Anais do XV Encontro de Iniciação Científica da PUC-Campinas - 26 e 27 de outubro de 2010
ISSN 1982-0178
APLICABILIDADE DO LASER DE BAIXA INTENSIDADE NO
REPARO DO COLÁGENO DAS LESÕES DE CÁRIE DENTINÁRIAS
– ESTUDO MORFOMÉTRICO
Daniele Lobo Silva
Faculdade de Odontologia
Sérgio Luiz Pinheiro
Dentística minimamente invasiva
Centro de Ciências da Vida
Centro de Ciências da Vida
[email protected]
[email protected]
Resumo: o objetivo desse trabalho foi avaliar o colágeno reorganizável da dentina afetada após laserterapia. Amostras da dentina afetada foram coletadas
antes e após o selamento da lesão de cárie, coradas
em Sirius Red (SR) e analisadas no programa Tpsdig: grupo controle- remoção parcial do tecido cariado (RPTC), selamento da cavidade com guta-percha
(GP) e cimento de ionômero de vidro (CIV); grupo
experimental- RPTC, laserterapia, GP e CIV. O protocolo de aplicação do laser foi: 1} Aplicação do laser
de baixa intensidade (LBI) na dentina afetada com
2J/cm2 no infravermelho; 2} Terapia fotodinâmica: LBI
e azul de toluidina 0,005%; 3} LBI no centro da face
2
vestibular e lingual com 3J/cm no infravermelho .
Para a medição do colágeno reversivelmente alterado, as áreas intensamente coradas com SR foram
demarcadas para mensuração da porcentagem representativa dessas áreas em relação à área total de
cada amostra. O padrão ouro para calibração da demarcação das áreas de colágeno foi amostras de
dentina hígida coradas em SR. As avaliações foram
realizadas por 2 examinadores calibrados cegos. Os
resultados foram submetidos ao teste ANOVA pareado (amostras relacionadas). A aplicação do protocolo
de laserterapia acarretou em aumento significativo de
77.16% das áreas de colágeno organizado na dentina afetada (p<0.001). O selamento cavitário promoveu o reparo de 64.93% do colágeno dentinário, não
apresentando aumento estatisticamente significativamente (p>0.05). O protocolo de laserterapia utilizado nesse trabalho está indicado para estimular o reparo do colágeno reversivelmente alterado na dentina afetada.
Palavras-chave: laser, lesão de cárie dentinária,
colágeno.
Área do Conhecimento: Grande Área do Conhecimento: Ciências da Saúde – Sub-Área do Conhecimento: Odontologia – CNPq.
1. INTRODUÇÃO
A dentística minimamente invasiva preconiza a ma-
nutenção da dentina afetada pela doença cárie e os
métodos para avaliar o colágeno após a restauração
cavitária são bastante escassos. A doença cárie dentária é transmissível, de caráter invasivo e destrutivo,
que pode levar à perda do tecido dentário [1]. O processo da doença cárie inicia-se com a deposição do
biofilme sobre a superfície dental principalmente nas
faces oclusais [2].
A lesão cariosa é caracterizada por desmineralização
da porção inorgânica e desorganização da parte orgânica, resultando na desnaturação do colágeno.
Alguns autores relataram à presença de duas camadas distintas na lesão de cárie dentinária. A região
mais superficial possui consistência amolecida e apresenta destruição nas ligações cruzadas do colágeno, dentina intertubular desmineralizada com cristais irregularmente espalhados, prolongamento dos
odontoblastos e dentina peritubular ausentes, túbulos
dentinários invadidos por bactérias ou com cristais
livremente espalhados no seu interior. A camada
mais profunda apresenta-se endurecida, com alterações reversíveis do colágeno, dentina inter e peritubulares parcialmente desmineralizadas e presença
dos prolongamentos odontoblásticos [1,3-6]. Banerjee et al. (2000) [7] descreveram seis camadas na
lesão de cárie dentinária: (1) camada externa, irreversivelmente desmineralizada, denominada dentina
infectada; (2-4) dentina afetada, reversivelmente
desmineralizada, compreendida pela camada externa, transparente e subtransparente; (5) dentina hígida; (6) fina camada de dentina adjacente ao tecido
pulpar.
A camada mais profunda da lesão de cárie dentinária, a dentina afetada, tem capacidade de reorganização e pode ficar na cavidade. Métodos de redução
microbiana e estímulo para o reparo dentinário são
avaliados na literatura. O uso da terapia fotodinâmica
pode ser uma alternativa como coadjuvante para redução microbiana [8] e pode ser associada à aplicação do laser para estímulo de neoformação tecidual.
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Na terapia fotodinâmica, a luz emitida por um laser
de baixa potência ativa um fotossensibilizador específico que passa a demonstrar um efeito letal sobre
microrganismos [9-14]. A terapia consiste de um agente fotossensibilizante normalmente exógeno e
uma fonte de luz com o objetivo de provocar necrose
celular ou morte microbiana. O mecanismo de ação
se dá quando o agente fotossensibilizante absorve os
fótons da fonte de luz e seus elétrons passam para
um estado excitado. Na presença de um substrato
(como, por exemplo, o oxigênio), o fotossensibilizador ao retornar ao seu estado natural, transfere sua
energia ao substrato, formando espécies de vida curta e altamente reativas, como o oxigênio singleto,
provocando sérios danos aos microrganismos via
8
oxidação irreversível de componentes celulares .
Dessa forma, a utilização de um protocolo de laserterapia, associando a capacidade de redução microbiana com o estímulo de reparo e neoformação dentinária para recuperação da dentina afetada, pode ser
uma alternativa clínica importante para o dentista.
Portanto, O objetivo desse trabalho foi avaliar o colágeno reorganizável da dentina afetada após laserterapia.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Considerações Éticas - O presente trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Pontifícia
Universidade Católica de Campinas, Campinas, São
Paulo, Brasil. (protocolo Nº 637/05).
Tipo de Estudo – Estudo clínico com distribuição aleatória. A distribuição da amostra entre grupos controle (sem laserterapia) e experimental (com laserterapia) foi feita de forma aleatória com exceção dos
dentes que apresentaram lesão de cárie com espessura de dentina remanescente inferior a 1mm e/ou
sintomatologia de inflamação pulpar transitória que
foram alocados no grupo experimental.
Critérios de eleição:
Inclusão:
•
Pacientes com lesão de cárie ativa em metade interna de dentina sem envolvimento pulpar, caracterizado por ausência de radiolucidez nas regiões
periapicais e de furca;
•
Sintomatologia de inflamação pulpar reversível ou transitória;
•
Pacientes que aceitaram participar da pesquisa e assinaram o Termo de Consentimento.
Exclusão:
•
Lesão de cárie com envolvimento pulpar;
•
Dentes com sintomatologia de inflamação
pulpar irreversível;
•
Dentes com sinais clínicos e radiográficos de
necrose pulpar;
•
Pacientes que não aceitaram participar da
pesquisa ou não assinaram o Termo de Consentimento.
Amostra - Foram selecionados pacientes com lesão
de cárie ativa em metade interna de dentina na Clínica Odontológica da PUC-Campinas. No grupo controle, foram incluídas cinco amostras com lesão de
cárie ativa em metade interna de dentina e no grupo
experimental dez amostras.
Procedimentos clínicos – Foi feita a anamnese, profilaxia, anestesia com cloridrato de lidocaína 2%
(Dentsply Probem, Catanduva, Brasil), isolamento
absoluto do campo operatório (Madeitex, São Paulo,
Brasil) e remoção da dentina infectada (úmida, altamente amolecida e sem resistência a remoção) com
curetas (Duflex SS White, Rio de Janeiro, Brasil) de
tamanho compatível com a cavidade. A remoção da
lesão de cárie foi interrompida quando a dentina afetada (seca, com resistência a remoção e aspecto de
lascas) foi exposta. Foi realizada a primeira coleta de
aproximadamente a metade da dentina afetada com
uma cureta (Duflex SS White, Rio de Janeiro, Brasil).
As amostras coletadas foram inseridas em Formol a
10%.
Grupo controle: Foi feita a limpeza da cavidade com
Clorexidina 2% (AO Pharmacêutico, Campinas, São
Paulo, Brasil), selamento da lesão da dentina afetada
remanescente com Guta-Percha (Tanariman industrial LTDA, Amazonas, Brasil) e restauração provisória com cimento de Ionômero de Vidro modificado
por resina (Vitremer 3M, St Paul, USA).
Grupo experimental: Na dentina afetada remanescente foi realizada a aplicação do laser de baixa potência Flash Lase III (DMC, São Carlos, Brasil) na
2
dentina afetada remanescente com 2J/cm no infravermelho, aplicação do fotossensibilizante Azul de
toluidina 0.005% (Fórmula & Ação, São Paulo, Brasil)
por 3 minutos e irradiação de 4J/cm² no vermelho
(laser de baixa potência Flash Lase III). Foi realizada
limpeza da cavidade com Clorexidina 2% (AO Pharmacêutico, Campinas, São Paulo, Brasil), selamento
da dentina afetada remanescente com Guta-Percha
(Tanariman industrial LTDA, Amazonas, Brasil) e restauração provisória com cimento de Ionômero de
Vidro modificado por resina. A seguir, foi aplicado o
laser de baixa potência Flash Lase III no centro da
face vestibular e lingual com 3J/cm² no infravermelho
(PDT).
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Evolução Clínica - Após o período de 90 dias, foi realizada a 2ª coleta da seguinte maneira: os pacientes
foram submetidos à profilaxia com escova de Robson (Microdont) em baixa rotação, anestesia com
cloridrato de lidocaína 2% (Dentsply Probem, Catanduva, Brasil) e isolamento absoluto do campo operatório (Madeitex, São Paulo, Brasil). A segunda coleta
da metade remanescente da dentina afetada foi feita
com cureta (Duflex SS White, Rio de Janeiro, Brasil).
As amostras coletadas foram inseridas em Formol a
10% e as cavidades restauradas definitivamente com
resina composta (Z100, 3M, St Paul, USA) (Figura 1).
4.0. Foi utilizado o teste de ANOVA pareado para
amostras relacionadas com o objetivo de comparar
as áreas de colágeno saudáveis antes e após o selamento da dentina cariada. Foi realizado o cálculo
da porcentagem de redução microbiana de cada amostra com o objetivo de observar o aumento das
áreas de colágeno saudáveis após o selamento em
ambos os grupos.
O teste de ANOVA pareado também foi utilizado para
comparar o número e os diâmetros das áreas dos
túbulos antes e depois do selamento da dentina cariada.
Figura 1. Lesão de cárie; fotossensibilizante; laserterapia; guta-percha; civ.
3. RESULTADOS
A aplicação do protocolo de laserterapia acarretou
em aumento significativo de 77.16% das áreas de
colágeno organizado na dentina afetada (p<0.001). O
selamento cavitário promoveu o reparo de 64.93% do
colágeno dentinário, não apresentando aumento estatisticamente significativamente (p>0.05) (Tabela 1).
a
Tabela 1. Médias aritméticas, desvios padrão, porcentagem de aumento das áreas de colágeno saudáveis e
teste de ANOVA pareado.
Controle Experimental
Antes
Preparo das amostras – Todas as amostras receberam processamento histológico, passando pelos processos de descalcificação, desidratação e diafanização.
Obtenção e análise das imagens - Foram obtidas
imagens utilizando uma máquina fotográfica acoplada a microscópico óptico com aumento de 160 vezes
para HE e 40 de SR.
25.42
15.39
a
(6.46)
72.50
a
(10.77)
67.41
(9.62)
Porcentagem de
aumento das áreas
de colágeno saudáveis
64.93%
77.16%
Valor de p
p=0.0573
p=0.0008
Médias
Aritméticas Depois
e Desvios
Padrão
(22.82)
a
b
Todas as análises das imagens foram realizadas por
2 examinadores calibrados cegos utilizando o programa Tpsdig, version 1.38 (Rohlf FJ, Department of
Ecology and Evolution, State University of New York,
Stony Brook, NY). Para avaliar a calibração entre os
examinadores, foi utilizado o teste de Correlação Intraclasse. Obtida a calibração entre os examinadores, foi calculada a média entre seus resultados que
foi submetida à análise estatística para avaliar o
comportamento da dentina cariada após o selamento
em ambos os grupos.
Letras diferentes: diferenças estatisticamente significantes (p<0.05)
Os resultados obtidos das áreas de colágeno coradas em Sirius Red antes e após o selamento da dentina afetada foram analisados no Programa BioEstat
Tabela 2. Médias aritméticas, desvios padrão e teste
de ANOVA pareado do número de túbulos antes e após o selamento da dentina cariada.
Foi possível observar aumento significante do número de túbulos dentinários quando foi aplicado o protocolo de laserterapia (p=0.0429). Não houve variação
dos diâmetros das áreas dos túbulos dentinários após 90 dias de selamento da dentina cariada (Tabelas 3 e 4).
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Médias Aritméticas
e Desvios Padrão
Valor de
p
antes
depois
Controle
210.96
a
(39.92)
339.11
a
(197.36)
p=0.4895
Experimental
239.58
a
(174.13)
414.03
b
(257.56)
p=0.0429
Letras diferentes: diferenças estatisticamente significantes (p<0.05)
Tabela 3. Médias aritméticas, desvios padrão e teste
de ANOVA pareado dos diâmetros das áreas dos túbulos antes e após o selamento da dentina cariada.
Médias Aritméticas
e Desvios Padrão
Valor de
p
antes
depois
Controle
249.93
a
(137.06)
471.91
a
(21.42)
p=0.1454
Experimental
330.89
a
(78.03)
626.18
a
(421.11)
p=0.1991
Letras iguais: ausência de diferenças estatisticamente significantes (p<0.05)
4. DISCUSSÃO
Pinheiro et al. (2008) [3] avaliaram um modelo morfométrico para estudar o colágeno e os túbulos dentinários da lesão de cárie e áreas passíveis de reorganização. Esse modelo proposto por Pinheiro et al.
(2008) [3] é o mesmo utilizado nesse trabalho para
estudar o comportamento do colágeno e dos túbulos
dentinários após a aplicação de um protocolo de laserterapia. Foi possível observar áreas de colágeno
passíveis de reorganização em ambos os grupos.
Esses resultados concordam com Pinheiro et al.
(2008) [3] que também observaram áreas reorganizáveis na dentina afetada.
Lee et al. (2006) [15] compararam a morfologia e a
distribuição protéica da dentina de dentes hígidos e
com lesão de cárie em esmalte e dentina. A quantidade de colágeno tipo I em pré-dentina foi muito reduzida nos dentes com lesão de cárie dentinária com
aumento progressivo do colágeno tipo I nos odontoblastos e na polpa dentária. Na zona periférica cariada, os túbulos dentinários na lesão de cárie apresentaram forma irregular, assim como a morfologia dos
odontoblastos também foi alterada, uma vez que estas células que são normalmente alongadas apareceram cubóides. Esses resultados concordam com as
imagens do presente trabalho que mostram áreas de
colágeno passíveis de reorganização na dentina afetada e alteração morfológica dos túbulos dentinários.
Para estimular o reparo da lesão de cárie dentinária,
esse trabalho utilizou a aplicação de um protocolo de
laserterapia. Essa terapêutica incluiu a aplicação do
laser de baixa potência Flash Lase III na dentina afe2
tada com 2 J/cm no infravermelho, terapia fotodinâmica e nova aplicação no centro da face vestibular e
lingual com 3J/cm2 no infravermelho. A terapia fotodinâmica nesse trabalho foi realizada com o fotossensibilizante de azul de toluidina 0.005% e laserte2
rapia com 4J/cm no vermelho. A literatura contemporânea ressalta o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica pela reação entre o fotossensibilizante e a
luz produzindo radicais reativos capazes de induzir a
morte celular, por exemplo, o oxigênio singleto. O
uso da terapia fotodinâmica tem como vantagem a
não seleção de cepas resistentes, como acontece
com os antibióticos. Os resultados desse trabalho
demonstraram aumento significativo de 77.16% das
áreas de colágeno organizado na dentina afetada
(p<0.001) com a utilização desse protocolo de laserterapia.
Giusti et al. (2008) [16] avaliaram a capacidade antimicrobiana da terapia fotodinâmica na dentina utilizando luz de emissora de diodo (LED). O uso da energia LED em associação com o fotossensibilizante
Fotogem ou azul de toluidina foi eficaz para a redução bacteriana. O maior efeito sobre Streptococcus
mutans e Lactobacillus acidophilus foi obtido com o
azul de toluidina (TBO) em 0.1 mg/mL a uma dose de
2
48 J/cm . Esses resultados justificam o estudo da
terapia fotodinâmica no tecido cariado, porém, nesse
trabalho, a concentração do azul de toluidina é
0.005%, bastante inferior a de Giusti et al. (2008)
[16]. A diminuição da concentração do corante é importante para reduzir a possibilidade de manchamento do dente, fato esse indesejável em procedimentos
clínicos. Outra diferença do nosso trabalho para o de
Giusti et al. (2008) [16] é que a luz que está sendo
utilizada na terapia fotodinâmica é laser e não um
LED. Esse fator também é importante clinicamente,
pela diminuição da dose necessária de aplicação,
2
2
laser 4J/cm e LED 48 J/cm . A redução da dose
permite a diminuição do tempo de aplicação do laser
na clínica, fato esse importante para a otimização do
tempo operatório.
Neste trabalho, foi possível observar aumento significante do número de túbulos dentinários quando foi
aplicado o protocolo de laserterapia. Isto pode estar
relacionado à grande reorganização da dentina cariada 77.16% que contribuiu para a limpeza e homogeneização da superfície dentinária, facilitando a i-
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dentificação e quantificação dos túbulos dentinários
após 90 dias. Não houve variação dos diâmetros das
áreas dos túbulos dentinários após 90 dias de selamento da dentina cariada, o que corrobora com os
relatos da literatura que afirmam que no processo de
reparo dentinário, primeiro tem-se a reorganização
da parte orgânica e depois a deposição mineral. Portanto, 90 dias não foi tempo suficiente para deposição dentinária no interior dos túbulos, porém esse
período de selamento apresentou melhoras significativas na reorganização do colágeno.
De acordo com Godoy et al. (2007) [17], o tecido cariado é passível de reorganização, através da dentinogênese, que é um processo contínuo e dinâmico,
regulado por uma única camada de células odontoblásticas altamente diferenciadas, a qual é responsável por secretar a matriz dentinária. O objetivo do
tratamento regenerativo da polpa é reconstituir o tecido normal na interface dentina-polpa, através da
produção de dentina terciária. A dentina terciária é
sintetizada como uma resposta a vários estímulos
externos e pode ser dividida em duas subcategorias:
a dentina reacionária e a dentina reparadora. Godoy
et al. (2007) [17] observaram em seu estudo que a
aplicação do laser de baixa potência é capaz de acelerar o processo de reparo e reorganização colágena,
uma vez que as amostras irradiadas apresentaram
maior organização das fibras de colágeno na matriz
extracelular e melhor cicatrização do que as amostras não irradiadas, fato também observado no presente estudo.
Os preparos cavitários preconizados por Black baseavam-se nos princípios de extensão para prevenção
o que acaba resultando em perda de estrutura dentinária hígida. A remoção total do tecido cariado, no
entanto, pode causar exposição pulpar em dentes
com lesões de cárie profundas e devido a isso atualmente são utilizadas novas técnicas, preconizando
a remoção superficial do tecido cariado com a utilização de instrumentos manuais e posterior selamento
da lesão de cárie remanescente. O presente trabalho
realizou, portanto, a remoção parcial do tecido cariado a fim de preservar o remanescente dental e, assim como o estudo de Lula et. al. (2009) [18], evitar
ou pelo menos minimizar as possíveis complicações
da remoção completa da dentina cariada próxima à
polpa. De acordo com Lula et. al. (2009) [18], a remoção parcial baseia-se na remoção apenas do tecido infectado e mantém a dentina afetada que é fisiologicamente remineralizável e promove condições
favoráveis para o processo de reorganização da dentina. Esta afirmação concorda com os resultados obtidos neste estudo, já que a realização do selamento
cavitário sem a utilização da laserterapia acarretou
em um reparo de 64.93% do colágeno dentinário.
Comparando-se este resultado com o grupo que recebeu a aplicação do protocolo de leserterapia, houve aumento significativo de 77.16% das áreas de
colágeno organizado na dentina afetada.
O corante azul de toluidina utilizado nesse trabalho,
segundo Pinheiro et al. (2008) [3], Bonsor et al.
(2006) [19] e Giusti et al. (2008) [16], é uma fenotiazina que absorve, por meio de cloro, o laser com
comprimento de onda de 660 nm. A redução microbiana da terapia fotodinâmica é o resultado de oxiredução do oxigênio singleto e radicais livres no citoplasma da membrana bacteriana, provocando a saída de seu conteúdo e morte microbiana. Bonsor et al.
(2006) [19] afirmaram ainda que essa terapia seja
capaz de eliminar também vírus e fungos. A terapia
fotodinâmica realizada nesse estudo foi com a apli2
cação do laser com 4 J/cm associado ao corante de
azul de toluidina 0.005%, que foi ativado ao entrar em
contato com a luz vermelha do laser e produziu um
efeito letal nas bactérias viáveis após a remoção parcial do tecido cariado. O fotossensibilizante azul de
toluidina 0.005% foi mantido no interior da cavidade
por 3 minutos.
Na pesquisa de Bonsor et al. (2006) [19] também foi
aplicado o azul de toluidina no tecido infectado, porém durante 30 segundos. Foi associado à aplicação
do laser diodo de baixa intensidade output com 100
mW e 633 ±.2 nm de comprimento de onda durante
um minuto. Bonsor et al. (2006) [19] observaram a
eliminação de 97% das bactérias. Willians et al.
(2004) [20] avaliaram a capacidade antimicrobiana do
azul de toluidina na matriz de colágeno e na lesão de
cárie dentinária. No estudo de Willians et al. (2004)
[20], foi utilizado um sistema de laser com 0,8 mm de
diâmetro de luz e ponta isotrópica de 633 ± 2 nm. Na
dentina cariada, foram realizados dois contatos de 30
e 60 s e uma dose de energia de 4,8 J, muito parecida com o presente trabalho que utilizou uma dose de
2
4J/cm . O resultado desse estudo em lesões de cárie
dentinária, na qual técnica da PDT foi associada com
azul de toluidina em uma concentração de 10 mg /
ml, foi à eliminação de 99% das bactérias do substrato sem variação significativa nos resultados com 30 e
60 segundos de exposição. O presente estudo obteve resultados positivos utilizando, no entanto, uma
concentração relativamente menor que a usada por
Willians et al. (2004) [20].
Os resultados desse trabalho permitem para o reparo
dentinário a utilização do protocolo de laserterapia.
Dessa forma, é possível minimizar o desgaste do
tecido dentário tratando a lesão de cárie remanescente na cavidade com laserterapia.
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5. CONCLUSÃO
O protocolo de laserterapia utilizado nesse trabalho
está indicado para estimular o reparo do colágeno
reversivelmente alterado na dentina afetada.
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[13]
AGRADECIMENTOS
Ao CNPQ pela bolsa de iniciação científica. A PUCCampinas pela oportunidade de realização desse
trabalho. Aos funcionários da Clínica Odontológica,
Fisiologia e Histologia pelo auxílio na execução dessa pesquisa. Aos professores Pedro Paulo Barros,
Gustavo Henrique da Silva.
Zampieri, M. J. P., et.al. (2003), Photodinamic terapy in bacterias st mitis st sanguis “in vitro”,
Rev Bras Implant, p. 16-17.
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