6º Período de Biomedicina – FUPAC
04/06/12
Ana Carolina de Morais Oliveira
Biomédica
Sistema Imunológico
Função: responder contra substâncias estranhas
Anticorpos
Proteínas solúveis

plasma

saliva

secreções do trato digestivo

secreções do trato respiratório

secreções do trato urogenital
Neutralização de microrganismos
e
Auxiliam na destruição dos mesmos
Anticorpos
Anticorpos
Acs são ESPECÍFICOS para
um determinado Ag
Anticorpos
Acs de classes
DIFERENTES
Imunoprecipitação
INTERAÇÃO
Antígeno solúvel
ANTÍGENO-ANTICORPO
[Ag] + [Ac]
Ac
[Ag-Ac]
Ag solúvel
Precipitado
Antígeno macromolecular solúvel

Sensibilidade

Especificidade

(10-3)
Imunoprecipitação
Formação do precipitado:
Eletrólitos usados no tampão

pH

Temperatura

Tempo de reação

Pureza do ágar

Concentrações do antígeno e do
anticorpo.

A precipitação máxima ocorre em
áreas de equivalência
[Ag] = [Ac]
Imunoprecipitação
Imunodifusão Radial
Simples
Imunodifusão Radial
Dupla
Ac
Ac no gel
Ag
Ag
Imunoeletroforese

Realizado em 2 etapas:


Separação dos componentes por eletroforese
Imunodifusão de cada componente (contra o anti-soro)
Imunoeletroforese
Aglutinação
Reação de aglutinação
Imunoprecipitação
Antígeno particulado
Antígeno solúvel
[Ag] + [Ac]

Aglutinação direta ativa
Ag particulado
Ac
Ag solúvel
Precipitado
Ac
+
Antígeno macromolecular solúvel

Sensibilidade


[Ag-Ac]
Aglutinação indireta passiva
Especificidade

(10-3)
Aglutinação
Função:
Diagnóstico laboratorial de doenças:

Vírus

Bactérias

Protozoários

Fungos

Doenças autoimunes

Tipagem sanguínea – ABO

Realizado em
placa ou tubo
ABO – reação de aglutinação direta
Amostra de sangue na lâmina
A
AB
B
O
Aglutinação no látex




Partículas de látex  esferas de poliestireno, suportes na
adsorção de proteína solúvel e antígenos polissacarídicos
Resultados obtidos rapidamente
Ex.: Salmonella, Listeria, Legionella, E. coli, Campylobacter,
Staphylococcus, Streptococcus.
Ex.: Detecção de fator reumatóide
Não marcados
1900
1910 a 1920
Marcados
1950
Precipitação
Aglutinação
Imunoensaios
ELISA
ELISA

Detectar a presença de Ag ou Ac
fluidos corporais ou sobrenadantes
de cultura
Princípio Básico
Substrato
Mudança
de cor
Enzima
Ac ou Ag
Oxidação de um cromógeno
ELISA

Permite detecção de quantidades pequenas de Ag ou Ac
Especificidade
• Qualitativo ou quantitativo
• Atividade enzimática  proporcional à [ ] de Ag ou Ac da
amostra
Como é realizado o teste
• Ag purificado (detectar ou quantificar Ac)
ou
• Ac purificado (detectar ou quantificar Ag)
• Controles (Positivo, Negativo)  ensaios qualitativos
ou
• Padrões  ensaios quantitativos
• Amostras a serem testadas
• Tampão de lavagem
• Conjugado = Ac ou Ag
ligado covalentemente a
uma enzima
DO
• Cromógeno
Cromógenos
2,2’-diazino 3etilbenzotiazolino-6ácido sulfônico
(ABTS)
Ortofenilenodiamino
(OPD)
H2SO4
405 nm
492 nm
3,3',5,5'Tetramethylbenzidine
(TMB)
H2SO4
450 nm
Vantagens

Sensibilidade  10-9

Especificidade  menor risco de falso-positivos

Várias amostras testadas ao mesmo tempo

Rápido / Simples

Baixo custo comparado com outras técnicas
Vantagens



Não trabalha com radioisótopos;
Pode ser adaptado tanto a testes manuais quanto à
automação;
Não depende de formação de precipitado, aglutinado.
Desvantagens

Reagentes podem degradar com facilidade
 Exposição
à luz
 Elevadas temperaturas

Como é sensível e específico  susceptível a:
 Erros
de pipetagem
 Variações nos tempos de incubação
 Variações nas lavagens
 Alterações nos reagentes
Tipos de ELISA

Ensaio pobre para pesquisar Ag brutos

Útil para titulação de Ac conjugados
Antígeno  Sensibilização
Bloqueio PBS-T-BSA 1%
Conjugado = Ac + enzima
Substrato + Cromógeno (ABTS)
Tipos de ELISA

Detectar Ac

Diagnóstico de doenças
Antígeno  Sensibilização
Bloqueio PBS-T-BSA 1%
Amostra do paciente  Ac de interesse
Conjugado = Ac + enzima
Substrato + Cromógeno (ABTS)
Tipos de ELISA

Detectar Ag

Dosagem de hormônios, proteínas
séricas, citocinas...
Anticorpo específico  Sensibilização
Bloqueio
Amostra com Antígeno de interesse
Conjugado = Ac + enzima
Substrato + Cromógeno (TMB)
H2SO4 2N
ELISA
Vídeo
Kit ELISA
Immunobloting
INTERAÇÃO
ANTÍGENO-ANTICORPO

Ensaio imunoenzimático = Western blotting

Valioso recurso na:
 Caracterização
de frações antigênicas
imunodominantes
 Identificação da reatividade específica de um Ac com
uma fração do Ag (teste confirmatório ou suplementar)
SDS-Page e Immunobloting
Membrana de nitrocelulose
Antígeno
Immunobloting
Bloqueio
5% leite desnatado – PBS-T
1h - TA
Soro paciente (IgG)
1:2000 – 1h - TA
gel de poliacrilamida
Anti-IgG – peroxidase
1:2000 – 1h - TA
Revelação
DAB
SDS-Page
SDS-Page
SDS-Page
Vídeos de Immunobloting
1
2
Slot blot


Uma simplificação do immunobloting
Proteínas aplicadas diretamente na membrana
Slot blot
Slot blot
Slot blot
Bloqueio
5% leite desnatado – PBS-T
1h - TA
Soro paciente (IgG)
1:2000 – 1h - TA
Anti-IgG – peroxidase
1:2000 – 1h - TA
Revelação
DAB
Ana Carolina
[email protected]