PCR
MARCADORES MOLECULARES
Prof. Dr. José Luis da C. Silva
Histórico da PCR
Kornberg (1960) – Isolou e caracterizou a DNA polimerase. O isolamento
desta enzima possibilitou o desenvolvimento da síntese “in vitro” de cadeias
de DNA. Em poucos anos, o sequenciamento e a síntese de
oligonucleotídeos tornaram-se rotina nos laboratórios de pesquisa;
Karl Mullis (1983) – Técnica de PCR – polymerase chain reaction –
possibilita a amplificação “in vitro” de ácidos nucléicos. O advento da PCR
acelerou os estudos de genomas de vários organismos, pois possibilitou a
clonagem e o sequenciamento de DNA.
Karl Mullis (1987) – Patenteou a técnica e vendeu para a empresa
Hoffmann-La Roche em 1991.
Kary Mullis – 1983 (Prêmio Nobel 1993)
Princípios da técnica de PCR



Síntese enzimática “in vitro” de cópias de DNA a
partir da seqüência alvo;
A especificidade é dada pelo uso de primers
(iniciadores) específicos para o gene ou região
do DNA de interesse;
A utilização de dois primers delimitam o alvo e a
repetição dos ciclos da PCR dá origem a bilhões
de cópias do alvo.
Amplificação de seqüências pela
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Uma DNA polimerase resiste a temperatura, a
Taq
polimerase,
da
bactéria
Thermus
aquaticus é usada para catalisar o crescimento
a partir de primers de DNA. Pares de primers
em filamentos opostos são ampliados um em
cada direção ao outro. Após o término da
replicação do segmento entre dois primer (um
ciclo), dois novos dúplices são desnaturados
por
aquecimento
unifilamentares.
para
gerar
moldes
Etapas da PCR
1) Desnaturação – abertura da dupla fita do DNA (94°
C/100° C)
2) Anelamento (hibridização) dos primers em T° C mais
baixa
3) Reação de polimerização (síntese) da fita complementar
pela Taq DNA polimerase
Repetição por 30 a 40 ciclos – animação
Reação de PCR em Termociclador
Eletroforese em gel de agarose visualização
dos amplicons (fragmentos amplificados)
Variações da PCR





RT-PCR
Nested-PCR
PCR Multiplex
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Real time PCR ( PCR em tempo real)
RT – PCR
“Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction”
RT – PCR
RT – PCR
“Cycle threshold”
Limiar da fase
exponencial
Fluoróforos: absorvem e emitem luz em λ específico
Taq-Man (Fluoróforo + Quencher)
Taq-Man
“Molecular Beacon” : primers em estrutura secundária
Diferentes cores
Marcadores moleculares

Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular
oriundo de um gene expresso (como em isoenzimas) ou de um
segmento específico de DNA (expresso ou não).

Marcadores genéticos são unidades herdáveis

Quando o comportamento do marcador segue as leis de herança
de Mendel (quando analisado o seu comportamento em uma
população segregante), ele pode adicionalmente ser definido
como um marcador genético.



A molécula de DNA sofre alterações (mutações). As mutações
são mais toleradas quando acontecem em regiões nãocodificantes, e as mutações tornam-se estáveis, sendo
transmitidas aos seus descentes.
Como é muito grande a variação no número e no tipo de mutações
estáveis do DNA – fenômeno conhecido como polimorfismo
genético – é possível identificar uma pessoa com base no seu
padrão de polimorfismo.
Para reconhecer os locos (sítios) onde ocorrem essas mutações,
há diferentes técnicas.
marcadores
cromossoma
Origem do Polimorfismo Molecular
1. Mutações pontuais - SNPs
A.
ATCTCGTGATTCCTAGTCGTA
TAGAGCACTAAGGGATCAGCAT
B.
ATCTCGTGATTATAGTCGTA
TAGAGCACTAATATCAGCAT
ex. Sítio EcoRI
2. Pequenas deleções e/ou inserções - InDels
A.
ATCTCGTCTAGTCGTA
TAGAGCAGATCAGCAT
B.
ATCTCGT---GTCGTA
TAGAGCA---CAGCAT
Classificação de Marcadores
Moleculares
Marcadores de DNA (moleculares)
Vantagens:
- Não é objeto de influências ambientais;
- Potencialmente ilimitado em número;
Desvantagem:
Maior desvantagem é a necessidade de técnicas
e equipamentos mais complexos.
Marcadores moleculares
• Hibridação
– RFLP – (Restriction Fragment Length Polymorphism)
– Minissatélites – VNTR –(Variable Number of Tandem Repeats)
• Amplificação de DNA (Técnica de PCR)
– RAPD – (Random Amplified Polymorphic DNA)
– SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions)
– Microssatélites –SSR (Simple Sequence Repeats)
– AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
- SNPs (Single Nucleotide Polymorphism)
RFLP - Restriction Fragment Length
Polymorphism




RFLP examina diferença em tamanho de
fragmentos de restrição de DNA
específicos
Polimorfismo deriva de mutação pontual,
inserção, deleção
Utiliza-se DNA celular total
Requer DNA puro de alto peso molecular
• Polimorfismo evidenciado pela fragmentação do DNA com
enzimas de restrição e observado pela hibridização de sondas
marcadas de DNA (Southern blots) com radioatividade ou
compostos que desencadeiam uma reação luminescência.
• Para que o polimorfismo seja detectado, é necessário que as
seqüências de nucleotídeos nas fitas de DNA de dois ou mais
indivíduos comparados sejam distintas.
Metodologia de RFLP
1 . Digerir DNA em fragmentos pequenos
2. Separação dos fragmentos por gel
eletroforese
3. Transferência de fragmentos de DNA para
filtro
Metodologia de RFLP
4. Visualização dos fragmentos de DNA

sondas marcadas (32P) ou a frio
5. Análise dos resultados


bandas analisadas para alelos e/ou
presença/ausência
diferenças em padrão de bandas reflete
diferenças genéticas
A escolha de sonda/enzima de restrição
é crucial
Digestão de DNA Genômico e
Separação em Gel
digestão
2
3
DNA
Separação
em gel
5
4
1
1
2
3
4
5
Eletroforese
Transferência para Membrana de
Nylon ou Nitrocelulose
2
3
1
4
5
MARCAÇÃO DA SONDA
(EX.: MATERIAL RADIOATIVO – [32P] γATP,[32P] αdNTP)
Hibridização com sondas radioativas
em Nylon ou Nitrocelulose
Exposição em filme de Raios-X
Hibridização com sonda marcada
Aplicação dos RFLPs na medicina forense
Interpretação de resultados
1
1
2
3
4
5
6
2
3
4
5
Sítio alvo para sonda
6
Sítio de restrição
Inserção
Marcador RFLP na anemia falciforme
Análise de Diversidade e Filogenia
por RFLP
5
13
6 2
8
A
B
C
Kb
A
B
C
13
8
11
9
6
5
4
2
RAPD - Random Polymorphic DNA
Amplificação Randômica de DNA Polimórfico

Utiliza um único primer ao invés de um par de primers.

O primer único tem seqüência arbitrária, e portanto sua seqüência
alvo é desconhecida.

Uma característica fundamental dos marcadores RAPD é o fato
deles se comportarem como marcadores dominantes. Dominância
do ponto de vista da interpretação relativa entre genótipo e
fenótipo de um indivíduo.

Embora a grande maioria dos marcadores RAPD possuam
comportamento "dominante", existe a possibilidade de se
amplificar marcadores co-dominantes , ou seja, amplificar ambos
os alelos de um loco.
Características do RAPD:

Obtenção
de
"fingerprinters'
(impressões
digitais)
genômicos de indivíduos, variedades e populações.

Análise estrutural e diversidade genética em populações
de melhoramento e bancos de germoplasma.

Estabelecimento de relacionamentos filogenéticos entre
diferentes espécies.

Construção de mapas genéticos de alta cobertura
genômica
econômico.
e
a
localização
de
genes
de
interesse
Base genética dos marcadores RAPD
- escada 100 pb
- E. acervulina
- E. tenella
- E. maxima
- E. praecox
- E. mitis
- E. brunetti
- E. necatrix
- Conrrole
RAPD inter-específico de Eimeria
600 pb -
J-20
VNTR - Variable Number of Tandem Repeats
Número variável de repetições seriadas
Características do VNTR:
• Seqüências repetitivas agrupadas ou espalhadas ao longo do
genoma.
• São constituídas por blocos cujo número de
unidades
repetitivas é variável, gerando polimorfismos.
• Blocos de unidades repetitivas formadas por 1 a 4 pb no locus
hipervariável são conhecidas como microssatélites. Unidades
de 5 a cerca de 100 pb são denominadas minissatélites.
Características do VNTR:
• São observados através de digestões do DNA genômico
seguidas de ensaios de Southern blot com sondas homólogas às
regiões do minissatélite.
• Obtém-se um padrão de múltiplas bandas devido ao caráter
multilocus.
• Os padrões de múltiplas bandas constituem os chamados “DNA
fingerprints” e permitem discriminar indivíduos e estabelecer
graus de parentesco e consangüinidade.
Características do VNTR:
• São obtidos através de PCR de loci específicos.
• Cada "ilha" microssatélite, independente do elemento repetido
(CA, TG, ATG etc.) constitui um loco genético altamente variável,
multialélico, de grande conteúdo informativo.
• A análise de vários loci permite estabelecer relações de
paternidade e identificação personalizada, através dos alelos
encontrados nos indivíduos.
• Não requerem Southern blots. A análise consiste no PCR de
vários loci, eletroforese em gel e interpretação.
Vantagens e limitações dos marcadores microssatélites
• A expressão co-dominante e o multialeslismo, os marcadores
SSR (seqüências simples repetidas = microssatélites) são os que
possuem
o
mais
elevado
conteúdo
de
informações
de
polimorfismo na terminologia de marcadores moleculares.
• Os SSR são muito mais freqüentes e distribuídos ao acaso,
permitindo a mais completa cobertura de qualquer genoma
eucarioto.
• A maior limitação da tecnologia microssatélite é a grande
quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento
prévio dos marcadores.
Modelos
Eletroforese em gel
Análise de casos moleculares
Seminários