UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA RAQUEL HELEN BRITO DE ARAÚJO AVALIAÇÃO DO EFEITO DO COMPOSTO TIPO HEPARINA ISOLADO DO CARANGUEJO Chaceon fenneri NA HEMOSTASIA E NA MORTE CELULAR NATAL-RN 2012 RAQUEL HELEN BRITO DE ARAÚJO AVALIAÇÃO DO EFEITO DO COMPOSTO TIPO HEPARINA ISOLADO DO CARANGUEJO Chaceon fenneri NA HEMOSTASIA E NA MORTE CELULAR Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Bioquímica. Orientadora: Profª. Drª. Suely Ferreira Chavante Co-orientadora: Profª. Drª. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza NATAL-RN 2012 Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências Araújo, Raquel Helen Brito de. Avaliação do efeito do composto tipo heparina isolado do caranguejo Chaceon fenneri na hemostasia e na morte celular / Raquel Helen Brito de Araújo. – Natal, RN, 2012. 78 f. : Il. Orientadora: Profa. Dra. Suely Ferreira Chavante. Coorientadora: Profa. Dra. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Departamento de Bioquímica. 1. Compostos tipo heparina – Dissertação 2. Anticoagulante – Dissertação. 3. Risco hemorrágico – Dissertação. I. Chavante, Suely Ferreira. II. Souza, Giulianna Paiva Viana de Andrade. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 612.115 AGRADECIMENTOS À minha adorável professora/ co-orientadora Giulianna Paiva que muito paciente e dedicada, desde 2009, vem me ensinando os caminhos da pesquisa científica. Obrigada por ter compreendido as minhas escolhas em uma fase importante da minha vida. Lembrar-me-ei de seus conselhos e até mesmo de suas broncas para tornar-me uma profissional cada vez melhor. Desejo que seu caminho pela pesquisa seja repleto de sucesso e realizações. À professora/orientadora, Suely Chavante, por ter me aceitado em seu grupo de pesquisa e que com sua experiência proporcionou conselhos importantes para as minhas pesquisas; À minha querida amiga/sister Fernanda Marques que vivenciou comigo os momentos de alegria e de angústia durante a graduação e o mestrado sempre prestativa até mesmo nos momentos em que eu não solicitava ajuda. Peço desculpas pelos momentos em que briguei com você, mas a gente só briga com quem a gente gosta, não é? Espero que nossa amizade dure para sempre. À minha querida amiga Ana Katarina Cruz, a gatinha da sala de cultura de células, por ter ensinado várias das técnicas de laboratório que possuo hoje. Obrigada pelos conselhos, pela ajuda em meus experimentos e por tornar meus dias mais agradáveis quando estou no laboratório. Aos meus amigos da turma de mestrado, em especial a Jethe Nunes, Alexandre Serquiz, Joyce Campos, Paulo Ricardo, Daniel Cruz, Sara Cordeiro por terem tornado divertidas as aulas. Aos meus amigos do GAGs I: Luciana Coelho, Ingrid Morais, Marlyanne Carvalho, Lívia de Lourdes, Manuela Tolstoi, Rômulo Cavalcante, Laís Palhares, Adriana Brito, Iglesias Lacerda, Cinthia , Jefferson Duarte e professora Fernanda Wanderley. Em especial, à Dayse Santos, por sua iii grande participação nos experimentos, sua presença foi muito importante. Obrigada pela ajuda e pela companhia dentro e fora do laboratório. Aos colegas do Biopol, professor Hugo Alexandre, Ruth Medeiros, Rafael Barros, Nednaldo Dantas, Jailma Almeida, Raniere Fagundes e Mariana Santana que com suas experiências ajudaram a esclarecer algumas de minhas dúvidas. Aos colegas do LQFBP, em especial Luciana Rabêlo, Raphael Russi, Paula Ivani, Raphael Serquiz, Anderson Felipe, Jonalson Araújo pela companhia na hora do almoço e nos fins de semana no departamento. Obrigada por me fazerem sentir como eu fizesse parte do laboratório de vocês. Aos funcionários do Departamento de Bioquímica: Eliene, Jonas, Ângela, Ricardo, Seu Rogério e Dona Margarita por serem sempre prestativos quando solicitados. Aos integrantes dos demais laboratórios do Departamento de Bioquímica, que direta ou indiretamente contribuíram para a realização desse trabalho. Ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte pelas condições necessárias para o desenvolvimento deste trabalho. À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento desta pesquisa. iv “Solidários, seremos união. Separados uns dos outros seremos pontos de vista. Juntos, alcançaremos a realização de nossos propósitos.” Bezerra de Menezes v RESUMO A heparina é um agente farmacêutico amplamente utilizado em medicina devido ao seu potente efeito anticoagulante. Além disso, tem a capacidade de inibir a proliferação, invasão e adesão de células cancerosas ao endotélio vascular. No entanto, a sua aplicabilidade clínica pode ser comprometida por efeitos secundários tais como hemorragia. Assim, a busca de compostos naturais com baixo risco hemorrágico e possível aplicabilidade terapêutica tem sido alvo de vários grupos de pesquisa. A partir desta perspectiva, este estudo visa avaliar as atividades hemorrágica, anticoagulante e efeito citotóxico para as diferentes linhagens de células tumorais (HeLa, B16-F10, HepG2, HS-5,) e células de fibroblastos (3T3) proporcionadas pelo composto tipo heparina obtido do caranguejo Chaceon fenneri. Dessa forma, o composto foi purificado após proteólise, cromatografia de troca iônica e fracionamento com acetona, e caracterizado por eletroforese em gel de agarose e degradação enzimática. O composto em estudo mostrou comportamento eletroforético semelhante à heparina de mamífero, e alta razão de proporção de dissacarídeos trissulfatado / N-acetilado. Além disso, o composto apresentou baixa atividade anticoagulante in vitro usando aPTT e um efeito hemorrágico menor quando comparado com heparina de mamífero. O composto tipo heparina obtido do caranguejo Chaceon fenneri mostrou efeito citotóxico significativo (p <0,001) em células linhagens de células tumorais HeLa, HepG2 e B16-F10 com valores de IC50 de 1000 ug / mL, após a incubação durante 72 horas. Para avaliar a influência do composto sobre o ciclo celular em células HeLa, foi realizada uma análise por citometria de fluxo. Os resultados desta análise mostraram que a influência do composto sobre o ciclo celular aumenta a fase S e diminui a fase G2. Assim, essas propriedades do composto tipo heparina obtido do caranguejo Chaceon fenneri sugerem este composto como um agente terapêutico em potencial. Palavras-chave: Compostos tipo heparina. Anticoagulante. Risco hemorrágico. Células tumorais. Citotoxicidade. vi ABSTRACT Heparin is a pharmaceutical animal widely used in medicine due to its potent anticoagulant effect. Furthermore, it has the ability to inhibit the proliferation, invasion and adhesion of cancer cells to vascular endothelium. However, its clinical applicability can be compromised by side effects such as bleeding. Thus, the search for natural compounds with low bleeding risk and possible therapeutic applicability has been targeted by several research groups. From this perspective, this study aims to evaluate the hemorrhagic and anticoagulant activities and citotoxic effect for different tumor cell lines (HeLa, B16-F10, HepG2, HS-5,) and fibroblast cells (3T3) of the Heparin-like from the crab Chaceon fenneri (HEP-like). The HEP-like was purified after proteolysis, ion-exchange chromatography, fractionation with acetone and characterized by electrophoresis (agarose gel) and enzymatic degradation. Hep-like showed eletroforetic behavior similar to mammalian heparin, and high trisulfated /Nacetylated disaccharides ratio. In addition, HEP-like presented low in vitro anticoagulant activity using aPTT and a minor hemorrhagic effect when compared to mammalian heparin. Furthermore, the HEP-like showed significant cytotoxic effect (p<0.001) on HeLa, HepG2 and B16-F10 tumor cells with IC50 values of 1000 ug/mL, after incubation for 72 hours. To assess the influence of heparin-like on the cell cycle in HeLa cells, analysis was performed by flow cytometry. The results of this analysis showed that HEP-like influence on the cell cycle increasing S phase and decreasing phase G2. Thus, these properties of HEP-like make these compounds potential therapeutic agents. Keywords: Heparin-like compound. Anticoagulant. Hemorrhagic risk. Tumoral cells. Cytotoxic activity. vii SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15 1.1. Glicosaminoglicanos (GAGS).......................................................................... 15 1.2. Hemostasia ..................................................................................................... 18 1.3. Ação da heparina sobre a hemostasia ............................................................ 23 1.4. Ciclo Celular e Morte Celular .......................................................................... 24 1.5. Ação da heparina e de compostos tipo heparina sobre o ciclo celular e as células tumorais ..................................................................................................... 28 1.6. Glicosaminoglicanos de invertebrados marinhos ............................................ 29 2. OBJETIVOS .......................................................................................................... 31 2.1. Objetivo geral .................................................................................................. 31 2.2. Objetivos específicos ...................................................................................... 31 3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................... 32 3.1. Animais ........................................................................................................... 32 Caranguejo ......................................................................................................... 32 Ratos .................................................................................................................. 32 3.2. Material Biológico ............................................................................................ 33 Sangue ............................................................................................................... 33 3.3. Glicosaminoglicanos obtidos comercialmente ................................................ 33 3.5. Reagentes ....................................................................................................... 33 3.6. Equipamentos ................................................................................................. 34 3.7. Extração e purificação do composto tipo heparina do caranguejo .................. 35 3.8. Eletroforese em gel de agarose no sistema descontínuo Bário/PDA (BIANCHINI et al., 1980) ........................................................................................ 36 3.9. Degradação do composto tipo heparina por heparina liases .......................... 36 3.10. Atividade hemorrágica .................................................................................. 37 3.11. Atividade Anticoagulante ............................................................................... 39 3.12. Cultura de Células......................................................................................... 39 3.13. Ensaio de viabilidade Celular ........................................................................ 40 3.14. Citometria de Fluxo - Avaliação da Viabilidade e Morte Celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de Propídeo ................................................................................... 40 3.15. Análise do Ciclo Celular ................................................................................ 41 viii 3.16. Análises Estatísticas ..................................................................................... 42 4. RESULTADOS ...................................................................................................... 43 4.1 Perfil eletroforético dos GAGS ......................................................................... 43 4.2. Características estruturais do composto extraído do caranguejo C.fenneri .... 44 4.3. Atividade anticoagulante in vitro do composto tipo heparina .......................... 45 4.3 Atividade hemorrágica ..................................................................................... 46 4.4 Efeito do composto tipo heparina do C.fenneri, heparina e heparam sulfato sobre a viabilidade de células tumorais e 3T3 ....................................................... 46 4.5. Indução de morte celular em linhagem tumoral HeLa pela ação do composto tipo heparina do caranguejo Chaceon fenneri ....................................................... 49 4.5.1 Detecção e quantificação de células apoptóticas induzidas pelo composto tipo heparina do caranguejo C. fenneri ............................................................... 49 4.5.2 Avaliação da parada de ciclo celular induzida pelo composto tipo heparina do caranguejo C. fenneri..................................................................................... 49 ............................................................................................................................ 50 5. Discussão .............................................................................................................. 51 6. Conclusão ............................................................................................................. 59 7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 60 ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Unidades dissacarídicas constituintes dos glicosaminoglicanos sulfatados .................................................................................................................................. 16 Figura 2. Unidade hexassacarídica básica da heparina ........................................... 17 Figura 3. Representação ilustrativa da cascata de coagulação................................ 20 Figura 4. Inibidores naturais da cascata de coagulação ........................................... 21 Figura 5. Representação esquemática dos complexos procoagulantes ................... 22 Figura 6. Sequência pentassacarídica responsável pela ligação da heparina a antitrombina, AGA*IA ................................................................................................ 23 Figura 7. Vias de indução de apoptose .................................................................... 27 Figura 8. Distribuição dos Glicosaminoglicanos Sulfatados na Escala Filogenética 29 Figura 9. Chaceon fenneri; espécie de crustáceo utilizada no estudo. ..................... 32 Figura 10. Esquema do ensaio de Atividade Hemorrágica. ...................................... 38 Figura 11. Comportamento eletroforético em sistema descontínuo Ba/PDA utilizando o composto extraído do caranguejo Chaceon fenneri ............................................... 43 Figura 12. Cromatografia de exclusão por tamanho dos produtos digeridos de do composto tipo heparina obtido do caranguejo C.fenneri ........................................... 44 Figura 13. Atividade Hemorrágica ............................................................................ 46 Figura 14. Efeito da heparina na viabilidade celular de diferentes tipos celulares .... 47 Figura 15. Efeito do heparam sulfato na viabilidade celular de diferentes tipos celulares .................................................................................................................... 47 Figura 16. Efeito do composto tipo heparina do C. fenneri na viabilidade celular de diferentes tipos celulares ........................................................................................... 48 Figura 17. Citometria de fluxo de células HeLa tratadas com Anexina V/PI e composto tipo heparina ............................................................................................. 50 Figura 18. Avaliação de parada de ciclo celular após exposição ao composto tipo heparina do Chaceon fenneri .................................................................................... 50 x LISTA DE QUADRO/TABELA Quadro 1. Resumo das quatro fases de coagulação propostas no modelo celular da coagulação ................................................................................................................ 22 Tabela 1. Atividade anticoagulante in vitro do composto tipo heparina extraído do caranguejo Chaceon fenneri comparado a heparina................................................. 45 xi LISTA DE ABREVIAÇÕES/SIGLAS Δ Presença de insaturação entre C-4 e C-5 do resíduo de ácido urônico ΔU, 2S-GlcNS Dissacarídeo insaturado dissulfatado ΔU, 2S-GlcNS,6S Dissacarídeo insaturado trissulfatado ΔU-GlcNAc Dissacarídeo insaturado N-acetilado ΔU-GlcNAc,6S Dissacarídeo insaturado N-acetilado-6-sulfatado ΔU-GlcNS Dissacarídeo insaturado N-sulfatado U-GlcNS,6S Dissacarídeo insaturado N,6-dissulfatado 3T3 Células normais de fibroblastos de camundongo AIF Fator de indução para apoptose/ Apoptosis-inducing factor Apaf-1 Fator de ativação para apoptose-1/ Apoptotic proteaseactivating factor 1 AT Antitrombina ATCC American Type Culture Collection ATP Adenosina trifosfato Ba/PDA B16-F10 Bcl-2 Bcl-xL Sistema descontínuo em tampão acetato de bário e tampão 1,3 diaminopropano acetato Células de melanoma de fibroblastos de camundongo Linfoma 2 de célula B de leucemia linfóide crônica/ B-cell CLL/Lymphoma 2 Gene relacionado ao BCL-2, isoforma longa/ BCL-2-related gene, long isoform BSA Albumina sérica bovina Bak Assassino 1 antagonista de BCL-2/ BCL-2 antagonist killer 1 Bax Proteína X associada ao BCL-2/ BCL-2-associated X protein Bid Agonista de morte que interage com o domínio BH3/ BH3interacting domain death agonist CDKs Ciclinas dependentes de kinases CETAVLON Brometo de cetiltrimetilamônio C.fenneri Chaceon fenneri c-FLIP Proteína celular inibitória semelhante a FLICE/ Cellular FLICExii like inhibitory protein CS Condroitim Sulfato DEAE Dietilaminoetil acetato DD Domínio de morte/Death Domain DED Domínio efetor de morte/Death-effector domain DIABLO Proteína de ligação direta ao IAP com baixo PI/ Direct IAPbinding protein with low PI DISC Complexo de sinalização indutor de morte DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium DNA Ácido Desoxirribonucléico DS Dermatam Sulfato ELISA Ensaio de Ligação Imunoenzimática F-2,0M Fração 2,0 Molar F-2,5M Fração 2,5 Molar F-3,0M Fração 3,0 Molar FADD Proteínas adaptadoras FAS associada com DD/ FASassociated death domain Fas/CD95 Receptor de Morte FvW Fator de Von Willebrand FITC Isotiocianato de fluoresceína (Fluorescein isothiocynate) GAGS Glicosaminoglicanos sulfatados GAGs Glicosaminoglicanos GlucA Ácido Glucurônico GP Glicoproteína Hep Heparina Hep/HS Heparina/Heparam Sulfato Hep-G2 Células de carcinoma hepatocelular humano Hela Células de adenocarcinoma cervical humano HS Heparam Sulfato HS-5 Células estromais da medula óssea humana IdoA Ácido Idurônico II a XIII Fatores inativos da Cascata de Coagulação IIa a XIIIa Fatores ativos da Cascata de Coagulação xiii IAPs Proteínas inibidoras de apoptose/ Inhibitor of apoptosis proteins MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio PBS Tampão Fosfato Salino PC Proteína C PDA 1,3 diaminopropano acetato PI Iodeto de Propídio OS Proteína S HPLC Cromatografia líquida de alta performance RPM Rotações por minuto SFB Soro Fetal Bovino Smac TNF-R Ativador secundário mitocondrial de caspases/ Second mitochondria-derived activator of caspases Tumor necrosis factor-receptor / Receptor de fator de necrose tumoral TF Fator Tecidual TFPI Inibidor da Via do Fator Tecidual tBID BID truncado /Truncated BID tPA Ativador de Plasminogênio Tecidual TNF-R TRADD TRAIL-R TTPA Receptor de fator de necrose tumoral/Tumor necrosis factorreceptor Receptor de TNF associado ao domínio de morte/TNF-receptorassociated death domain Receptor do ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF/ TNF-related apoptosis-inducing ligand-receptor Tempo de tromboplastina parcialmente ativada xiv Introdução 15 1. INTRODUÇÃO 1.1. Glicosaminoglicanos (GAGS) A descoberta de biomoléculas obtidas de organismos marinhos com atividades biológicas e farmacológicas é de grande interesse, devido ao grande avanço na área da biotecnologia marinha e de estudos evolutivos envolvendo bioquímica e biologia molecular. Além disso, a regulação de patentes de novos medicamentos tem levado diversas nações detentoras de grande biodiversidade marinha a buscarem a descoberta de novas moléculas com potencial farmacológico. Como exemplo dessas moléculas, destacam-se os glicosaminoglicanos (GAGs) obtidos de invertebrados marinhos. Os GAGs são heteropolissacarídeos constituídos por unidades dissacarídicas repetitivas formadas por uma hexosamina (α-D-glucosamina ou -D-galactosamina) e por um açúcar não-nitrogenado: ácido urônico (ácido-D-glucurônico ou ácido-Lidurônico) ou galactose, unidos por ligação glicosídica. Existem seis principais tipos de GAGs encontrados em tecidos animais: ácido hialurônico, condroitim 4- e 6sulfato, dermatam sulfato, queratam sulfato, heparam sulfato e heparina, cujas unidades estruturais estão esquematizadas na Figura 1. Estes compostos são diferenciados com relação ao grau de sulfatação, às proporções das unidades dissacarídicas e tamanho molecular das cadeias (DIETRICH, 1984). Quando ligados covalentemente às proteínas, os GAGs formam glicoconjugados denominadas proteoglicanos (PG), os quais estão presentes no interior de células (grânulos secretores), na superfície celular e na matriz extracelular (KJELLÉN & LINDAHL, 1991). Devido a sua variedade estrutural, os GAGs apresentam uma ampla aplicabilidade farmacológica como atividades anticoagulante, antitrombótica, antiviral, anti-inflamatória, antitumoral entre outras. Além disso, podem ser quimicamente modificados, são bastante estáveis, seguros, não tóxicos, hidrofílicos, geralmente formam géis e são biodegradáveis (SINHA & KUMRIA, 2001). Introdução 16 Ácido Hialurônico Condroitim Sulfato Heparam Sulfato Dermatam Sulfato Heparina - Queratam sulfato Sulfato R = H ou SO3 Figura 1. Unidades dissacarídicas constituintes dos glicosaminoglicanos sulfatados. Adaptada de VOLPI & MACCARI, 2006. Heparina e heparam sulfato apresentam características estruturais comuns, tais como o tipo de hexosamina (GlcN), o tipo de ácido urônico (GlcA / IdoA), bem como as ligações glicosídicas inter-(α1 → 4) e intra-dissacarídeos (1 → 4/α1 → 4). No entanto, eles podem ser diferenciados pela presença de grupos N-acetil da glucosamina e o teor de sulfato total. A heparina possui menos de 5% de grupos acetil e a maioria das glucosaminas N-sulfatadas (BOUÇAS et al, 2006). A estrutura básica da heparina é caracterizada por um hexassacarídeo octassulfatado, constituído essencialmente por dois tipos de dissacarídeos; um trissulfatado e um dissulfatado na proporção 2:1, respectivamente (Figura 2). O primeiro apresenta um ácido idurônico sulfatado no carbono 2 (C-2) e o último, um ácido glucurônico, sendo a glucosamina sulfatada em C-2 (N-sulfato) e carbono 6 (C-6) comum a ambos Introdução 17 (SILVA & DIETRICH 1975). As unidades trissacarídicas representam mais do que 60-75% das heparinas obtidas de mucosa de suíno e mais do que 80% das heparinas obtidas pulmão bovino (GUERRINI,BISIO,TORRI, 2001; SUDO et al., 2001). Por outro lado, o heparam sulfato apresenta regiões ricas em ácido glucurônico ligados a glucosamina N-acetilada que não estão presentes em heparinas. Assim, estruturalmente, o heparam sulfato difere da heparina por apresentar maior conteúdo de ácido D-glucurônico e glucosamina N-acetilada (CIFONELLI & KING, 1977; DIETRICH, NADER & STRAUSS, 1983; TAYLOR et al., 1973; TERSARIOL et al., 1994; TURNBULL & GALLAGHER, 1990). Compostos que apresentam estrutura intermediária entre o heparam sulfato e heparina são comumente denominados de heparinóides. CH 2OSO 3H O O ... OH O COOH OH OH O O OSO 3 H NSO 3H CH 2OSO 3H O COOH CH 2OSO3H O O O OH OH O ... OH O OSO3H NSO 3H OH NSO 3H Figura 2. Unidade hexassacarídica básica da heparina. A unidade estrutural básica da heparina é um hexassacarídeo octasulfatado constituído essencialmente por dois tipos de dissacarídeos: o primeiro contém α-D-glucosamina, N,6-dissulfatada, unida por ligação α(1→4) ao ácido L-idurônico 2,O-sulfatado, e o outro dissacarídeo apresenta α-Dglucosamina, N,6-dissulfatada, unida ao ácido β-D-glucurônico, por ligação do tipo β(1→4) (Silva & Dietrich, 1975). A heparina vem sendo utilizada na Medicina desde 1936, devido ao seu potente efeito anticoagulante (JAQUES, 1979; FARRED et al., 1989). Na clínica médica, é empregada na prevenção e profilaxia de trombose venosa profunda, contribuindo para a diminuição de mortalidade por tromboembolismo pulmonar (RAK, 1999). Devido a sua natureza polianiônica, a heparina é capaz de interagir com diversas proteínas, incluindo enzimas, inibidores, citocinas, fatores de crescimento e proteínas da matriz extracelular, podendo exercer assim influência em uma variedade de processos biológicos, tais como controle da coagulação sanguínea (BOUÇAS et al., 2006), modulação da síntese de um heparam sulfato antitrombótico em células endoteliais (NADER et al., 1989; 1991; PINHAL et al., Introdução 18 1994a; b; 1995), efeito na proliferação celular e apoptose (UEDA et al., 2009), entre outras. Essas atividades são resultados da interação heparina-proteínas e são mediadas por propriedades físico-químicas dos polímeros de heparina, tais como seqüência, padrão de sulfatação, distribuição e densidade de cargas e tamanho molecular (NADER & DIETRICH, 1989; YAMADA et al., 1998, HIRSH, et al., 2001). Dessa forma, para se entender a ação que a heparina exerce sobre a hemostasia e morte celular no organismo, faz-se necessário a compreensão do conceito e do funcionamento desses mecanismos. 1.2. Hemostasia A hemostasia é uma resposta fisiológica protetora ao dano vascular resultando na exposição de camadas subendoteliais da parede do vaso aos componentes sanguíneos (MACKMAN, TILLEY, KEY, 2007). Possui o objetivo de interromper o sangramento em local de lesão tecidual, onde o reparo da lesão ocorre de forma rápida e bastante regulada (NATHAN et al., 2003). A hemostasia do organismo depende da existência de um equilíbrio preciso entre vários processos fisiológicos, como a coagulação, fibrinólise e seus inibidores naturais, a inflamação, a integridade da monocamada de células endoteliais, entre outros (BOUÇAS et al., 2006). Os mecanismos hemostáticos podem ser divididos basicamente em dois estágios: hemostasia primária e hemostasia secundária. Na hemostasia primária, após a lesão endotelial, há vasoconstrição reflexa das células musculares lisas locais o que diminui o diâmetro do lúmen vascular. O efeito de constrição diminui o fluxo sangüíneo, permitindo maior interação entre as plaquetas e o local de lesão (TOPPER & WELLES, 2003). Logo, a matriz colágena e as proteínas subendoteliais expostas se ligam aos receptores de membrana de plaquetas, resultando na adesão plaquetária, tendo como principal componente para a ligação o fator de Von Willebrand (FvW). Múltiplos agonistas são gerados nesse momento, induzindo a adesão plaquetária, o que ocasiona alterações nos receptores da glicoproteína (GP) IIb/IIIa e leva a um estado de receptividade à ligação do fibrinogênio. Nessa fase, as plaquetas se encontram definitivamente ativadas. Em seguida, inicia-se o processo de agregação plaquetária, com a ligação múltipla e cruzada do fibrinogênio aos receptores GPIIb/IIIa (KÖSSLER, 2009). A hemostasia secundária compreende uma série de reações em cascata cujo resultado final é a formação de fibrina a partir do Introdução 19 fibrinogênio, conferindo estabilidade ao coágulo (LOPES et al., 2007). Para a formação de tampões de fibrina são necessários vários fatores e cofatores de coagulação. A coagulação tem como objetivo converter fibrinogênio em fibrina para formar uma malha dentro do agregado de plaquetas, estabilizando o coágulo no local da lesão. Embora o objetivo final da coagulação seja a polimerização de fibrina, a característica mais crucial da via de coagulação é a geração de trombina (ou fator IIa) (RAU et al., 2007). Como forma de elucidação sobre o funcionamento do mecanismo de coagulação, foi proposto o modelo de cascata (MACFARLANE 1964; DAVIE e RATNOFF, 1964). Esse modelo propõe um processo por meio da amplificação de uma série de reações enzimáticas em que cada reação tem como produto a conversão de uma proteína plasmática inativa em um produto ativo. Assim, os fatores que circulam na forma inativa, quer como zimogênios ou pró-fatores, são ativados por uma proteólise limitada (BOUÇAS et al., 2006). A cascata de coagulação pode ser ativada por duas vias enzimáticas distintas denominadas didaticamente de vias extrínseca e intrínseca (Figura 3). A via extrínseca é considerada a principal via para a formação da fibrina in vivo. Os componentes desta via incluem o fator tissular (FT, fator III), inibidor da via do fator tecidual (TFPI) e o fator plasmático (VII). Através desta via há formação de trombina. O fator tissular quando exposto, se liga ao fator VII ativado circulante o que ocasiona a ativação do fator IX e fator X (HOPPER, 2005). A via intrínseca é iniciada pela superfície negativa formada pela agregação plaquetária ou pela exposição da camada subendotelial do vaso, havendo a ativação do sistema de contato o qual é formado pelos zimogênios fator XII, fator XI e précalicreína, além de um cofator não enzimático, o cininogênio de alto peso molecular (HMWK). O fator XII se liga á superfície aniônica e se torna ativo (FXIIa). O FXIIa se propaga até a ativação do fator X (MARTINJN et al., 2009). As vias convergem para uma via comum representada pelo complexo FVa- FXa. Esse complexo catalisa a conversão de protrombina em trombina a qual converte o fibrinogênio em fibrina, ativa as plaquetas e finalmente induz a formação do coágulo (BOUÇAS et al., 2006; MACKMAN, 2007; TAMURA et al., 2009). Introdução 20 Figura 3. Representação ilustrativa da cascata de coagulação. II a XIII, diferentes zimogênios e pró-fatores; IIa a XIIIa, diferentes fatores ativados; III, fator tecidual; HK, calicreína; HMWK, cininogênio de alto peso molecular; PL, fosfolipídeos (fosfatidil serino e fosfatidil etanolamina). Traduzida de BOUÇAS et al., 2006. Essa cascata de coagulação é regulada por inibidores naturais que desempenham um papel fundamental no controle da hemostasia, exercido através da inibição específica de serinoproteases que são ativadas bem como pela degradação de fatores. Serpinas como antitrombina (AT), cofator II de heparina (HC II) e inibidor da via do fator tecidual (TFPI) pertencem a essa classe de compostos (Figura 4) (BOUÇAS et al., 2006). Introdução 21 Figura 4. Inibidores naturais da cascata de coagulação. II a XII, diferentes zimogênios e profatores; IIa a XIIa, diferentes fatores ativados; TF, fator tecidual ou fator III; AT, antitrombina, HC II, co-fator II de heparina; TFPI, inibidor da via do fator tecidual; tPA, ativador plasminogênio tecidual; PC, proteína C; PS, proteína S. Traduzida de BOUÇAS et al., 2006. Experimentos conduzidos nas últimas décadas demonstraram que as vias intrínseca e extrínseca não exibem funcionamento independente (FRANCO, 2001). Partindo disso, se aceita que mecanismos hemostáticos, fisiologicamente relevantes, estão associados com três complexos enzimáticos pró-coagulantes (Figura 5), os quais envolvem serinoproteases dependentes de vitamina K (fatores II, VII, IX e X) associadas a cofatores (V e VIII), todos localizados em uma superfície de membrana contendo fosfolipídeos (COLMAN et al., 2001). Outras características posteriormente determinadas para esse modelo são as fases caracterizadas de acordo com o estágio de formação da fibrina em iniciação; amplificação; propagação e finalização (Quadro 1) (JACKSON, 2007; JR et al., 2007). Introdução 22 Figura 5. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. O início da coagulação se faz mediante ligação do fator VIIa ao fator tecidual (FT), com subseqüente ativação dos fatores IX e X. O complexo fator IXa/fator VIIIa ativa o fator X com eficiência ainda maior, e o fator Xa forma complexo com o fator Va, convertendo o fator II (protrombina) em fator IIa (trombina). A superfície de membrana celular em que as reações ocorrem também se encontra representada. Adaptada de JENNY & MANN, 1998. Quadro 1. Resumo das quatro fases de coagulação propostas no modelo celular da coagulação. (Adaptado de JR et al., 2007). FASES DO PROCESSO HEMOSTÁTICO Iniciação Após injúria vascular e perturbação na circulação das células sanguíneas, ocorre a interação do FVIIa presente no plasma com o fator tecidual. Há pouca produção de trombina. Amplificação Propagação Há produção significante e A trombina inicia a consequente ativação de aumento na plaquetas e atividade da cofatores (FVa e trombina, geração FVIIIa) e FXI nas do tampão estável superfícies no local da lesão plaquetárias. tecidual e interrupção do sangramento. Finalização Ocorre limitação do processo de coagulação para se evitar oclusão trombótica em áreas normais do vaso ao redor da lesão. Introdução 23 1.3. Ação da heparina sobre a hemostasia A atividade anticoagulante e a atividade hemorrágica da heparina interferem no equilíbrio natural da hemostasia no organismo, mesmo sendo eventos independentes. Grande parte do efeito da heparina na coagulação sanguínea é devido a sua capacidade de se complexar ao inibidor natural – a Antitrombina (AT) (BIANCHINI et al., 1982; CHOAY & PETITOU, 1986). Essa ligação produz uma mudança conformacional na AT (VILLANUEVA & DANISHEFSKY, 1977; NORDENMAN & BJÖRK, 1978), a qual promove um aumento de 1000 vezes na capacidade da AT em inativar as serinoproteases envolvidas na coagulação sangüínea (ROSENBERG & BAUER, 1992). Dados na literatura mostram que para que haja essa ligação, é necessário que a heparina apresente uma seqüência pentassacarídica específica (Figura 6) (CHOAY et al., 1981, PETITOU, CASU & LINDAHL, 2003). Figura 6. Sequência pentassacarídica responsável pela ligação da heparina a antitrombina, AGA*IA. A, pode ser GlcNAc6SO3 ou GlcNSO36SO3; A*, GIcNSO33,6SO3; G, GlcA; I, IdoA2SO3. O asterisco representa o típico resíduos de glucosamina 3-Osulfatado. Os grupos da sequência AGA*IA apresentam alta afinidade com a AT. Os grupos sulfato circulados são essenciais (círculos cheios) ou marginalmente essenciais para essa alta afinidade. A "meia lua" abaixo GIcA indica que este resíduo é também essencial. O resíduo IdoA que precede o pentassacarídeo não é essencial para a ligação a AT, mas invariavelmente ocorre em domínios naturais de ligação de heparinas de mucosas. Fonte: CASU, 2005. Dessa maneira, seu potente efeito anticoagulante pode desencadear complicações hemorrágicas (OCKELFORD et al., 1982), decorrentes de sua interferência no “balanço hemostático”, que envolve o sistema de coagulação sangüínea, plaquetas, parede vascular e características do fluxo sangüíneo local. Por outro lado, experimentos in vitro, utilizando o modelo de cauda escarificada de Introdução 24 ratos, sugerem que esse efeito não esteja apenas relacionado com o clássico mecanismo de coagulação, uma vez que a heparina se liga a moléculas semelhantes à miosina nas células do músculo liso, inibindo a contratibilidade dos vasos por inibir competitivamente a hidrólise de ATP pela miosina ATPase, e então produzindo a hemorragia (CRUZ & DIETRICH, 1967; NADER & DIETRICH, 1974; NADER, TERSARIOL & DIETRICH, 1989a). Esses experimentos também estabeleceram que a estrutura molecular mínima da heparina necessária para a ruptura da hemostasia é um dissacarídeo que contém um ácido urônico insaturado unido através de ligação glicosídica (14) a uma D-glucosamina sulfatada na posição C-6. Assim, a sulfatação na posição C-6 da glucosamina, o tipo de ligação glicosídica e o tipo de hexosamina são críticos para o efeito hemostático (DIETRICH et al., 1991; NADER, TERSARIOL & DIETRICH, 1989a,1989b). Em 2002, Shinjo e colaboradores mostraram que a heparina e fragmentos atuam no trocador Na+/Ca2+ da membrana celular de células musculares influenciando na contração muscular do vaso. Recentemente, Bouças e colaboradores (2012) mostraram que polímeros com estruturas não relacionadas podem provocar semelhantes atividades hemostáticas e que a sequência do polímero nem sempre é crucial para determinadas atividades. 1.4. Ciclo Celular e Morte Celular A fim de que se mantenha a homeostase do ambiente celular, é necessário que haja um equilíbrio entre a vida e a morte das células. Altos ou baixos índices de morte celular podem interromper a homeostase e levar a uma variedade de doenças, incluindo câncer (ELMORE, 2007). O ciclo celular é um fenômeno complexo, finamente regulado e composto de 4 fases: i) fase S (síntese de DNA) que objetiva a geração de uma única e exata copia do seu material genético; ii) fase M (mitose), em que ocorre a repartição de todos os componentes celulares entre as duas células filhas idênticas; e iii) as fases G1 e G2 (do inglês gap, fenda) que proporcionam a célula, tempo adicional para o seu crescimento e para checagem de condições ambientais e de replicação (NORBURY & NURSE, 1991). O ciclo celular é controlado por quinases dependentes de ciclinas (CDKs, do inglês “Cyclin Dependent Kinases”). As CDKs ao se ligarem a proteína ciclina, são ativadas e ativam fatores de transcrição permitindo o avanço do ciclo celular. O controle Introdução 25 apropriado do ciclo celular é crucial para a sobrevivência da célula. A inativação inapropriada do ciclo está envolvida com a morte celular em doenças neurodegenerativas, e falhas no ciclo permitem com que células tumorais sobrevivam, podendo originar um câncer (SCHMITT, 2003). A morte celular programada pode ocorrer, principalmente, como resultado da apoptose, autofagia, e necrose (SHEN , KEPP & MICHAUD, et al, 2011). A morte celular por necrose ocorre, geralmente, em resposta à injúria severa às células, definida como uma forma violenta de morte celular iniciada por estímulos ambientais que resultam em rápida desregulação da homeostasia (BRAS et al, 2005). A necrose é caracterizada morfologicamente pela agregação da cromatina, inchaço citoplasmático, mitocondrial e do retículo endoplasmático, (levando a desagregação dos ribossomos), ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo intracelular. Consequentemente, ocorre a geração de uma resposta inflamatória local, que pode causar injúria e até morte de células vizinhas, ou seja, nesta condição um grande número de células são afetadas e lesadas ao mesmo tempo e devido ao desencadeamento do processo inflamatório há alterações irreversíveis no tecido e/ou órgão afetado, ainda que o material necrótico seja removido por fagócitos (CURTIN, DONOVAN, COTTER, 2002; BROUJRAD et al, 2007). A morte celular por apoptose, no entanto, é a forma mais comum pela a qual o corpo elimina as células danificadas ou desnecessárias sem inflamação local (LIN et al., 2010; SIMON , 2003). A apoptose desempenha um papel importante ao longo da vida, desde o desenvolvimento embrionário e na manutenção da homeostase do tecido adulto (COTTER TG, 2009). Durante o desenvolvimento embrionário, a apoptose neuronal ajuda na modelagem do tecido nervoso (YUAN J, YANKNER BA, 2000). Nos adultos, a homeostase mantém a saúde, equilibrando a morte celular e a proliferação celular (COTTER TG, 2009). As células que sofrem apoptose exibem um padrão característico de alterações morfológicas como formação de pregas na membrana plasmática, retração do citoplasma e consequente diminuição do tamanho da célula, permeabilização mitocondrial, liberação do citocromo c, clivagem do DNA e exposição de fosfatidilserina na face externa da membrana plasmática (TAYLOR, CULLEN, MARTIN, 2008; KROEMER et al., 2009; MARTIN et al., 1995). Esta última etapa é um evento relativamente inicial e ocorre antes de a membrana ter sua Introdução 26 permeabilidade comprometida, servindo como um marcador para o reconhecimento das células em processo de apoptose antes que ocorra a permeabilização da membrana, liberação dos componentes do citoplasma e o dano tecidual (BRUMATTI et al., 2008). A morte celular por apoptose pode ser disparada por uma variedade de estímulos fisiológicos, patológicos ou citotóxicos. Quando iniciada, a apoptose promove a ativação de eventos moleculares que culminam com a ativação de proteases, denominadas caspases (cysteine aspartate-requiring proteinases) (JIN, EL-DEIRY, 2005; SHI et al., 2002).Em condições normais, as caspases estão presentes nas células como zimógenos, o que impede a ocorrência não controlada de morte. Após a detecção de algum estímulo apoptótico, as chamadas caspases iniciadoras são ativadas pela dimerização do zimógeno através de uma proteína adaptadora (BOATRIGHT et al., 2003; BOATRIGHT; SALVESEN, 2003), que libera o sítio catalítico da enzima. São estas caspases iniciadoras que irão ativar as caspases efetuadoras, através da clivagem proteolítica dos zimógenos. Por sua vez as caspases efetuadoras são as responsáveis pelo “empacotamento” das células durante a apoptose, através da proteólise de diferentes substratos, que irão acarretar na externalização de fosfolipídeos, na condensação e fragmentação nuclear e na desmontagem do citoesqueleto (GREEN et al., 1995). A apoptose pode ser deflagrada por uma via intrínseca, em função de estímulos internos de estresse intracelular como perturbações do ciclo celular e vias metabólicas, ou por uma via extrínseca mediante estímulos externos que ativam receptores específicos na superfície celular chamados receptores de morte (PAROLIN & REASON, 2001) (Figura 7). Essas vias estão descritas, resumidamente, a seguir. Introdução 27 Figura 7. Vias de indução de apoptose. A via extrínseca é desencadeada por receptores de morte e envolve a ativação do iniciador da caspase-8, que ativa diretamente a caspase-3 causando apoptose. A via intrínseca é ativada por diferentes estímulos apoptóticos que levam a liberação de citocromo c da mitocôndria e ativação de caspase-9. Essa etapa pode ser inibida por membros de ação anti-apoptótica da família Bcl-2 de reguladores de apoptose. Citocromo c interage com APAF-1 e caspase-9 para promover a ativação da caspase-3. (Adaptada de Naghma Khan, Vaqar Mustafa Adhami and Hasan Mukhtar, 2010). A via extrínseca é iniciada pela ativação dos receptores de morte FAS (FAS/CD95), TNF-R1 e TNF-R2 (tumor necrosis death receptor), TRAIL (TNF related apoptosis-inducing ligand receptors) R1 (DR4) e R2 (DR5), uma família de proteínas transmembrânicas, que apresentam um domínio extracelular rico em cisteína e um domínio intracelular denominado DD (death domain), responsável pela transdução do sinal apoptótico. A interação destes receptores com seus respectivos ligantes induz a trimerização dos receptores levando ao recrutamento de proteínas adaptadoras, como FAS associada com DD (FADD) e TNFR1 associada com DD (TRADD), e proteínas que interagem com receptor (RIP, receptor-interacting protein), que se ligam aos receptores de DD. A proteína FADD contém um domínio efetor da morte (DED, death effector domain) com homologia ao domínio DED da pró-caspase-8 ou -10, formando um complexo chamado DISC (Death-Inducing Introdução 28 Signaling Complex), que promove a auto-ativação da caspase-8 que, por sua vez, atua na ativação da caspase 3, 6 e 7, desencadeando eventos apoptóticos seguidos pela formação de corpos apoptóticos (morte celular) e fagocitose por macrófagos (JIN, EL-DEIRY, 2005; YAN, SHI, 2005). A via intrínseca ocorre pela exposição da célula a situações de estresse como radiações, drogas, agentes oxidantes ou ainda por privação de fatores essenciais de sobrevivência. Esses estímulos promovem um desequilíbrio entre as proteínas reguladoras da apoptose existentes no citosol, as proteínas pró e anti-apoptóticas da família Bcl-2, que irão interagir entre si e promoverão a liberação de proteínas mitocondriais em especial o citocromo c (Cito-c) . O Cito-c interage no citoplasma com o fator apoptótico ativador de protease-1 (Apaf-1), pró-caspase 9 e ATP formando um complexo chamado apoptossomo que ativa a caspase 9 (uma caspase iniciadora) que por sua vez, ativa a caspase 3 (caspase efetora) a qual executará o processo apoptótico. (THORBURN, 2004). 1.5. Ação da heparina e de compostos tipo heparina sobre o ciclo celular e as células tumorais Além de seu efeito sobre a hemostasia, polissacarídeos tipo heparina possuem a capacidade de inibir a proliferação de células tumorais por induzir apoptose, além de interferir na angiogênese e invasão de células tumorais mediada pela heparanase (BORGENSTRÖM et al, 2007; UEDA et al, 2009; CASU B., NAGGI A., TORRI G, 2010). Efeitos citotóxicos e apoptóticos da heparina em vários tipos de câncer têm sido descritos na literatura (UEDA et al., 2009; NIERS et al., 2007). A heparina, quando internalizada pela célula cancerosa, é citotóxica causando morte celular por meio de interferência da atividade de fatores de transcrição e da indução de apoptose (LINHARDT, 2004). Alguns estudos demonstraram que para o efeito citotóxico a elevada sulfatação da cadeia polissacarídica se mostra relevante para tal atividade (HARI et al., 2005). Complementando esse efeito citotóxico, estudos mostraram que a heparina pode bloquear o ciclo celular em qualquer ponto de transição entre as fases G0/G1 (Castellot, 1982) ou em meados da progressão tardia da fase G1 (CASTELLOT at al., 1985; REILLY at al., 1989; MAJESKY et al., 1987). Introdução 29 A aplicabilidade clínica do efeito antitumoral de tais polissacarídeos pode ser comprometida pela sua alta atividade anticoagulante. Por isso, várias heparinas quimicamente modificadas com baixa atividade anticoagulante têm sido sintetizadas para minimizar esse efeito e aumentar a ação inibitória da heparina no crescimento tumoral e metástase (NIERS, et al, 2007). Por essa razão, análogos de heparina, destituídos de atividade anticoagulante, vêm sendo amplamente estudados. 1.6. Glicosaminoglicanos de invertebrados marinhos Vários grupos de pesquisa estudam novas fontes de moléculas tipo heparina e buscam por compostos que possuam a mesma função da heparina comercial, mas que promovam menos reações adversas. Compostos naturais tipo heparina em diferentes filos de invertebrados, principalmente moluscos e crustáceos da costa do Nordeste, tem sido caracterizados estruturalmente e seus efeitos farmacológicos determinados (DIETRICH et al., 1985; 1989; 1999; CHAVANTE et al., 2000; BRITO et al., 2008). O trabalho de Medeiros e colaboradores (2000) mostra a ocorrência generalizada de compostos tipo heparina em 23 espécies de invertebrados de 13 filos dessa subclasse (Figura 8). Figura 8. Distribuição dos Glicosaminoglicanos Sulfatados na Escala Filogenética. Adaptada: Medeiros et al, 2000 Introdução Também, uma heparina de baixo peso molecular, com 30 atividade anticoagulante e com atividade antitrombótica foi extraída do camarão Penaus brasiliensis por Dietrich e colaboradores (1999). Outros exemplos de invertebrados são os moluscos Anomalocardia brasiliana, Donnax striatus, Tivela mactroides e Tapes phylippinarum dos quais foram isoladas heparinas com alta atividade anticoagulante (DIETRICH et al., 1985; PEJLER et al., 1987; DIETRICH et al., 1989; CESARETTI et al., 2004, VOLPI, 2005). Heparinóides obtidos de crustáceos, com características estruturais intermediárias à heparina e heparam sulfato, mostraram baixa atividade anticoagulante (CHAVANTE et al., 2000) e menor risco hemorrágico (ANDRADE, 2006), sugerindo que a presença de uma estrutura química peculiar que não interfere sobre o equilíbrio hemostático. Cada invertebrado produz polissacarídeos sulfatados específicos, não encontrados em animais de outros filos, sendo, por isso, alvo de estudo a fim de se analisar suas características químicas e seu potencial farmacológico. Objetivos 31 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral Avaliação do efeito do composto tipo heparina isolado do caranguejo Chaceon fenneri na hemostasia e na morte de células tumorais. 2.2. Objetivos específicos Caracterizar estruturalmente o composto tipo heparina; Na Hemostasia: Avaliar a atividade anticoagulante do composto tipo heparina purificado; Avaliar o risco hemorrágico do composto tipo heparina purificado; Na Morte Celular: Avaliar o efeito citotóxico do composto tipo heparina frente a diferentes linhagens de células tumorais (HeLa, B16-F10, HepG2, HS-5), e na linhagem de fibroblastos (3T3); Avaliar o efeito do composto tipo heparina na morte de células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa); Avaliar a ação do composto tipo heparina no ciclo celular da linhagem HeLa. Materiais e Métodos 32 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Animais Caranguejo Para obtenção do composto em estudo, foram utilizados tecidos fragmentados do caranguejo da espécie Chaceon fenneri. O caranguejo C. fenneri (Figura 9) é uma espécie de grandes dimensões e encontrada em altas profundidades. Os espécimes foram provenientes da Costa do Nordeste e fornecidos pelo professor Doutor Jorge Eduardo Lins do Departamento de Oceanografia e Limnologia (UFRN) pelo projeto REVIZZE. Os animais foram mantidos congelados até o processamento. 15 cm Reino: Animalia Filo: Arthropoda Subfilo: Crustacea Classe: Malacostraca Ordem: Decapoda Infraordem: Pleocyemata Família: Geryonidae Género: Chaceon Espécie: Chaceon fenneri Figura 9. Chaceon fenneri; espécie de crustáceo utilizada no estudo. Ratos Para avaliação da atividade hemorrágica, foram utilizados ratos machos da linhagem Wistar, com média de 3 a 5 meses de idade, com peso de 250 a 450g, obtidos do biotério do Departamento de Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os animais foram mantidos com dieta e água ad libitium, em condições controladas de iluminação (ciclo de 12/12h claro/escuro) e temperatura (22ºC). O experimento realizado foi previamente aprovado pela comissão de Ética em Pesquisa da UFRN (Protocolo Nº A-005/08 – CEP/UFRN). Materiais e Métodos 33 3.2. Material Biológico Sangue Para a avaliação da atividade anticoagulante do composto do caranguejo, foi utilizado sangue de doadores saudáveis a fim de se obter o plasma sanguíneo. 3.3. Glicosaminoglicanos obtidos comercialmente Heparina sódica de mucosa suína foi obtida do Laboratório Derivati Organici (Trino Vercellese, Itália); Heparam sulfato foi purificado de pulmão bovino como descrito por DIETRICH & NADER (1974) e gentilmente doado ao nosso laboratório; Condroitim 4-sulfato, extraído de cartilagem de baleia e condroitim 6-sulfato, extraído de cartilagem de tubarão, assim como dermatam sulfato extraído de mucosa intestinal bovina, foram obtidos da Seikagaku Kogyo Co. (Tóquio, Japão). 3.4. Enzimas Heparina liases I, II e III de Flavobacterium heparinum adquiridas da Sigma-Aldrich (Sigma Aldrich, USA). 3.5. Reagentes 1,3-diaminopropano acetato (PDA), acetato de bário, brometo de cetiltrimetilamônio (CETAVLON), e tolueno fornecida pela Aldrich Chemical Co. Inc. (Milwaukee,WI, EUA); Acetona, metanol e benzina fornecida pela Cromato Produtos Químicos Ltda. (Diadema – SP); Agarose (standard-Low-Mr) adquirida fornecida pela BioRad Laboratories (Richmond, CA, EUA); Materiais e Métodos 34 Azul de toluidina e vermelho de cresol, fornecida pela Sigma Chemical Company (St.Louis, MO, EUA); Cloreto de Sódio, fornecida pela Vetec Química Fina Ltda (Rio de Janeiro, RJ, Brasil); Enzima Superase fornecida pela Prozyn Indústria e Comércio Ltda.; Kits comerciais para determinação de tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa) Labtest (São Paulo, SP, Brasil); Meios de cultura DMEM (Dulbecco MEM), RPMI-1640, Estreptomicina, Penicilina, Soro fetal bovino e solução de tripsina/EDTA da Cultilab (Campinas, SP, Brasil); MTT – brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium (Sigma Aldrich, USA); Reagente Coomassie Blue Brilliant G (Sigma Aldrich, USA); Resina de troca-iônica LEWATIT da Bayer S/A (São Paulo); Solução salina 0,9% (estéril); Kit para citometria de fluxo (FITC/Annexin V Dead Cell Apoptosis da Invitrogen - Carlsbad, CA, USA). Os demais reagentes e materiais utilizados foram da melhor qualidade disponível. 3.6. Equipamentos Além dos equipamentos usuais de laboratório, utilizou-se: Balança eletrônica – Tecnal (mod. B-tec 2200); Bancada de Fluxo Laminar (PACHANE Pa300); Banho Maria (Tecnal); Câmara para eletroforese horizontal em gel de agarose, modelo desenvolvido por Jaques e col. (1968), (Técnica Permatron Ltda., São Paulo, SP, Brasil); Centrífuga refrigerada, modelo CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão); Materiais e Métodos 35 Citômetro de Fluxo modelo FACSCANTO II, BD Bioscience; Coagulômetro Quick Timer da Drake Eletrônica Comércio Ltda. (São José do Rio Preto, SP); Espectrofotômetro; Fontes de corrente contínua regulável, desenvolvidas pelo Dr. H. Rzeppa, Técnica Permatron Ltda. (São Paulo, SP, Brasil); Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110; Medidor de pH modelo FTP 125 da IMPRINT do Brasil Ltda. (Campinas, SP); Microscópio invertido NIKON Eclipse TE300; Purificador de água Milli-Q® Water System (Millipore Corp.) 3.7. Extração e purificação do composto tipo heparina do caranguejo O composto em estudo foi gentilmente cedido pela Drª Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza. O processo de extração e purificação foi descrito em Andrade, 2001. Brevemente, os caranguejos Chaceon fenneri foram triturados, delipidados com acetona e, logo após, submetidos à proteólise utilizando a enzima prozyn homogeneizada em solução de NaCl 0,6M, pH 8,0. A proteólise foi realizada a 60°C, por 24 horas. Em seguida, a resina de troca iônica Lewatit foi adicionada ao filtrado da proteólise para complexar os GAGs. A suspensão foi mantida sob agitação à temperatura ambiente por 24 horas. Para a descomplexação, a resina foi submetida à eluição com concentrações crescentes de NaCl (2,0M 2,5M e 3,0M) e precipitação com metanol, 4ºC por 18 horas. Todas as frações apresentaram o mesmo composto, foram reunidas e a fração resultante foi denominada F- 3,0 M. Materiais e Métodos 36 3.8. Eletroforese em gel de agarose no sistema descontínuo Bário/PDA (BIANCHINI et al., 1980) Esse sistema permite o fracionamento da heparina em 3 componentes: migração lenta (S), intermediária (I) e rápida (F); assim melhor caracterizando-a e diferenciando-a dos outros GAGs. O composto em estudo foi aplicado em gel de agarose 0,6% em tampão acetato de bário 0,04M, pH 5,8 e submetido a 80V durante 15 minutos em cuba refrigerada. Em seguida, o gel foi transferido para outra cuba refrigerada contendo tampão PDA e mantida, em repouso, durante 15 minutos. Após esse período, a mesma foi submetida a uma voltagem de 100V. O vermelho de cresol acrescentado aos glicosaminoglicanos padrões (Condroitim Sulfato, Dermantam Sulfato e Heparam Sulfato) foi utilizado como indicador da migração. Após a corrida eletroforética os GAGs foram precipitados no gel pela imersão em uma solução de CETAVLON 0,1% por 2 horas. A seguir, o gel foi seco sob uma corrente de ar quente e corado com uma solução de azul de toluidina 0,1% em ácido acético 1% e etanol 50%. O excesso de corante foi removido com solução descorante (ácido acético 1% e etanol 50%) e o gel seco à temperatura ambiente. 3.9. Degradação do composto tipo heparina por heparina liases Foram digeridas 100μg do composto extraído do caranguejo C.fenneri por uma mistura de heparina liases (2.5 mIU) e analisadas por SAX-HPLC numa coluna PhenoSphere™ 5 µm SAX 80 Å LC Column 150 x 4.6 mm. Os Δ-dissacarídeos foram eluídos com um gradiente linear de NaCl (0 - 1 M) num período de 30 min com fluxo de 1 mL. min-1 e detectados por UV 232nm. Materiais e Métodos 37 3.10. Atividade hemorrágica Para a realização da atividade hemorrágica, foi utilizado o método de Cruz e Dietrich (1967), tendo ocorrido alguns ajustes (TERSARIOL et al., 1992). O método foi baseado em trabalhos que mostraram que a aplicação tópica de heparina na escarificação (lesão) causava a ruptura do sistema hemostático, mesmo após extensivas lavagens da cauda com solução salina. Esse fenômeno foi denominado de efeito hemorrágico residual da heparina. No início do experimento, foi feita uma escarificação (10mmX 1mm X 0,5mm) na parte terminal da cauda de rato com uma lâmina de bisturi. Em seguida, a cauda escarificada foi introduzida em tubo de ensaio contendo 2mL de solução fisiologia. Os tubos utilizados durante a atividade permaneceram imersos em água de banhomaria a 37°C. A ordem do experimento se caracteriza em mergulhar, verticalmente, a porção escarificada da cauda do rato em tubos contendo solução fisiológica. No primeiro tubo, acompanhou-se o sangramento durante 10 minutos. Em seguida, foi induzido um novo sangramento através do estímulo mecânico (esfregando 3 vezes a gaze sobre a escarificação) e a cauda do rato foi transferida a um tubo controle de solução salina para que o sangramento fosse observado por mais 5 minutos. Passado esse tempo, um novo estímulo mecânico foi realizado, sendo a cauda do rato, dessa vez, introduzida em tubo contendo solução fisiológica e o composto a ser analisado. Após 5 minutos, a cauda foi removida da solução e lavada com solução fisiológica para a retirada do excesso de compostos. Para a observação do efeito residual hemorrágico, mergulhou-se a cauda em soluções salinas novas (sem composto) em intervalos de tempo determinados. A quantidade de proteína liberada da lesão, nesse experimento, serve como controle para os ensaios posteriores. Os resultados foram expressos pela razão entre a soma cumulativa da taxa de proteínas liberadas da lesão antes e após o contato com a heparina e com o composto em estudo (potência de sangramento) (Figura 10). Materiais e Métodos Figura 10. Esquema do ensaio de Atividade Hemorrágica. 38 Materiais e Métodos 39 3.11. Atividade Anticoagulante A atividade anticoagulante foi realizada através dos ensaios de TTPa (Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada) seguindo instruções determinadas pelo fabricante do kit Labtest (São Paulo, SP, Brasil). Assim, 100l de plasma humano citratado contendo várias concentrações de heparina padrão ou do composto teste foram incubados a 37°C durante três minutos. Em seguida, 100l de cefalina foram adicionados e a mistura foi incubada a 37ºC por mais três minutos. Após esse tempo, 100l de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,025 mol/l pré-aquecido a mesma temperatura foram adicionados e o tempo de coagulação foi medido no coagulômetro Quick Timer (Drake Eletrônica Comércio Ltda, São Paulo, Brasil). 3.12. Cultura de Células Para avaliar o efeito dos heparinóides na viabilidade e morte celulares, foram utilizadas as seguintes linhagens de células tumorais e normais: HeLa, células de adenocarcinoma cervical humano (ATCC número CCL-2) ; B16-F10, células de melanoma de fibroblastos de camundongo (ATCC número CRL-6475); Hep-G2, células de carcinoma hepatocelular humano (ATCC número HB-8065); HS-5, células estromais da medula óssea humana (ATCC número CRL-11882); 3T3, células normais de fibroblastos de camundongo (ATCC número CL-173). As células foram foram obtidas da American Type Culture Colletion (ATCC, Rockville, MD, USA) e cultivadas em meio DMEM suplementado (10% Soro Fetal Bovino - SFB, contendo antibiótico e antifúngico) à 37ºC e 5% CO2. A cada três dias, o meio de cultura foi trocado sendo as células subcultivadas aproximadamente a cada quinze dias para serem utilizadas nos ensaios posteriores. Materiais e Métodos 40 3.13. Ensaio de viabilidade Celular A viabilidade das células frente aos controles heparina e heparam sulfato, e frente composto em estudo foi determinada pelo método do MTT [brometo de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio] (MOSMANN, 1983) que se baseia na redução deste sal por desidrogenases mitocondriais (ativas apenas em células viáveis), que após solubilizado em álcool etanol permite uma medida colorimétrica em espectrofotômetro a 570 nm. As células cultivadas em placas de 96 poços foram expostas a diferentes concentrações de heparina, heparam sulfato e composto (0,1; 1; 10; 100 e 1000 ug/mL) em triplicata e incubadas à 37°C por 72h. Após esse período, 100μL de meio contendo MTT (concentração final de 5mg/mL) foi adicionado em cada poço, sendo as placas incubadas a 37°C por 4 horas. O sobrenadante foi removido e 100μL de etanol foram adicionados a cada poço, para solubilizar os cristais de formazan. Após agitação vigorosa, a absorbância foi medida em leitor de microplacas de ELISA a 570nm. 3.14. Citometria de Fluxo - Avaliação da Viabilidade e Morte Celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de Propídeo Para a avaliação dos efeitos do composto extraído do caranguejo C.fenneri sobre a morte celular, foi utilizado o kit FITC/Annexin V Dead Cell Apoptosis Kit with FITC Annexin and PI, for Flow Cytometry (Invitrogen, Catalog no V13242). O marcador anexina V-FITC permite detectar os estágios iniciais de apoptose, devido ao fato de se ligar preferencialmente a fosfolipídios negativamente carregados (fosfatidilserina) expostos no início do processo apoptótico. Já o iodeto de propídeo permite avaliar os momentos finais deste processo de morte celular, por ser um marcador que interage com o DNA, mas não é capaz de atravessar a membrana plasmática, devido ao seu alto peso molecular. Assim, a marcação positiva para PI indica que há poros na membrana, fenômeno característico de processos de necrose ou estágio final de apoptose. As células foram cultivadas em placas de 6 poços até atingirem a confluência de 1 x 105 células/mL, carenciadas com meio sem soro e estimuladas a sair da fase G0 na presença dos compostos por 72 horas. Após a exposição a 1000 μg/mL do composto em estudo por 72 horas, o meio Materiais e Métodos 41 contendo as células HeLa foi tripsinizado,as células coletadas e lavadas com tampão PBS gelado. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 200 μL de tampão de ligação 1X. Adicionou-se 5 μL de Annexin V – FITC e 1 μL da solução de PI 100 μg/mL a cada 100 μL de suspensão celular. As células ficaram sob incubação por 15 minutos, a temperatura ambiente, mantidas sob proteção da luz. Após o período de incubação, foram adicionados 400 μL de tampão de ligação para anexina V 1X e as células foram analisadas em citômetro de fluxo, medindo a emissão de fluorescência para anexina V (530/30 nm) e PI (695/40 nm). A população foi separada em 4 grupos: células viáveis (baixos níveis de fluorescência), células em estágio inicial de apoptose (fluorescência verde), células em estágio final de apoptose (fluorescência em verde e vermelho) e células em necrose (fluorescência vermelha). A porcentagem de células em apoptose foi determinada a cada 30 mil eventos e os gráficos obtidos no experimento representam dados oriundos de 2 experimentos independentes. Para análise dos dados, o software FlowJo v. 7.6.3 (Tree Star, Inc., CA, USA) foi utilizado. 3.15. Análise do Ciclo Celular Para a avaliação dos efeitos do composto extraído sobre o ciclo celular, a mesma amostra utilizada no ensaio anterior foi utilizada. As células HeLa foram lavadas com tampão PBS gelado e o sobrenadante foi descartado. O pellet com as células foi então incubado com paraformaldeído 2%, lavado com PBS gelado e permeabilizado com saponina 0,01% por 15 minutos. Após este procedimento, as células foram incubadas com 10 μL de RNAse (4 mg/mL) a 37ºC por 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 5 μL de Iodeto de Propídeo (25 mg/mL), e 200 μL de PBS gelado às células que foram levadas ao citômetro de fluxo. A porcentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada a cada 20 mil eventos e os gráficos obtidos no experimento representam dados oriundos de dois experimentos independentes. Para análise dos dados, o software FlowJo v. 7.6.3 (Tree Star, Inc.) foi utilizado. Materiais e Métodos 42 3.16. Análises Estatísticas Os dados foram apresentados como média ± DP (desvio padrão) para o número indicado de experimentos e avaliados pelo teste ANOVA. A determinação da diferença entre os grupos foi realizada pelo teste Turkey-Kramer. Foram consideradas estatisticamente significativa as amostras com valores de P inferiores a 0,05. Resultados 43 4. RESULTADOS 4.1 Perfil eletroforético dos GAGS Após realizado os processos de extração e purificação do composto, as frações obtidas 2,0M, 2,5M e 3,0M foram reunidas e denominadas como fração 3,0M. Como etapa de caracterização do composto em estudo, foi realizada uma eletroforese em gel de agarose no sistema descontínuo Bário/PDA. F-3,0M Figura 11. Comportamento eletroforético em sistema descontínuo Ba/PDA utilizando o composto extraído do caranguejo Chaceon fenneri. Foram utilizados 5µ-10g para o padrão e heparina e, 10µg para a amostra do caranguejo. CS, condroitim sulfato; DS, dermatam sulfato; HS, heparam sulfato; M, mistura de CS, DS e HS; Hep, heparina; F-HEP, componente de migração rápida da heparina; S-HEP, componente de migração lenta da heparina; I-HEP, componente de migração intermediária da heparina; F-3,0M, composto tipo heparina obtido do caranguejo Chaceon fenneri. O resultado mostrou exclusivamente um composto com migração eletroforética semelhante à heparina/heparam sulfato (Figura 11). Além disso, podese observar que o composto apresenta os componentes de migração rápida e intermediária característicos da heparina, embora haja predominância do componente de migração rápida. Dessa forma, essas características se assemelham a caracterização do composto realizada por Andrade 2001. Resultados 44 4.2. Características estruturais do composto extraído do caranguejo C.fenneri Diante da semelhança no perfil eletroforético do composto com a heparina de mamíferos, foi realizada uma degradação com heparina liases. Os dissacarídeos resultantes da degradação estão mostrados na Figura 12. O composto obtido do caranguejo C. fenneri mostrou um elevado teor de dissacarídeos trissulfatados (ΔUA2S-GlcNS,6S), e nenhuma quantidade significativa de dissacarídeos Nacetilados (ΔUA-GlcNAc). Essa alta razão de dissacarídeos trissulfatados/Nacetilados é característica da estrutura de heparinas de mamíferos e por isso o composto foi denominado de tipo heparina. Tempo de Coleta (min) Figura 12. Cromatografia de exclusão por tamanho dos produtos digeridos de do composto tipo heparina obtido do caranguejo C.fenneri. Detecção a 232 nm; 100 mg heparina + 0,5 UI heparinases I, II, e III (F. heparinum). Resultados 45 4.3. Atividade anticoagulante in vitro do composto tipo heparina A atividade anticoagulante do composto tipo heparina foi avaliada usando o teste de determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), o qual reflete a via extrínseca da cascata de coagulação. Os resultados de atividade anticoagulante in vitro do composto tipo heparina e heparina são mostrados na tabela 3. O composto tipo heparina apresentou atividade anticoagulante máxima (tempo de coagulação 240 segundos) apenas com a concentração de 100μg/mL, enquanto a heparina atingiu essa atividade com a concentração de 2,3μg/mL. Tabela 1. Atividade anticoagulante in vitro do composto tipo heparina extraído do caranguejo Chaceon fenneri comparado a heparina. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE (segundos) Controle 32,6 ± 2,8 Concentração (µg/mL) Heparina Composto Tipo Heparina 0,003 32,5 ± 1,9 32,5 ± 1,9 0,16 32,7 ± 0,2 29,1 ± 2,2 0,26 39,0 ± 3,3 31,0 ± 0,2 0,3 52,1 ± 2,7 29,2 ± 0,9 1 133 ± 15 *** 31,6 ± 1,9 1,6 220 ± 28 30,6 ± 1,8 2,3 240 33,3 ± 0,8 3,3 240 34,1 ± 1,5 10 240 43,9 ± 1,0 16,6 240 51,6 ± 4,1 33,3 240 84,9 ± 4,0 *** 66,6 240 188,6 ± 9,1 100 240 240 O plasma foi suplementado com o composto tipo heparina do crustáceo C. fenneri e heparina em concentrações finais variando de 0,03 a 100 µg/mL. ***p<0.001 em relação ao controle. Os valores são expressos como a média do tempo em segundos ± desvio padrão (n=3). Resultados 46 4.3 Atividade hemorrágica O composto tipo heparina isolado do C. fenneri apresentou menor efeito hemorrágico quando comparado ao efeito da heparina de mamífero na mesma concentração (100μg/mL) (Figura 13). Figura 13. Atividade Hemorrágica. Baseado na potência de sangramento relacionada à quantidade de proteína liberada pela lesão em diferentes tempos. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). *p<0,05; **p<0.01; ***p<0.001 heparina vs composto tipo heparina para um mesmo tempo. 4.4 Efeito do composto tipo heparina do C.fenneri, heparina e heparam sulfato sobre a viabilidade de células tumorais e 3T3 O efeito do composto tipo heparina, heparina e heparam sulfato na viabilidade de diferentes células tumorais e 3T3 foi avaliado, após incubação por 72 horas, utilizando o ensaio de redução do MTT, como descrito em Métodos. A figura 14 mostra o efeito da heparina na viabilidade de diferentes linhagens celulares. A heparina não mostrou efeito citotóxico para células 3T3 e HS5, entretanto reduziu significativamente (p<0,01) a viabilidade das células B16-F10, HepG2 e HeLa, com Resultados 47 Figura 14. Efeito da heparina na viabilidade celular de diferentes tipos celulares. DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium; **p<0.01; ***p<0.001 vs controle (DMEM/RPMI). Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). Figura 15. Efeito do heparam sulfato na viabilidade celular de diferentes tipos celulares. DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium; **p<0.01; ***p<0.001 vs controle (DMEM/ RPMI). Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). Resultados 48 concentrações de 1μg/mL, 1000μg/mL e 1000μg/mL respectivamente. Enquanto, o heparam sulfato mostrou efeito citotóxico significativo (p<0,001) com uma concentração de 1000μg/mL apenas para uma das linhagens de células testadas (HeLa) (Figura 15). O composto tipo heparina não mostrou efeito citotóxico significativo para as linhagens 3T3 e HS5, entretanto, reduziu significativamente (p<0.001) a viabilidade das células, B16-F10, HeLa e HEP-G2 com concentrações de 1000μg/mL, observando-se ainda, para essa última linhagem, uma redução significativa da viabilidade celular com concentração de 0,1μg/mL (Figura 16). Dentre as linhagens que apresentaram o valor de IC50 (50% de inibição) para a concentração de 1000 µg/mL, as células tumorais HeLa, por terem apresentado maior número de células disponíveis para manuseio, foi a linhagem celular escolhida para dar continuidade a análise da ação do composto em estudo frente ao processo de morte celular. Figura 16. Efeito do composto tipo heparina do C. fenneri na viabilidade celular de diferentes tipos celulares. DMEM, Dulbecco's Modified Eagle Medium; **p<0.01; ***p<0.001 vs controle (DMEM/RPMI). Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3). Resultados 49 4.5. Indução de morte celular em linhagem tumoral HeLa pela ação do composto tipo heparina do caranguejo Chaceon fenneri 4.5.1 Detecção e quantificação de células apoptóticas induzidas pelo composto tipo heparina do caranguejo C. fenneri Diante do efeito citotóxico do composto tipo heparina frente às células tumorais HeLa, realizou-se a marcação dessa células com a solução Anexina V/PI após 72 horas de exposição a concentração de 1000μg/mL do composto tipo heparina (Figura 17). Observa-se que não houve diferença significativa entre a marcação positiva das células para Anexina V (indicador de apoptose), na presença do composto tipo heparina (7,14%), e a marcação positiva para Anexina V das células na ausência do composto tipo heparina (7,00%). O composto em estudo conseguiu diminuir em mais de 50% o número de células com marcação para necrose (p<0.001) (marcação com iodeto de propídeo) e em 15% o número de células que apresentam morte celular por apoptose tardia (p<0.001). A diminuição do número de células, nesse ensaio, indica que o composto ofereceu uma possível proteção celular contra apoptose. 4.5.2 Avaliação da parada de ciclo celular induzida pelo composto tipo heparina do caranguejo C. fenneri O efeito na proliferação das células também pode ser investigado com a análise do ciclo celular. A figura 18 mostra que houve pequena alteração do ciclo celular das células HeLa frente ao composto. Isso indica que o composto em estudo age sobre a parada do ciclo celular. Percebe-se um aumento do número de células na fase S do ciclo celular (p<0.001), como também, uma diminuição do número de células na fase G2 (p<0.001). Resultados 50 Figura 17. Citometria de fluxo de células HeLa tratadas com Anexina V/PI e composto tipo heparina. Analisadas em citômetro de fluxo FACScanto II com marcação para apoptose/necrose. A) Células controle. B) células tratadas com 1000 μg/mL do composto tipo heparina por 72horas. Q1:Anexina V negativo/PI positivo; Q2: Anexina V/PI positivos; Q3:Anexina V positivo/PI negativo; Q4: Anexina V/PI negativos. A análise dos dados de citometria de fluxo foram realizados utilizando o software FlowJo v. 7.6.3. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=2). ***p<0.001 controle negativo vs composto tipo heparina para um mesmo ponto. C. Negativo, controle negativo com células não tratadas; C. T. Heparina, composto tipo heparina, células tratadas com o composto de estudo. Figura 18. Avaliação de parada de ciclo celular após exposição ao composto tipo heparina do Chaceon fenneri. Após 72 horas de tratamento com o composto tipo heparina, as células HeLa foram fixadas, tratadas com RNAse, coradas com Iodeto de Propídeo e analisadas em citometria de fluxo para avaliação da distribição do ciclo celular. A análise dos dados para parada de ciclo celular foram realizados utilizando o software FlowJo v. 7.6.3. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=2). ***p<0.001 controle negativo vs composto tipo heparina para um mesmo ponto. C. Negativo, controle negativo com células não tratadas; C. T. Heparina, composto tipo heparina, células tratadas com o composto de estudo. Discussão 51 5. DISCUSSÃO O câncer é uma doença reconhecida por sete características: crescimento indefinido de células atípicas, autossuficiência em fatores de crescimento, evasão de apoptose, angiogênese sustentada, microambiente inflamatório e, eventualmente, invasão de outros tecidos e metástase (MANTOVANI, 2009). De acordo com a Organização Mundial de Saúde, 84 milhões de pessoas morrerão em decorrência do câncer entre 2005 e 2015 (WHO, 2007). Heparinas de baixo peso molecular parecem prolongar a sobrevida de pacientes com câncer (LAZO-LANGNER et al., 2007). Estudos em animais, utilizando heparinas não anticoagulantes indicam que é possível separar a atividade antitumoral da atividade anticoagulante da heparina (VLODAVSKY et al., 2006). Entretanto, a utilização de heparina como um agente antitumoral é limitada devido à sua potente atividade anticoagulante. Devido as heparinas de baixo peso molecular reterem alguma atividade anticoagulante, heparinas não anticoagulantes são preferíveis para potencial uso clínico porque podem ser administradas em doses elevadas, principalmente em pacientes com câncer que possuem complicações hemorrágicas (CASU, VLODAVSKY & SANDERSON, 2009). Para algumas das novas aplicações, em que a atividade anticoagulante não é necessária, as moléculas de heparina têm sido modificadas e a sequência pentassacarídica necessária para a atividade anticoagulante tem sido degradada de modo que os efeitos colaterais indesejados do sangramento sejam minimizados. Para essas heparinas modificadas, a atividade anticoagulante não pode ser utilizada para monitorizar a segurança e a eficácia destes produtos (MULLOY, HOGWOOD E GRAY, 2009). Por essa razão, várias pesquisas têm sido desenvolvidas com o objetivo de encontrar ou desenvolver moléculas de heparina com reduzida atividade anticoagulante para que possam atuar inibindo o crescimento tumoral e a metástase sem interferir no equilíbrio hemostático do organismo. Dessa forma, a busca de fontes naturais de heparina com baixo risco hemorrágico e possível aplicabilidade terapêutica/biotecnológica tem sido almejada por vários grupos de pesquisa em diversas partes do mundo. Nosso grupo tem isolado heparinóides de diferentes crustáceos (DIETRICH ET AL., 1999; CHAVANTE et al., 2000; ANDRADE, 2006; BRITO et al., 2008). Esses compostos apresentam baixa atividade anticoagulante e menor risco hemorrágico do que a heparina de Discussão 52 mamíferos. Assim, essas características tornam esses compostos viáveis como potenciais agentes terapêuticos, com baixo risco hemorrágico (ANDRADE, 2006; CHAVANTE et al., 2000). Medeiros e colaboradores (2000) caracterizaram compostos com migração eletroforética semelhante à heparina na espécie C. fenneri. Em seguida, Andrade (2001) comparou os glicosaminoglicanos presentes em diferentes tecidos (músculo, brânquia e víscera) do C. fenneri e evidenciou a presença exclusiva de um composto tipo heparina no tecido visceral dessa espécie. Dessa forma, as vísceras do caranguejo C. fenneri foram utilizadas com a finalidade de obtenção desse composto. Semelhante ao obtido por Andrade (2001), as vísceras do C. fenneri apresentaram exclusivamente um composto com componentes de migração eletroforética rápida e intermediária característicos da heparina de mamíferos no sistema de eletroforese em gel de agarose tampão BA/PDA. Entretanto, heparinóides obtidos de outros crustáceos mostraram predominância de componentes de migração rápida da heparina (CHAVANTE et al 2000, ANDRADE,2006;). Esse comportamento eletroforético semelhante ao componente de migração rápida da heparina foi observado também na heparina de baixa massa molecular isolada do camarão Penaeus brasilienses (DIETRICH et al., 1999). Esse maior teor de sulfatação do composto tipo heparina do C. fenneri pode ser explicado pelo ambiente desses crustáceos. O C. fenneri é um invertebrado marinho que vive em ambiente com profundidade superior a 300m, e por isso pode precisar de mecanismos especiais para a sobrevivência nesse habitat. Nader et al (1983) mostrou um aumento na quantidade e sulfatação de GAG em moluscos e crustáceos que vivem em ambientes com alto grau de salinidade, sugerindo um possível papel destes compostos na manutenção da coesão celular. Também foi mostrado que a Artemia franciscana (espécies de habitat com alto grau de salinidade) apresenta um heparam sulfato com mais sulfatação do que o heparam sulfato de mamíferos (CHAVANTE et al., 2000). O grau de sulfatação de um glicosaminoglicano é considerado um parâmetro importante para sua caracterização estrutural. Por esse motivo, enzimas específicas que reconhecem e produzem dissacarídeos com padrão de sulfatação característicos são utilizadas para caracterizar os glicosaminoglicanos. Heparina liases são enzimas comumente utilizadas para avaliar a composição dissacarídica de compostos tipo heparina/heparam sulfato. O composto tipo heparina do C. fenneri Discussão 53 após ação dessas enzimas mostrou um alto conteúdo de dissacarídeos trissulfatados (UA2S-GlcNS, 6S), e baixo teor de dissacarídeos N-acetilado (UAGlcNAc). A heparina possui menos de 5% de grupos acetil e a maioria das glucosaminas N-sulfatadas. Além disso, a heparina mostra maior grau de sulfatação (2,3 - 2,8 sulfatos / dissacarídeo) quando comparado ao heparan sulfatos (0,6 - 1,5 sulfato/ dissacarídeos). Por outro lado, o heparam sulfato apresenta domínios contendo glucosamina principalmente N-acetilada (SAMPAIO et al, 2006). Assim, o composto em estudo mostrou características semelhantes a heparina e por isso foi denominado de composto tipo heparina. O composto tipo heparina obtido do C. fenneri mostrou atividade anticoagulante significativamente menor do que a heparina comercial (193 UI). Essa menor atividade pode estar relacionada ao menor grau de sulfatação dos compostos quando comparados a heparina de mamífero. Essas características, além da predominância de resíduos de ácido glucurônico, também foram observadas para heparinóide obtido do camarão Litopenaeus vannamei (BRITO et al., 2008). Entretanto, apenas essas características não são essenciais para essa baixa atividade, uma vez que o heparinóide isolado do molusco Anomalocardia brasiliana também se mostra rico em resíduos de ácido glucurônico, porém possui elevada atividade anticoagulante (320 UI) (PEJLER et al., 1987; DIETRICH et al., 1989). A comparação entre esses animais mostra que a atividade farmacológica dos heparinóides pode variar de acordo com a sua origem o que está relacionado com algumas propriedades estruturais, como o padrão de sulfatação dos resíduos glucosamina que influenciam na conformação assumida pelos resíduos de ácido urônico, refletindo, por exemplo, na sua capacidade de se ligar à antitrombina. Ainda avaliando o comportamento farmacológico do composto tipo heparina isolado do caranguejo Chaceon fenneri, o menor risco hemorrágico oferecido pelo composto tipo heparina em estudo pode estar relacionado à estrutura do composto, uma vez que a sulfatação na posição C-6 do resíduo da glucosamina, tipo de ligação e a hexosamina podem ser limitantes para o efeito hemostático (DIETRICH et al.,1991). A potência de sangramento inferior a heparina, também, foi observada em outros crustáceos como no camarão Litopenaeus vannamei (BRITO et al., 2008) e no caranguejo Goniopsis cruentata (ANDRADE, 2006). Assim, o menor risco Discussão 54 hemorrágico do composto tipo heparina em estudo quando comparado com a heparina comercial, torna-os promissores agentes terapêuticos/ biotecnológicos. Além do efeito anticoagulante, a heparina atua também na supressão da progressão do câncer. Essa ação requer mecanismos como a diminuição da formação de trombina e fibrina, ligando-se a moléculas de adesão e a fatores angiogênicos, diminuição do efeito da heparinase e elevação do índice de apoptose (VAN DOORMAAL & BULLER, 2010; LAPIERRE et al., 1996). Em ensaio de viabilidade celular, variações importantes como o tipo de tumor, o tipo e dose da heparina e duração da exposição interferem na resposta celular desses compostos (NIERS et al., 2007). Dessa forma, a heparina pode reduzir o crescimento do tumor frente a células tumorais do tipo Sarcoma MSLS, Carcinoma Espinocelular, Melanoma B-16, células mesangiais glomerulares, linfoblastos, células tumorais de cólon HT29, SW1116 e HCT116, entre outras (BACK & STEGER, 1976; OHKOSHI, AKAGAWA & NAKAJIMA, 1993; ONO, ISHIHARA E ISHIKAWA, 2002; YIN et al., 2008; ERDURAN et al, 2007; CHATZINIKOLAOU et al 2009). Para a atividade citotóxica, GARG e colaboradores (2005) relataram o efeito das características estruturais da heparina informando que o aumento da densidade de carga afeta essa atividade e que o tamanho molecular de heparina não afeta a potência de inibição de crescimento celular. Observaram também que a presença de os grupos N-acetila e N-sulfo são importantes para as propriedades citotóxicas sendo relevante a presença de grupos 6-O-sulfo nos resíduos de glucosamina. Entretanto, o potente efeito da heparina sobre o equilíbrio hemostático do organismo limita o uso desse composto como agente antitumoral (CASU, VLODAVSKY & SANDERSON, 2009). A partir do resultado obtido no ensaio de viabilidade celular, foi utilizada a concentração de melhor efeito citotóxico para avaliação da indução de morte celular e da parada do ciclo celular pelo composto tipo heparina em estudo. A morte celular pode ser desenvolvida por mecanismo de necrose, sendo a forma passiva de morte celular associada à inflamação e perda da integridade da membrana plasmática quanto a sua permeabilidade devido a inibição da bomba Na+/K+ e, por mecanismo de apoptose caracterizado por ser um tipo de morte celular não associada à inflamação. A apoptose desempenha um papel em doenças auto-imunes, doenças malignas, e vários eventos patológicos e fisiológicos. Um dos aspectos que distingue a apoptose da necrose é a preservação da integridade da membrana plasmática que Discussão 55 evita a liberação dos constituintes celulares para o meio extracelular e, conseqüentemente, a quimiotaxia e a ativação de células fagocíticas. (MCCONKEY, 1998; ERDURAN et al., 2004; PATEL, 2000). O ciclo celular é controlado por uma família de quinases dependentes de ciclinas (CDKs, cyclin-dependent kinases), cuja atividade é modulada por diversos ativadores (ciclinas) e inibidores (CDKNs, cyclindependent kinases inibitors) (MALUMBRES & BARBACID, 2001). As vias de sinalização envolvidas no ciclo celular garantem que as células se dividam e, se necessário arrestam a divisão celular. Em pontos de checagem (checkpoints), a célula pode parar ou prosseguir no ciclo, dependendo de certos fatores presentes naquele momento do ciclo (KASTAN & BARTEK, 2004). O controle da proliferação celular ocorre, sobretudo, na fase G1, e a parada do crescimento de células de mamíferos pode ser concluída nesta fase, pela depleção de fatores de crescimento ou soro ou em condições de cultura sob alta densidade celular. O estado de parada de crescimento é alternativamente chamado de repouso, G0 ou fase quiescente do ciclo (BARSEGA, 1985). Na avaliação da parada do ciclo celular, houve aumento da fase S e diminuição da fase G2. Alguns dados da literatura indicam que os efeitos de agentes sobre o ciclo celular é específico da célula, podendo alguns resultados contradizer as observações de outros estudos. Pode haver, também, especificidade nas ações de diferentes agentes anti-mitógenos em um mesmo tipo de célula (VADIVELOO et al., 1997). Porém, alguns dados mostram que a heparina em concentrações altas (≥ 400μg/mL) pode aumentar o número de células em fase S ou diminuí-las quando presente em baixas concentrações (≤ 400μg/mL) (CASTELLOT JJ JR et al., 1989). Para a avaliação da indução de morte celular pelo composto tipo heparina em estudo, ao utilizar anexina-V marcada com FITC para detecção de apoptose é possível avaliar os níveis de fosfatidilserina expostas na membrana celular externa, indicando fase inicial de apoptose (apoptose precoce). Associando iodeto de propídio (IP), pode-se avaliar células com permeabilidade de membrana, o que pode indicar fase tardia de apoptose ou necrose. Uma vez que, tanto no processo de apoptose tardia, quanto na necrose, a anexina-V pode atravessar a membrana permeabilizada ao mesmo tempo em que o IP entra no citosol (PEC et al, 2003). Nesse ensaio, foi possível observar que a heparina de mamífero e o composto tipo heparina em estudo mostraram efeito citotóxico nos mesmos tipos de linhagens Discussão 56 celulares (Figuras 16 e 18). Os resultados também mostraram que não houve indução de apoptose nas células tumorais, mas a partir deles, pode-se ter indícios de que houve proteção contra as formas de morte celular por apoptose tardia/necrose. Dados disponíveis sugerem que apenas as doses elevadas de heparina e de algumas heparinas quimicamente modificadas podem inibir o crescimento do tumor primário em vários modelos de tumores (NIERS et al., 2007). Dessa forma, a concentração de 1000μg/mL pode não ter sido suficiente para induzir apoptose. O resultado obtido possivelmente pode concordar com dados da literatura que relatam um possível efeito anti-apoptótico proporcionado por baixas concentrações de GAGs. Como a heparina intracelular está presente em lisossomos, pode facilmente ser implicada na regulação da apoptose mediada entre lisossomos e mitocôndrias (YUE X-L et al., 2009; LINHARDT., 2004). Mesmo havendo a sugestão de um possível efeito anti-apoptótico, não se pode descartar o possível efeito antimetatástico do composto tipo heparina, pois se tem demonstrado repetidamente que a heparina tem efeito sobre a progressão do câncer (metástase), enquanto o seu efeito no crescimento de tumor tem sido bastante limitado (KRAGH et al., 2005; LEE et al., 1990; SCIUMBATA, CARETTO , PIROVANO , et al., 1996). A metástase hemática consiste de um processo em várias etapas em que células tumorais entram na circulação sanguínea, escapam das respostas imunes, aderem ao endotélio de órgãos distantes, extravasam e colonizam o tecido (STEEG, 2006; GUPTA & MASSAGUE, 2006). O efeito anti-metastático pode ser devido à sua capacidade de inibir a ligação do fator de crescimento à superfície celular, conduzindo à inibição da angiogênese. A heparina também pode inibir a ação da heparinase e a adesão, agindo sobre L- e P-selectina (WEI et al., 2004; DOORMAAL & BÜLLER, 2010). Para as células cancerígenas metastáticas, heparanase e heparinase são expressas e degradam a auxiliando migração celular através de matriz extracelular a (SMORENBURG & NOORDEN, 2001). Com super expressão de selectinas em células cancerígenas, a heparina medeia a inibição da interação de células de tumor com a agregado plaquetário e o endotélio vascular, sendo esse, aparentemente, o mecanismo predominante da atenuação das fases iniciais da metástase. Para a inibição de fatores de crescimento, heparanase, e selectinas, os requisitos estruturais dos compostos tipo heparina não são os mesmos para os diferentes eventos biológicos. As heparinas sem o resíduo N-acetilado representam Discussão 57 um exemplo de aplicação de uma heparina não-anticoagulante que inibe o câncer, em modelos animais, sem efeitos secundários indesejados (CASU, VLODAVSKY & SANDERSON, 2009). Além disso, foi recentemente mostrado que a heparina tem uma atividade indutora de apoptose no interior das células interagindo com vários fatores de transcrição (BAE, MOK & PARK 2008; BERRY et al 2004). Há dados que relatam sobre o possível anti-apoptótico da heparina como dados mostrados por Yue X-L e colaboradores, em que um modelo de fibroblastos da pele submetidos a um stress oxidativo, uma molécula análoga a heparina protege o lisossomo contra ruptura da membrana, reduz os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio, e inibe potencial colapso da membrana mitocondrial, a liberação do citocromo c e ativações das caspases-9 e -3 sem afetar a via extrínseca da apoptose. Recentemente, tem-se relatado o efeito anti-apoptótico da heparina em células acometidas pelo mal de Alzheimer. O aumento da secreção do peptídio βamilóide, Aβ, tem sido associado com a doença de Alzheimer e tem sido mostrado que, em culturas de células, Aβ em doses micromolares pode ser citotóxico (LI-NA HAO et al., 2010). A constatação de que Aβ pode causar apoptose in vitro reforça a noção de que a apoptose está desregulada em patologias de doenças neurodegenerativas (ENGIDAWORK et al., 2001). Heparinas de baixo peso molecular podem bloquear o aumento da caspase-3 e diminuir a expressão Bcl-2 induzida por Aβ25–35. Duas das principais proteínas responsáveis pela regulação da morte celular por apoptose são bcl-2 e a caspase-3 (LI-NA HAO et al., 2010). A Bcl-2 é uma proteína 26kDa encontrada no envelope nuclear, partes do retículo endoplasmático, e da membrana mitocondrial externa. Foi evidenciado que a proteína Bcl-2 é capaz de bloquear o mecanismo apoptótico (CLEMENTI et al., 2006). As caspases são uma família de proteases cisteínicas e são mediadores críticos de morte celular programada. A ativação da caspase-3 parece ser um acontecimento chave na execução da cascata de apoptose em doenças do sistema nervoso central (AWASTHI et al., 2005). As moléculas de heparina podem inibir evento inicial do processo apoptótico, diminuir o número de células apoptóticas e melhorar a caracterização morfológica celular, podendo prevenir a apoptose neuronal induzida por Aβ25-35 (LI-NA HAO et al., 2010). Tian-Gui Yu e colaboradores (2008) também relataram outro efeito neuroprotetor da heparina em que heparina de baixo peso molecular tem capacidade neuroprotetora para Discussão 58 antagonizar a apoptose induzida pelo glutamato em células corticais, através de redução de liberação Ca2+ e de modulação de processos apoptóticos. Mais estudos são necessários para se elucidar o efeito anti-apoptótico neuroprotetor da heparina. O progresso nesta área irá abrir uma nova e promissora estratégia terapêutica em diferentes patologias, em que o estresse oxidativo e a morte celular atuam, inclusive, em doenças neurodegenerativas (X-L YUE et al., 2009). Assim, partindo-se do conhecimento do baixo efeito sobre o equilíbrio hemostático oferecido pelo composto tipo heparina extraído do caranguejo C. fenneri, são necessários mais estudos para afirmar um possível efeito antimetastático, como também, um possível efeito anti-apoptótico em células não tumorais a fim de averiguar a sua possível atuação protetora frente ao processo apoptótico presente em outras doenças. Conclusão 59 6. CONCLUSÃO O composto tipo heparina das vísceras do caranguejo Chaceon fenneri foi obtido na fração 3,0 molar de NaCl. Esse composto apresenta um perfil eletroforético parecido com a heparina e o heparam sulfato, apresentando, predominantemente, o componente de migração rápida correspondente ao da heparina de baixo peso molecular ou do heparam sulfato. O composto tipo heparina obtido do caranguejo Chaceon fenneri apresentou baixa atividade anticoagulante in vitro utilizando o ensaio de TTPA quando comparada a heparina comercial, como também, não mostrou efeito hemorrágico residual utilizando o modelo de escarificação da cauda de rato. O composto tipo heparina em estudo apresentou uma taxa de inibição de células HeLa, B16-F10 e Hep-G2 semelhante ao heparam sulfato com valor de IC50 de 1,000 ug / mL. Além disso, o composto do crustáceo apresentou um desempenho citotóxico melhor do que a heparina de mamífero. O composto extraído diminuiu a morte celular de células HeLa em apoptose tardia/necrose e agiu sobre o ciclo celular aumentando o número de células em fase S. A elucidação desse mecanismo faz-se necessária para se averiguar a possível ação farmacológica do composto e sua potencial atuação contra a morte celular induzida em outras doenças. Referências 60 7. REFERÊNCIAS ADAMS, J.M. Ways of dying: multiple pathways to apoptosis. 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