XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Polimorfismos na Região Promotora do Gene do Receptor da Melatonina em Búfalas da Amazônia 1
Polymorphism in Promoter Region of the Melatonin Receptor Gene in Buffaloes from Amazon
Lorena Keyse Nery da Silva2, Beijiane Botelho de Souza2, Rafaelle Casseb Guimarães2, Arely Porto
Matins2, Elizabeth Machado Barbosa3, Evonnildo Costa Gonçalves4, Juliana Simão Nina de Azevedo5 e
Ednaldo da Silva Filho5.
1
Parte do Doutorado de Elizabeth Machado Barbosa do curso de Pós-graduação em Ciência Animal da
Universidade Federal do Pará.
2
Acadêmicas do Curso de Zootecnia da Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém-PA, Brasil.Email: [email protected]
3
Doutoranda do Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Federal do Pará BelémPA, Brasil.
4
Docente do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, Belém-PA, Brasil.
5
Docentes da Universidade Federal Rural da Amazônia, Belém-PA, Brasil.
Resumo: O objetivo do trabalho foi identificar polimorfismos da região Promotora do Gene do Receptor
da Melatonina 1A (MTRN1A) em búfalas criadas em terra firme no estado do Pará. Um total de 31
amostras de pelos de búfalas foi coletado e foi extraído o DNA pelo método fenólico. Em seguida, foram
realizadas as Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando-se dois pares de iniciadores
desenvolvidos de acordo com a referência AY524665.1 do Genebank (PI: For
TTTTTCATCTCTTACCATCTAG e Rev GCGAGACGTTGAGCAGC para 810 pb e PII: For
GCACAAAAAGAAGCCAAGG e Rev CCAGGTTCCTCATCTGTAAAATG para 887 pb). Os produtos
dos PCRs foram purificados e sequenciados. Após edição e análise das sequências, todos os genótipos
foram tabulados e o programa GENEPOP v.5.foi usado para determinar as frequências genotípicas e
alélicas, os coeficientes de endocruzamento (Fis) e as probabilidades para o equilíbrio de HardyWeinberg. Um total de 26 pontos polimórficos (SNPs) foi detectado, sendo a maioria de substituições de
transição. Um bloco de deleção de ACAA foi detectado em 35% das amostras. A população apresenta
desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P<0,05) e Fis positivo. Contudo, os polimorfismos revelaram
que a população encontra-se com alto grau de consanguinidade, no entanto, seria necessário avaliar um
número maior de animais e associar os polimorfismos com características reprodutivas das búfalas para
revalidá-los como marcadores de seleção.
Palavras–chave: búfalas, melatonina, região promotora
Abstract: The objective was to identify polymorphisms in the Receptor Gene Melatonin 1A (MTRN1A)
Promoter region in buffaloes created in the Pará state continent. A total of 31 buffalo samples were
collected and DNA was extracted by phenol method. Next, the Polymerase Chain Reactions (PCR) were
performed using two pairs of primers designed according to the GenBank reference AY524665.1 (PI: For
and Rev TTTTTCATCTCTTACCATCTAG GCGAGACGTTGAGCAGC 810 bp and PII: For and Rev
GCACAAAAAGAAGCCAAGG CCAGGTTCCTCATCTGTAAAATG 887 bp). The PCR products
were purified and sequenced. After sequences editing and analysis, all genotypes were tabulated and the
GENEPOP v.5. program was used to determine the allele and genotype frequencies of the inbreeding
coefficient (FIS) and the Hardy-Weinberg equilibrium probabilities. A total of 26 polymorphism points
(SNPs) were detected, most of the transition substitutions. A block ACAA deletion was detected in 35%
of samples. The population has Hardy-Weinberg equilibrium deviations (P <0.05) and positive Fis.
Polymorphisms revealed that the population is in a high degree of inbreeding, however, we need to
evaluate a greater number of animals and make polymorphisms association with buffaloes reproductive
traits to revalidate them as selection markers.
Keywords: buffaloes, melatonin, promoter region
Introdução
Os programas de melhoramento genético de animais de produção, entre eles os bubalinos, estão
obtendo excelentes resultados em várias características desejáveis que possibilitem melhores
performances de produção e reprodução(GARCIA et al., 2006). Carcagiu et al. (2011), examinaram o
polimorfismo do MTRN1A em relação a sazonalidade reprodutiva de búfalas mediterrâneas na Itália,
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demonstrando a presença do polimorfismo e que nestes animais há uma influência direta na atividade
reprodutiva sazonal. O objetivo do trabalho foi identificar polimorfismos da região Promotora do Gene do
Receptor da Melatonina 1A (MTRN1A) em búfalas criadas em terra firme no estado do Pará.
Material e Métodos
Um total de 31 amostras de pelos de búfalas foi coletado da região de Terra Firme do Estado Pará
e foi extraído o DNA pelo método fenólico. Em seguida, foram realizadas as Reações em Cadeia da
Polimerase (PCR) utilizando-se dois pares de iniciadores desenvolvidos de acordo com a referência
AY524665.1
do
Genebank
(PI:
For
TTTTTCATCTCTTACCATCTAG
e
Rev
GCGAGACGTTGAGCAGC para 810 pb e PII:
For GCACAAAAAGAAGCCAAGG e Rev
CCAGGTTCCTCATCTGTAAAATG para 887 pb). Após edição o fragmento final é de 1610 pb. As
reações tiveram volume final de 15µL contendo: 50-100ng de DNA genômico, 10 pM de cada um dos
iniciadores (forword e reverse), 1 X de Buffer (10X com 1 mM de MgCl2), 1 U de Taq DNA Polimerase
(Life Technology), 1,25 mM de dNTP (cada base nitrogenada), 20% da reação de Solução-Q, diluídos em
água ultrapurificada. A temperatura de desnaturação inicial foi de 95˚C por 10 minutos, seguido por 30
ciclos de 94˚C por 1 minuto, as temperaturas de hibridização de cada iniciador foram: 54ºc e 58ºc, para PI
e PII, respectivamente a 1 minuto, e temperatura de extensão a 72˚C por 1 minuto. Finalizando com
temperatura de extensão final a 72˚C por 10 minutos e posteriormente, visualizados em gel de agarose
1,5% contendo Gelred (Biotium – California/USA).
Os produtos dos PCRs foram purificados com a enzima Illustra ExoProStar 1-Step (GE
Healthcare – UK), seguindo as recomendações do fabricante. Os produtos purificados foram
sequenciados utilizando kit BIG DYE (Life Technology) em sequenciador automático de DNA ABI 3500
XL (Applied Biosystem). Após edição e análise das sequências, todos os genótipos foram tabulados e o
programa GENEPOP v.5 (RAYMOND; ROUSSET, 1995) foi usado para determinar as frequências
genotípicas e alélicas, os coeficientes de endocruzamento (Fis) e as probabilidades para o equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Considerou-se 0,05 como nível de significância.
Resultados e Discussão
Um total de 26 pontos polimórficos (SNPs) foi detectado e suas respectivas análises estão
descritos na tabela 1. Um bloco de deleção de ACAA foi detectado em 35% da amostra (Tabela 1). A
população apresenta desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg (P<0,05) e alto grau de consanguinidade
(Fis positivo).
Tabela 01- Polimorfismos detectados na região promotora do gene da melatonina em búfalas
Loci (Substituição)
-1511 (C→T)
-1465 (G→T)
-1422 (A→G)
-1411 (G→A)
-1395 (G→T)
-1298 (A→G)
-1295 (G→A)
-1242 (A→C)
-1150 (C→T)
-1147 (G→C)
-1136 (A→G)
-911 (G→A)
-909 (A→G)
-724 (C→G)
-656 (A→C)
-649 (T→C)
-644 (G→A)
-511 (A→C)
-481 (G→A)
Genótipos (Frequência)
CC = 0,45
GG=0,94
AA=0,68
AA=0,70
GG=0,81
AA=0,74
AA=0,04
AA=0,83
CC=0,75
GG=0,04
AA=0,42
AA=0,06
AA=0,70
CC=0,84
AA=0,58
CC=0,23
AA=0,52
AA=0,13
AA=0,10
CT=0,00
GT=0,00
AG=0,16
AG=0,00
GT=0,06
AG=0,20
AG=0,13
AC=0,13
CT=0,16
GC=0,09
AG=0,00
AG=0,19
AG=0,13
GC=0,12
AC=0,06
CT=0,06
AG=0,06
AC=0,13
AG=0,10
TT=0,55
TT=0,06
GG=0,16
GG=0,30
TT=0,13
GG=0,06
GG=0,83
CC=0,04
TT=0,09
GG=0,87
GG=0,58
GG=0,75
GG=0,17
GG=0,04
CC=0,36
TT=0,71
GG=0,42
CC=0,74
GG= 0,80
Alelos (Frequência)
Fis
PHW
C=0,45
G=0,94
A=0,76
A=0,70
G=0,84
A=0,84
A=0,09
A=0,91
C=0,83
C=0,08
A=0,42
A=0,16
A=0,77
C=0,91
A=0,62
C=0,26
A=0,54
A=0,20
A=0,14
1,00
1,00
0,57
1,00
0,77
0,30
0,28
0,28
0,46
0,36
1,00
0,30
0,64
0,30
0,87
0,84
0,87
0,60
0,62
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,15
0,23
0,23
0,03
0,16
0,00
0,15
0,04
0,23
0,00
0,00
0,00
0,00
0,01
T=0,55
T=0,06
G=0,24
G=0,30
T=0,16
G=0,16
G=0,91
C=0,09
T=0,17
G=0,92
G=0,58
G=0,84
G=0,23
G=0,09
C=0,88
T=0,74
G=0,46
C=0,80
G=0,86
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-425 (C→T)
-395 (G→A)
-383 (G→T)
-254 (C→T)
-206 (T→C)
-133 (T→G)
-94 (C→T)
Bloco de Deleção
CC=0,96
AA=0,04
GG=0,55
CC=0,91
CC=0,58
GG=0,68
CC=0,55
-1483 a 1480
CT=0,00
AG=0,00
GT=0,03
CT=0,03
CT=0,13
GT=0,10
CT=0,03
TT=0,04
GG=0,96
TT=0,42
TT=0,06
TT=0,29
TT=0,22
TT=0,42
C=0,96
A=0,04
G=0,56
C=0,92
C=0,65
G=0,73
C=0,56
T=0,04
G=0,96
T=0,44
T=0,08
T=0,35
T=0,27
T=0,44
1,00
1,00
0,94
0,79
0,73
0,76
0,94
0,02
0,02
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
ACAA=0,35
Comparando a sequência detectada do promotor do gene do receptor da Melatonina em búfalas
com a do Genebank foram observados 26 substituições, sendo 17 do tipo transição e 9 transversão. Essas
substituições podem ser encontradas ao longo de todo genoma e, quando detectada no gene (Éxon), a
mesma pode influenciar na modificação da sequência de aminoácidos (HUNT et al., 2009). Contudo,
quando as substituições ocorrem na região promotora dos genes, neste caso, poderá ocorrer alterações na
expressão dos genes (KININIS; KRAUS, 2008). O que poderia resultar em diferentes desempenhos
reprodutivos das búfalas quanto ao tempo de intervalos de partos. As frequências alélicas e genotípicas
foram altas para os alelos e genótipos selvagens na maioria dos SNPs, o que explica o alto grau de
consanguinidade, sendo assim, as frequências genotípicas observadas e esperadas apresentaram
diferenças significativas (P<0,05), resultando nos desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg, como
observado para marcadores microssatélites (SILVA FILHO et al., 2014).
Conclusões
A região promotora do gene do receptor da melatonina em búfalas apresentou 26 SNPs, sendo a
maioria de substituições de transição. Os polimorfismos revelaram que a população encontrasse com alto
grau de consanguinidade, o qual resultou nos desvios de Hardy-Weinberg. Seria necessário avaliar um
número maior de animais e associar os polimorfismos com características reprodutivas das búfalas para
revalidá-los como marcadores de seleção.
Literatura citada
CARCANGIU, V.; MURA, M.C.; PAZZOLA, M.; VACCA, G.M.; PALUDO, M.; MARCHI, B.;
DAGA, C.; BUA, S.; LURIDIANA, S. Characterization of the Mediterranean Italian buffaloes melatonin
receptor 1ª (MTNR1A) gene and its association with reproductive seasonality. Theriogenology, 76, 419–
426 p., 2011.
GARCIA, A.R.; GONÇALVES, K.S.; NAHÚM, B.S.; MATOS, L.B.; BARBOSA, D.L.M.; SIMÕES,
A.R.; MONTEIRO, P.J.C. Eficiência da detecção de estros em fêmeas bubalinas (Bubalus bubalis)
criadas na Amazônia. In: Anais... Gramado: 17º Congresso Estadual de Medicina Veterinária, Brasil.
Gramado: SOVERGS. 3051-3056p.,2006.
HUNT, R; SAUNA, Z.E; AMBUDKAR, S.V; GOTTESMAN, M.M; KIMCHI-SARFATY, C. Silent
(synonymous) SNPs: should we care about them. Methods Mol Biol.; 578: 23-39p. 2009.
KININIS, M., KRAUS W.L., A global view of transcriptional regulation by nuclear receptors: gene
expression, factor localization, and DNA sequence analysis. Nucl. Recept. Signal.2008.
RAYMOND M.; ROUSSET F. GENEPOP (version 1.2): population genetics software for exact tests and
ecumenicism. J. Heredity, v. 86, 248-249 p., 1995.
SILVA, F.E.; SILVA, M.H.; CAMPELO, J.E.G.; DEROSIA, M.R.; PINHEIRO, L.M.L.; ALMEIDA,
M.J.O. Genetic characterization of Curraleiro Pé-Duro bovine breed from a conservation herd of
Brazilian semiarid. Genetics and Molecular Research 13: 2149-2154p. 2014.
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