TECNOLOGIA/PESQUISA
Influência de Microrganismos Contaminantes
sobre o Processo Fermentativo
* M. A. Camolez e *M. J. R. Mutton
RESUMO
Esta pesquisa foi desenvolvida durante a
safra 2001/2002, com o objetivo de avaliar os
microrganismos contaminantes e seus reflexos sobre o processo fermentativo em destilaria de álcool. Realizaram-se análises físico-químicas (pH, acidez total, glicerol, teor
alcoólico e de fermento) e quantificação dos
microrganismos da água de diluição, mosto,
pé-de-cuba e vinho. Os resultados evidenciaram que a contaminação por leveduras e
bactérias ocorreu através do mosto e da
água de diluição nos três meios de cultura
empregados. Os contaminantes presentes
no mosto e na água de diluição foram responsáveis pelas elevadas concentrações de
ácidos orgânicos e glicerol, principalmente
no primeiro período de safra, afetando diretamente a eficiência fermentativa que apresentou para o primeiro período uma queda de
2,36% (v/v) e 1,24% (v/v) em relação ao
segundo e terceiro período avaliados, respectivamente, devido ao desvio de açúcares
para a formação destes metabólitos.
Palavras Chave: fermentação alcoólica, leveduras, matéria-prima e subprodutos.
SUMMARY
This reseach was conducted during the season
2001/2002 to evaluate the effect of contaminants
on alcohol production and their impacts on the
fermentation process in a distillery. We
performed physical-chemical analyses (pH,
acidity, glycerol, alcohol and yeast content)
and quantified dilution water, must, inoculum
(pé-de-cuba) and wine microorganisms. Our
results show that yeast and bacterial
contamination came from the must and dilution
water In all of the three culture media. The
contamination from both the must and dilution
water were responsible for the high levels of
organic acids and glycerol, especially on the
first harvest time, directly affecting the
fermentation efficiency, which decreased 2.36
*
6
FCAV/UNESP- CampusdeJaboticabal
- Jaboticabal - SP.
and 1.24% (v/v) in relation to the second and
third times, respectively. This decrease is due
to the use of sugars to produce glycerol and
organic acids.
INTRODUÇÃO
Os processos fermentativos instalados em
destilarias e usinas brasileiras apresentam
dificuldade em manter a assepsia do
substrato a ser fermentado, favorecendo o
desenvolvimento de microrganismos
contaminantes, bactérias e como leveduras
selvagens. Este fato tem despertado a atenção dos técnicos e pesquisadores para uma
melhor avaliação da qualidade da matéria
prima e das condições operacionais,
objetivando a adequação de medidas para
minimizar os problemas e conseqüentemente o custo de produção do álcool.
Para Oliva-Neto; Yokoya (1997) os maiores
prejuízos causados pela contaminação
bacteriana são a degradação da sacarose e a
formação de ácidos orgânicos que ocasionam perda de açúcar e intoxicação das leveduras. O gênero Lactobacillus é a maior
preocupação das unidades produtoras de
álcool (Narendranath et al. 1997).
Muitas espécies que apresentam cápsula
polissacarídica e secretam gomas
extracelulares que protegem as células dos
efeitos letais do calor e conferem a capacidade de crescerem em temperatura relativamente alta (Gallo; Canhos, 1991). Bevan;
Bond 1971 identificaram Bacillus
megaterium em amostras de caldo após o
clarificador, que apresenta temperaturas próximas a 100 °C.
Cabrini; Gallo (1999) definiram levedura
contaminante como qualquer levedura presente no processo fermentativo que não seja
aquela selecionada para a condução da
produção de álcool, que atuam prejudicando o processo fermentativo, causando problemas operacionais e aumentando o tempo
de fermentação. Contudo, algumas contaminantes podem apresentar bom desempenho
fermentativo, podendo ser selecionadas para
atuarem como as leveduras do processo
numa safra posterior.
Para realização desta pesquisa tomou-se
como base o histórico das fermentações das
últimas cinco safras, onde se observou uma
variação no perfil fermentativo, trazendo
problemas de ordem operacional, além de
prejuízos financeiros. As características
microbiológicas do mosto e da água-dediluição de fermento foram correlacionadas
com as características físico-químicas do
processo fermentativo.
MATERIAL E MÉTODOS
Para o início da fermentação foi utilizada
levedura comercial de panificação (fermento
biológico) do gênero Saccharomyces
cerevisiae (Mauri Brasil-Pederneiras, São
Paulo, Brasil).
Utilizou-se as seguintes definições: mosto
(líquido apto a ser fermentado), vinho
levedurado (mosto depois de concluída a
fermentação alcoólica, composto por leveduras vivas e mortas, álcoois e componentes
secundários), pé-de-cuba (suspensão de
células de leveduras obtidas após a
centrifugação do vinho) e água de diluição
(água utilizada para diluir a suspensão de
células de leveduras obtida por
centrifugação).
As amostras foram coletadas em três períodos definidos como início, meio e final da
safra 2001/2002. Cada período corresponde
a quatro coletas, com intervalo entre elas de
aproximadamente sete dias e foram denominados da seguinte forma para facilitar a discussão dos resultados: primeiro (22/06/01,
29/06/01, 06/07/01 e 15/07/01), segundo (10/
08/01, 17/08/01, 27/08/01 e 04/09/01) e terceiro (02/10/01, 10/10/01, 16/10/01 e 24/10/01).
Utilizaram-se para estas avaliações amostras de água de diluição do fermento, mosto,
pé-de-cuba e vinho levedurado do processo
fermentativo da Pitangueiras Açúcar e Álcool
Ltda
O isolamento dos microrganismos foi realizado através de plaqueamento imediato e em
série das amostras, em duplicatas, nas diluições de 10-1 a 10-3 para água de diluição; 10-2,
10-4 e 10-6 para mosto e 10-6 a 10-8 para pé-decuba e vinho levedurado.
STAB - maio-junho - 2005 - Vol. 23 nº 5
TECNOLOGIA/PESQUISA
Para o crescimento de microrganismos totais
utilizou-se o meio PCA (Plate Count Ágar Difco-Becton Dickinson and Company,
Sparks, USA). Para a quantificação de bactérias láticas empregou-se o meio MRS (Man,
Rogosa e Sharpe) recomendado por Man et
al. (1960). A incubação das placas foi realizada em estufa microbiológica com temperatura de 32°C por um período de 48 a 72 horas.
A quantificação de leveduras foi realizada
através do meio WLN (Wallerstein
Laboratories Nutrient Agar) proposto por
Green; Gray (1950) e modificado por Oliveira;
Pagnocca (1988). A incubação das placas foi
realizada a temperatura de 30°C por um período de 72 a 96 horas.
O pH foi determinado em potenciômetro
digital, nas amostras de vinho bruto sem
diluição. O teor de glicerol foi determinado
conforme metodologia proposta por
MacGowan et al. (1983), a acidez total conforme Villela et al. (1973).
Para a determinação de ARRT (açúcares
redutores residuais totais) e ART (açúcares
redutores totais) em g/100 g de vinho utilizou-se metodologia de Lane & Eynon (1934).
O teor de fermento foi obtido através de
centrifugação do vinho bruto a 700 g por 5
minutos. O teor alcoólico foi determinado
por cromatografia gasosa (Monick, 1986).
Para o índice de viabilidade e brotamento de
leveduras utilizou-se o método proposto por
Lee et al. (1981).
A análise estatística foi realizada empregando-se a correlação de Pearson pelo software
S.A.S. (Statistical Analysis System).
Tabela 1
Coletas
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Contagem microbiológica nas amostras de doze coletas expressas em
UFC/mL de amostra (Safra 01/02)
Amostras
Microrganismos
Totais
Bactérias
Leveduras
Totais
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
Água de diluição
Mosto
5.3x104
8.0x106
3.0x104
1.0x104
2.0x105
1.0x106
3.9x104
3.1x107
4.0x104
3.0x105
2.3x103
2.0x104
3.9x103
7.0x105
1.3x104
4.5x106
1.1x105
3.0x106
6.0x103
4.0x106
6.6x103
1.1x106
1.9x104
4.0x104
2.0x102
1.4x105
1.2x102
1.3x104
2.0x102
1.8x106
2.1x102
3.4x107
7.0x101
2.0x105
7.0x101
3.9x104
8.3x101
9.0x105
3.0x101
4.8x106
1.9x104
1.2x106
1.1x102
5.7x106
1.2x102
3.0x106
1.3x103
6.4x104
<10x102
2.2x103
1.0x101
5.0x102
3.0x102
1.5x103
1.2x102
2.0x103
<1x101
1.0x102
<1x101
<1x102
<1x101
1.0x102
<1x101
3.0x101
1.8x102
1.4x102
<1x102
3.4x103
<1x101
5.7x103
<1x101
4.3x103
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A presença de contaminantes na fermentação resulta em sérios prejuízos para as leveduras refletindo-se de modo direto sobre a
produtividade e o rendimento do processo
fermentativo. Analisando-se a Tabela 1
pode-se concluir que a maior carga
microbiana presente foi bacteriana, fato que
traz grande preocupação para o sistema de
controle, de acordo com Stroppa et al. (1998),
que consideram os produtos do metabolismo dessas bactérias prejudiciais para o processo.
As contaminações observadas neste estudo podem ter sido resultantes da
descontinuidade do processo motivado
por paradas do processo de moagem,
que ocorreram no início da safra, acarretando desequilíbrios no processamento
da matéria-prima, provocando sua deterioração. Resultados semelhantes foram
obtidos por Yusof et al. (2000) que obtiveram diferenças significativas de pH e
acidez comprovando a deterioração do
substrato em testes realizados com variaSTAB - maio-junho - 2005 - Vol. 23 nº 5
Figura 1 - Avaliação microbiológica das amostras de vinho e análise de teor alcoólico e
de fermento obtidas em doze coletas (Safra 01/02).
ção do tempo e da temperatura de
armazenamento.
Observando-se a Tabela 1 é possível inferir
que o maior número de contaminantes introduzidos no processo fermentativo foi
carreado pelo mosto, submetido ao tratamento térmico (Yokoya, 1991; Gallo; Canhos,
1991). Embora este seja um procedimento de
rotina que objetiva reduzir a carga microbiana,
problemas tais como falhas operacionais no
tratamento térmico, recontaminação do mosto
através dos trocadores de calor ou adição de
melaço comprometido microbiologicamente,
podem ter contribuído para essa ocorrência.
É importante ressaltar que a água de diluição
de fermento também pode ser uma fonte de
contaminação, conforme resultados observados para os três meios de cultura (Tabela
1) que estão de acordo com resultados obtidos por Amorim et al. (2002). Deve-se des7
TECNOLOGIA/PESQUISA
Considerando-se os resultados discutidos
anteriormente e o comportamento apresentado pelo teor alcoólico e de fermento no
vinho, glicerol e eficiência fermentativa verificou-se que a contaminação microbiana e
a formação de metabólitos observadas no
primeiro período de safra foram diretamente
responsáveis pela queda no rendimento
fermentativo (Figura 3) de 2,36% (v/v) e
1,24% (v/v) em relação ao segundo e terceiro
período avaliados, respectivamente.
Deve-se considerar ainda que, a avaliação e
conhecimento da qualidade da água utilizada na unidade industrial é extremamente
importante, uma vez que, ela interfere diretamente sobre a carga microbiana obtida no
ambiente das dornas, aumentando a acidez
e reduzindo o teor alcoólico do vinho.
Figura 2 - Determinação de metabólitos nas amostras de vinho obtidas em doze coletas
(Safra 01/02) .
CONCLUSÕES
- mosto e a água de diluição de fermento
apresentaram cargas microbianas elevadas, principalmente de bactérias láticas.
- as altas concentrações de ácidos totais e
glicerol observadas no primeiro período
de safra foram ocasionadas pelos níveis
elevados de contaminantes presentes no
mosto e na água de diluição do fermento,
prejudicando o rendimento fermentativo.
AGRADECIMENTOS
À Pitangueiras Açúcar e Álcool Ltda pela
colaboração e oportunidade de realização
deste trabalho.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Figura 3 - Avaliação da eficiência fermentativa obtida nos três períodos de safra,
representada por doze coletas (Safra 01/02).
tacar que quando se compara a contaminação da água-de-diluição com o mosto, este
apresenta níveis mais elevados, fato que
merece especial atenção do ponto de vista
do controle, uma vez que, neste está concentrado todo açúcar disponível para a transformação em álcool.
Na Figura 1 pode-se observar queda no teor
alcoólico e de fermento e aumento no número de bactérias/mL no terceiro período de
safra. O teor alcoólico e a número de bactérias láticas no vinho correlacionaram-se negativamente (r= -0,6646, p<0,018). Relatos de
Narendranath et al. (1997) e Thomas et al.
(2001) evidenciaram queda na produção de
álcool em ambientes com altas taxas de contaminação bacteriana.
Como resultado das contaminações e/ou
desvios no metabolismo das leveduras observou-se maior formação de glicerol e de
8
ácidos totais, principalmente no primeiro
período de safra. Da análise da Figura 2
pode-se verificar que as concentrações médias foram de 383,15 mg de glicerol/L de
vinho e 1,61 g de ácidos totais/L de vinho.
Comportamento semelhante foi obtido por
Cherubin (2003) avaliando os efeitos da contaminação bacteriana na fermentação alcoólica.
Avaliando a produção de glicerol em 19
linhagens de S. cereviseae na produção de
vinho, Remize et al. (2000) obtiveram concentrações na faixa de 6400 a 8900 mg de
glicerol/L de vinho. Esta variação foi atribuída às linhagens testadas e não aos fatores
ambientais. Comportamento semelhante
pode ser observado neste estudo, embora
não se tenha realizado a identificação das
leveduras, foi constatada a presença de leveduras contaminantes (Tabela 1).
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