrário destas características, os sensíveis mantém da
mesma maneira os seus alelos. Assim sendo, um novo
equilíbrio gênico é obtido, que é uma característica da
relação entre os alelos do tipo selvagem e mutante.
contortus (Silvestre & Humbert, 2000). Esta ferramenta molecular pode estimar cada genótipo (rr: resistente;
rS e SS: ambos sensíveis). Desta forma o nível de resistência aos BZ numa população de nematóides pode
ser definido pela proporção de homozigotos mutantes
(rr: Tir/Tir) (Humbert et al., 2001).
A presença do aminoácido fenilalanina ou tirosina
nesta posição, caracteriza a cepa sensível e resistente
aos BZ, respectivamente (Elard et al., 1999). Esse método é baseado no uso da reação em cadeia pela polimerase (PCR) a qual amplifica os alelos específicos. Esse
sistema gera três fragmentos: um alelo não específico e
dois alelos específicos para sensibilidade e resistência
aos benzimidazóis que são separados em eletroforese
em gel agarose. Essa caracterização possibilitará estimar a proporção de cada genótipo (rr, rS e SS) na população de nematóides (Humbert et al., 2001). E assim,
quantificar ao número de indivíduos resistente numa
população. A real vantagem deste método de diagnóstico é a possibilidade de detecção do primeiro indivíduo resistente, por isso essa técnica pode ser uma boa
alternativa de diagnóstico (Elard et al., 1999) e monitoramento da resistência (Sangster, 1999). Contudo, o
número de parasitos necessários para serem testados é
uma grande limitação. Para a detecção de nematóides
resistentes, quando a sua prevalência é menor que 1%
numa população de organismos diplóides, é necessário
a genotipagem de no mínimo 150 indivíduos (Sangster
et al., 2002). Esta técnica é um grande avanço para a
detecção e monitoramento da resistência, no entanto os
seus altos custos impedem que seja utilizada como rotina laboratorial no lugar dos métodos clássicos, que são
os testes in vitro de eclosão de ovos e desenvolvimento
larvar e, in vivo, de redução na contagem de ovos nas
fezes.
Diagnóstico genético da resistência
anti-helmíntica
Considerações finais
As técnicas moleculares oferecem algumas vantagens
no diagnóstico, são altamente específicas, sensíveis,
mesmo em pequenas quantidades de DNA, e têm um
potencial para identificação das espécies dos parasitos
(Sangster et al., 2002). A utilização dessas técnicas está
restrita aos benzimidazóis (Taylor et al., 2002). A resistência a esses fármacos é diagnosticada utilizando-se a
amplificação do fragmento do isotipo 1 da ß-tubulina.
Emprega-se a Reação em Cadeia pela Polimerase alelo específica (AS-PCR) para detectar esta mutação em
parasitos adultos de H. contortus (Kwa et al., 1994)
e para larvas e adultos de Teladorsagia circumcincta
(Elard et al., 1999). No entanto, este método de genotipagem só poderia ser realizado em vermes adultos após
necropsia dos animais ou em larvas, caso a infecção
fosse monoespecífica. Posteriormente este método foi
modificado permitindo a identificação das três espécies
de nematóides mais prevalentes em ovinos e caprinos,
T. circumcincta, Trichostrongylus colubriformis e H.
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A resistência em nematóides de pequenos ruminantes
encontra-se disseminada no mundo inteiro. O controle
destes parasitos e o diagnóstico precoce da RA, especialmente em H. contortus, devem ser preconizados a
fim de viabilizar economicamente a criação de ovinos
e caprinos. O conhecimento dos vários aspectos genéticos deste fenômeno, poderá aumentar a vida útil dos
fármacos atualmente utilizados, e consequentemente
tentar preservar a susceptibilidade dos parasitos, principalmente nas populações onde os alelos para resistência apresentam baixa prevalência.
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