Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Laboratório de Biologia Celular e Molecular
Estudo da caspase-3 e da dismútase do
superóxido no córtex supra-renal após
administração crónica de ACTH
Aplicação de bombas osmóticas intra-peritoneais:
efeito de 3 dosagens de ACTH na secreção de
corticosterona
Fátima Leal Seabra
(Orientador: Prof. Doutor Henrique Almeida)
Objectivos do estudo

Objectivos gerais:




Aplicação de técnicas laboratoriais leccionadas
durante as aulas de Biologia Celular e Molecular
Dar a conhecer a vivência laboratorial
Estimular a curiosidade no domínio da investigação
Objectivo específico:

Pesquisa da expressão de MnSOD e do factor
apoptótico caspase-3, por imunocitoquímica, em
animais tratados com ACTH
Razões

Pesquisa de MnSOD:


Verificou-se que a administração aguda de
ACTH aumenta a sua expressão, mas
desconhece-se o efeito da administração
crónica
Colateralmente,

Tendo-se observado que a supressão de ACTH
aumenta a expressão de caspase-3, indagouse se a sua administração crónica a diminui.
Introdução-Índice

A Glândula supra-renal

Radicais livres e dismútase do superóxido

A caspase-3
A glândula supra-renal (GSR)
www.emc.maricopa.edu
cai.md.chula.ac.th
Ultra-estrutura das células do Córtex de GSR
A hormona adrenocorticotrófica

A hormona
adrenocorticotrófica
(ACTH) é o maior
estimulante da
secreção das
hormonas
adrenocorticais,
nomeadamente dos
glicocorticóides
(corticosterona e
cortisol)
www.aafp.org/
Fontes e consequências dos
radicais livres
Fontes endógenas:
Fontes exógenas:
•Cadeia respiratória
•Fumo do tabaco
•Reacções enzímicas
•Reacções de autooxidação
Produção de
radicais livres
•Poluentes
•Luz UV
•Radiações ionizantes
O2 ; H2O2
•Xenobióticos
Metais de transição
Cu  ; Fe2
OH
Peroxidação lipídica
Modificações nas
bases de DNA
Lesão dos tecidos
Alterações proteicas
Antioxidantes in health disease,
IS Young et al, J Clin Pathol 2001,
54:176-186 (adaptação)
Defesas dos antioxidantes
Enzimas antioxidantes:
•dismútase do superóxido
Produção de
radicais livres
•transferrina
O2 ; H2O2
•catálase
Proteínas que se
ligam aos metais:
•ferritina
•peroxídase da glutationa
Metais de transição

•lactoferrina
2
Cu ; Fe
Outras substâncias:
•fases lipídicas:
•fases aquosas
 tocoferóis
•ascorbato
ubiquitinol
•urato
carotenóides
•glutationa
OH
flavonóides
Lesão dos tecidos
Mecanismos de reparação
Antioxidantes in health disease,
IS Young et al, J Clin Pathol 2001,
54:176-186 (adaptação)
A dismútase do superóxido, SOD

Há 3 isoformas:

Intracelulares
 SOD cobre-zinco (CuZnSOD)
 Massa molecular de 32 kDa
 Homodímero
 Encontrada em organelos e no citoplasma
 SOD manganésio (MnSOD)
 Massa molecular de 40 kDa
 Homotetrâmero
 Presente em mitocôndrias, nomeadamente de GSR
 Distingue-se da CuZnSOD pois não é inibida com cianeto
catálase ou
peroxídase da glutationa
O2 MnSOD
 H 2O2  H 2O
A dismútase do superóxido, SOD
Extracelular
 SOD extracelular (EC-SOD)
Massa molecular de 135kDa
 Tetrâmero
 Contém um átomo de Zn e Cu em cada subunidade
 Sintetizada em alguns tipos de células:

- células endoteliais
- fibroblastos
A caspase-3

Membro de uma família de proteases, com
resíduos de cisteína (C) no seu local catalítico e
que clivam proteínas-substrato no extremo
carboxílico de resíduos de ácido aspártico (Asp).

“executora”
apoptose
da
morte
celular
programada
www.rcsb.org/pdb/newsletter/2004q3/caspases.gif
-
A caspase-3
Lesões nas mitocôndrias
Libertação do citocromo c e
de moléculas pró-apoptóticas
(Smac/Diablo)
Citocromo c induz a
formação do apoptossoma
(Apaf-1 e Caspase-9)
Activação de uma via de
caspases pela caspase-9
Activação da caspase-3
The Cell A Molecular Approach,Third Edition, Geoffrey M Cooper et al
Nota: Smac/ Diablo promovem a
apoptose interferindo com a
acção
dos
IAPs
que
são
inibidores das caspases
A caspase-3
Célula Normal
Célula apoptótica
medidacte.timone.univ-mrs.fr/.../ apoptose.html
Molecular Cell Biology,
Fourth edition, Lodish et al
Métodos - Índice

Introdução de bombas osmóticas

Colheita e processamento de glândulas
supra-renais:


Microscopia de luz (imunocitoquímica)
Microscopia electrónica
Introdução de Bombas Osmóticas

Ratos machos Wistar



3 meses de idade
Peso ~262g
Bombas osmóticas Alzet®, com


Soro fisiológico (SF)
ACTH com concentração de 1mg/1mL
Introdução de Bombas Osmóticas

Anestesia com Sevorane® a
5% em mistura oxigénio:ar
de 1:2

Laparotomia mediana inferior

Introdução das bombas na
cavidade peritoneal

Sutura da parede abdominal
Aplicação de Bombas Osmóticas intraperitoniais: Estudo do
efeito de endotoxina na microestrutura da glândula supra-renal
do rato, Michel Sapateiro Luís, 2003
Recolha das supra-renais e preparação
para microscopia

Ao fim de 7 dias sacrificaram-se os animais por
decapitação

Microscopia óptica




Fixaram-se porções de glândula supra-renal em formol
Incluíram-se em parafina
Fizeram-se cortes com micrótomo e colocaram-se estes em
lâminas com poli-L-lisina
Microscopia electrónica



Fixaram-se porções de glândula supra-renal com
glutaraldeído a 2,5% em tampão cacodilato
Inclusão em EPON
Fizeram-se cortes ultrafinos que se colocaram em grelhas e
se coraram para observar no microscópio electrónico
Imunocitoquímica da MnSOD
1.
Desparafinação dos cortes
2.
Hidratação
3.
Bloqueio da peroxídase endógena com H2O2 a 3%
4.
Bloqueio com BSA 2% em TBS
5.
Incubação com Anti-MnSOD (anticorpo I de coelho) durante 24h
6.
Incubação com anticorpo II, anti-coelho biotinilado durante 30 min
7.
Adicionou-se o complexo ABC (Streptavidina Peroxídase)
8.
Revelação com DAB
9.
Contraste com Hematoxilina + Eosina
10.
Mantagem com Entellan
11.
Observação a microscopia de luz
Imunocitoquímica da Caspase-3
1.
Desparafinação
2.
Hidratação
3.
Colocar os cortes em tampão de citrato até entrar em ebulição
4.
Baixar a temperatura
5.
Inibição da peroxídase endógena por adição H2O2 a 3%
6.
Bloqueou-se com BSA 5% em TBS-T
7.
Adicionou-se anticorpo I de coelho durante 24h
8.
Incubação 30 min com anticorpo II, anti-coelho, biotinilado
9.
Incubação com complexo ABC
10.
Revelação com DAB
11.
Contraste com hematoxilina e eosina
12.
Montagem com Entellan
13.
Observação a microscopia de luz
Resultados -Índice

Microscopia electrónica

Microscopia óptica



Cortes semi-finos
Imunocitoquímica da SOD
Imunocitoquímica da caspase-3
Microscopia óptica
Cortes semi-finos
ZG da GSR no animal controlo
ZG na GSR no animal tratado com ACTH
Resultados
Microscopia electrónica
mitocôndrias
Inclusões
lipídicas
nucléolo
REL
GSR em que foi administrado soro
fisiológico (SF) no animal
heterocromatina
GSR em que foi administrado ACTH
no animal
Microscopia óptica
Imunocitoquímica da MnSOD
Cápsula
ZG
ZF
córtex
ZR
medula
GSR do animal em que houve
administração de ACTH
Microscopia óptica
Imunocitoquímica da MnSOD
ZF da GSR no controlo (SF)
ZF da GSR no animal tratado com ACTH
Microscopia óptica
Imunocitoquímica da caspase-3
cápsula
ZG
ZF da GSR no animal em o ACTH foi administrado
ZF
Cápsula, ZG e ZF da GSR no
animal controlo (SF)
Conclusões

A introdução de bombas osmóticas é tecnicamente fácil

É necessário aumentar o número de animais para confirmar
os dados observados;

A administração de ACTH não altera a localização da
expressão de MnSOD relativamente ao controlo e em ambos
os casos há uma intensidade de marcação importante;

A marcação da caspase-3 ocorreu em núcleos e citoplasma da
ZF/ZR após administração crónica de ACTH. É possível que tal
resulte de:

Activação de processos apoptóticos, ainda sem expressão morfológica;

Activação de uma via de sinalização não associada a morte celular, em
que a caspase-3 parece estar também envolvida
Bibliografia
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[17] H. Lodish, A. Berk, S. L. Zipursky, P. Matsudaira, D. Baltimore, J. E. Darnell, Molecular Cell Biology, 4th Edition
Agradecimentos

Prof. Doutor Henrique Almeida

Drªs Liliana Matos e Adriana Rodrigues

D. Maria Amélia Ferreira e D. Elisa Galvão
Fim