Coleção de Leishmania do Instituto
Oswaldo Cruz
Leishmania Type Culture Collection (WDCM)
Laboratório de Pesquisas em Leishmaniose
(Departamento de Imunologia/IOC)
Centro de referência (WHO International Leishmania Reference
Strain Center e SVS/MS)
Acervo (representando espécies e variantes genéticos de
Leishmania do Novo Mundo): 2.500 estoques criopreservados
em
diversos
intervalos
de
tempo
desde
1980.
FIOCRUZ
Equipe
Curadores - Elisa Cupolillo (PhD) e Gabriel Grimaldi (PhD)
Luiz Eduardo de Carvalho Paes – Tecnologista, BSc
Ângela Cristina Volpini – Tecnologista, PhD
Lilia Macedo Firoozmand – Tecnologista, BSc
Adriana Gaspar – Apoio Técnico
FIOCRUZ
Serviços prestados:
•Consultorias
•Formação de pessoal
•Depósito (guarda) de amostras
•Fornecimento, gratuito, de cepas de referência de Leishmania
para grupos de pesquisas do Brasil e do exterior
•Tipagem bioquímica e molecular de amostras e isolados
FIOCRUZ
Perfil da coleção de Leishmania do IOC
•Trabalhos em colaboração com vários pesquisadores na América
Latina
•Depósito de cepas de outros laboratórios, onde eram mantidas em
cultura ou criobancos
•Isolados originais enviados diretamente ao nosso laboratório para
identificação e que são depositados.
Nos últimos 5 anos, foram coletados mais de 1.000 isolados, provenientes de
diversas áreas endêmicas no Brasil e outros países da América do Sul.
FIOCRUZ
Catalogação de dados relevantes da coleção
•
Entrada das amostras
Cada estoque depositado no Banco recebe um número de identificação
(IOC/L),
sendo informatizados os dados relevantes sobre o estoque.
Os estoques são reconhecidos pelo seu código
(WHO 1990), que indica (1)
espécie do animal reservatório ou vetor, de onde o parasito foi isolado;
(2) país e (3) ano de isolamento; e (4) designação da cepa original
Ex.: MHOM/BR/1980/LSP
MCHO/CR/1987/356
IFLA/BR/1967/P32
•
1.
2.
Tipagem Bioquímica e Molecular e Classificação Taxonômica
Todas as amostras são classificadas em zimodemas empregando 18 sistemas
loci-enzimáticos – IOC/Z
Perfis de RFLP dos ITSrDNA estão sendo construídos e adicionados ao
banco
FIOCRUZ
Leishmania
-Protozoário unicelular
- Flagelado
- Heteroxeno
- Dimórfico
FIGURA 1. Amastigotas
FIGURA 2. Promastigotas
CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA DE Leishmania NO NOVO
MUNDO
Família
Trypanosomatidae
Gênero
Leishmania
Subgênero
Viannia
Subgênero
Leishmania
Complexo
L. braziliensis
Espécies
L. (V.) braziliensis
L. (V.) peruviana
Espécie
L. (V.) naiffi
Espécie
L. (V.) lainsoni
Espécie
L. (V.) lindembergi
Complexo
L. guyanensis
Complexo
L. donovani
Complexo
L. mexicana
Espécies
L. (V.) guyanensis
L. (V.) shawi
L. (V.) panamensis
Espécie
L. (L.) chagasi
Espécies
L. (L.) mexicana
L. (L.) amazonensis
L. (L.) venezuelensis
Adaptado WHO 1990 e Cupolillo et al. 1994
COLEÇÃO DE Leishmania DO IOC
Laboratório de Pesquisas
em Leishmaniose/ IOC
Centro de referência em Leishmania (WDCM 731)
-Estoques congelados:
(a) Leishmania na forma promastigota
(b) A maior parte dos estoques está criopreservados com glicerol 8%
- Informatização dos dados e cadastro dos estoques
1)Avaliar a estabilidade molecular (identidade) dos parasitos recuperados nas
culturas empregando técnicas bioquímicas e moleculares;
2) Estabelecer um padrão ideal do número e forma morfológica dos parasitos a
serem novamente criopreservados a fim de garantir amostras viáveis em um
futuro descongelamento;
3) Determinar a viabilidade dos parasitos correlacionando com o tempo e
condições que se mantiveram criopreservadas;
4) Garantir uma re-criopreservação com sucesso para que mais tarde as
amostras ao serem descongeladas se apresentem estáveis e viáveis, isso através
do conhecimento de uma faixa ideal do número de parasitas no momento da
criopreservação;
Métodos empregados nos estudos taxonômicos
Isoenzimas
6PGDH - 6-fosfogluconato desidrogenase
NH -
Nucleosídio Hidrolase
ACON - Aconitato Hidratase
FUM -
Fumarase
GPI -
Glicose-Fosfo-Isomerase
G6PDH - Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase
HK -
Hexoquinase
IDH -
Isocitrato desidrogenase
MDH -
Malato desidrogenase
ME -
Enzima Málica
MPI -
Manose-Fosfato-Isomerase
NH -
Nucleotidase
PEPD -
Peptidase
PGM -
Fosfo-Gluco-Mutase
ACP -
Fosfatase Ácida
Caracterização por MLEE – várias espécies
de Leishmania
PCR ITSrDNA Os primers usados: ITS 1(5’ GCTGTAGGTGAACCTGCAGCAGCTGGATCATT-3’) e
ITS 2 (5’-GCGGGTAGTCCTGCCAAACACTCAGGTCTG-3’)
Organização estrutural
do lócus rRNA.
IR1
IR2
ITS
SSU
5.8S
LSU(1)
NTS
RFLP
PCR - Produto específico de ITS rDNA
Classificação e relação filogenética
Leptomonas
L.
enriettii
L.hertigi
L. colombiensis
100
L.
L.
100
98
100
57
82
L. (V.)
colombiensis
equatoriensis
braziliensis
L. (V.) sp
L. (V.)
guyanensis
L. (V.)
panamensis
L. (V.)
panamensis
L.(S.)
100
L. (Viannia)
gymnodactyli
L. (S.) tarentolae
L. (S.) hoogstraali
100
100
L. (L.)
70
96
0.1
PARALEISHMANIA
94
L. (Sauroleishmania)
L. (L.) amazonensis
mexicana
L. (L.)
donovani
L. (L.)
tropica
L. (L.) major
L. (Leishmania)
FIOCRUZ
viabilidade relacionada ao tempo
100%
20
Cultura (%)
80%
65%
17
29
69%
65%
60%
40%
35%
35%
31%
20%
0%
2a7
8 a 13
Intervalo de tempo em anos
Negativo
Positivo
Amostragem
> 14
Viabilidade celular de
L (L.) chagasi em relação
ao tempo de
criopreservação.
viabilidade relacionada a solução de
congelamento
GLICEROL
DMSO
20%
40%
60%
80%
positivas
negativas
positivas
negativas
Relação entre o
crioprotetor
utilizado para a
preservação de
Leishmania
Procedimentos operacionais usados na manutenção e
controle de qualidade dos espécimes colecionados:
•Normas padronizadas - “World Federation for Culture
Collections” (WFCC), “American Type Culture Collection” (ATCC),
Organização Mundial da Saúde (OMS)
•Manutenção – passagens seriadas
•Preservação – Nitrogênio líquido
•Controle de qualidade: tipagem períodica por métodos
bioquímicos e moleculares
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