Universidade Camilo Castelo Branco
Instituto de Engenharia Biomédica
JORGE EDUARDO DE MENEZES
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE
ANTIOXIDANTE DE DERIVADOS DA BOLDINA
CHEMICAL SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND EVALUATION OF
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE BOLDINE DERIVADES
São José dos Campos, SP
2013
II
Jorge Eduardo de Menezes
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DE
DERIVADOS DA BOLDINA
Orientador: Prof. Dr. Adjaci Fernandes Uchoa
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Engenharia Biomédica da
Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção
do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
São José dos Campos, SP
2013
III
IV
V
DEDICATÓRIA
Ao Deus Trino, autor e consumador de minha
fé e vida, que por amor, me capacita e
acrescenta em conhecimento e sabedoria.
À minha mãe Mara Cristina Garolla e meu
irmão Júlio César de Menezes, por serem
continuamente meus referenciais de vida,
exemplos de dedicação, caráter e afeto
incondicional, por tudo, minha eterna gratidão,
amor e respeito.
À minha esposa Viviane Cristina Longuini de
Menezes, fonte inspiradora de minha obra e
conquistas, por toda compreensão, incentivo,
paciência e apoio, o brilho em meus olhos são
para você.
À minha filha Beatriz, tão pequena e já tão
presente, por renovar em mim a certeza de
um bom futuro, à você um amor inexplicável.
Ao professor Dr. Adjaci Uchôa Fernandes,
pelo exemplo de generosidade, humildade e
dedicação, tenho a honra de tê-lo como
orientador.
VI
AGRADECIMENTOS
Ao longo de nossa vida, encontramos pessoas que se mostram parte
fundamental de nossa história, pois em diversos momentos as encontramos
próximas, independente de sua própria condição humana, e essas pessoas são
capazes de alterar o curso de nossas vidas por isso agradeço a todos, em especial;
À Deus, por sua presença constante me fortalecendo e guiando-me, por todas
as oportunidades e desafios que me fizeram hoje um ser humano melhor, de valores
mais sólidos e olhos focados nos sonhos que Ele mesmo sonhou para mim.
À todos os meus familiares queridos, Mãe e Júlio, pelas orações constantes,
a fé inabalável e as palavras de encorajamento e carinho que me foram
determinantes; Roberto, Zilda, Sérgio, Cris, Pedro Henrique, Andréia, Alex, Giovani
pelo incentivo e momentos de descontração, minha esposa Viviane foi sempre a
motivação e fonte inesgotável de ânimo em todos os momentos e como esquecer da
Belinha sempre aquecendo meus pés nas horas de introspecção.
Aos colegas de pós-graduação, em especial à Mirian Arid, Luiz Arrifano,
Denilce, Zena e Henrique que sempre dividiram comigo os risos e aflições desse
período, sem essa troca meus dias seriam mais cinzas.
Aos colegas da Universidade Camilo Castelo Branco, com destaque aos do
curso de farmácia, que sempre se mostraram solícitos em contribuir para o
desenvolvimento deste trabalho.
Aos professores do Instituto de Engenharia Biomédica – Unicastelo, pela
oportunidade e dedicação para obtenção deste título, em especial aos sempre
presentes Dra. Adriana Barrinha Fernandes, pela inestimável colaboração e ao Dr
Antonio Guillermo Jose Balbin Villaverde e Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco pela
dedicação e empenho.
Às secretárias de pós-graduação Nídia e Elaine, pela dedicação, auxílio e
apoio.
Ao Prof. Dr. Roberto Rodrigues Ribeiro, por acreditar no meu potencial e pela
disposição em contribuir com esse trabalho, minha mais profunda estima.
Ao Dr. Adjaci Fernandes Uchoa, por aceitar compartilhar seus conhecimentos
e de forma tão humana ajudar a alicerçar meu perfil profissional, tenho-o com
exemplo de pesquisador idôneo, ético e apaixonado pelo seu trabalho.
VII
EPÍGRAFE
“O temor do Senhor é o princípio do
conhecimento, mas os insensatosdesprezam
a sabedoria e a disciplina.”
Provérbios 1:7
“Se algum de vocês tem falta de sabedoria,
peça-a a Deus, que a todos dá livremente de
boa vontade; e lhe será concedida.”
Tiago 1:5
(Bíblia Sagrada)
VIII
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
DE ANÁLOGO DA BOLDINA
RESUMO
A boldina ((S) - (1,10-dimetoxi-2, 9 dihidroxiaporfina), é um alcalóide extraído do
Boldo (Peumus boldus), o boldo apresenta as seguintes propriedades, estimulação
da digestão, sedação ao sistema nervoso, citoprotetor e anti-inflamatória,
anticolinérgica por ação de bloqueio dos receptores adrenérgicos e antagonistas de
canais de cálcio, também mostra uma boa afinidade para os receptores
dopaminérgicos. Tem-se caracterizado nos últimos anos como um antioxidante que
protege as células eficazmente dos diferentes sistemas contra a peroxidação lipídica
induzida por radicais-livres ou inativação da enzima. A instalação do estresse
oxidativo se dá por meio de um desequilíbrio entre os fatores próoxidantes e
antioxidantes, em favor dos primeiros. O sistema de defesa antioxidante tem o
objetivo primordial de manter o processo oxidativo dentro dos limites fisiológicos e
passíveis de regulação, impedindo que os danos oxidativos se amplifiquem,
culminados em danos sistêmicos irreparáveis. Os mecanismos de geração de
radicais livres ocorrem, sobretudo, nas mitocôndrias, membranas celulares e no
citoplasma. Modificação molecular consiste em dois processos gerais, dissociação e
associação molecular com a manutenção do agrupamento de ação da molécula
original. Sendo assim objetivou-se com esse trabalho a síntese de análogos da
boldina através da reação de esterificação com o anidrido maleico e a substituição
nucleofilica do cloreto de palmitoíla afim de alterar sua solubilidade e permitir uma
maior biodisponibilidade da boldina nas membranas celulares e lipídicas
favorecendo e aumentando sua ação antioxidante. Sendo possível caracterizar o
análogo hidrofílico maloil-boldina que apresentou um perfil antioxidante frente ao
radical de DPPH mais estável e com capacidade antioxidante total 15% maior e
velocidade de inibição do radical 300 vezes maior quando comparado ao protótipo
inicial.
Palavras-chave: boldina, antioxidante, esterificação, DPPH.
IX
CHEMICAL SYNTHESIS, CHARACTERIZATION AND EVALUATION OF
ANTIOXIDANT ACTIVITY OF THE BOLDINE ANALOG
ABSTRACT
Boldine ((S )-(1,10- dimethoxy -2,9-dihidroxiaporphine) is an alkaloid extracted from
bilberry (Peumus boldus ), the bilberry has the following properties stimulation,
digestion,
nervous
system
sedation,
cytoprotective
and
anti-inflammatory
anticholinergic action by blocking adrenergic receptor and calcium channel
antagonists, also shows a good affinity for dopamine. It has been characterized in
recent years as an antioxidant that effectively protects cells against different systems
of lipid peroxidation induced by free radicals or inactivation of the enzyme.
Installation oxidative stress occurs by means of an imbalance between the factors
pro- oxidants and antioxidants in favor of the former. Antioxidant defense system has
the primary objective of maintaining the oxidative process within physiological limits
and subject to regulation by preventing oxidative damage from spreading,
culminating in systemic damage irreparable damage. Mechanisms of free radical
generation occur mainly in mitochondria, cell membranes and cytoplasm. Molecular
modification consists of two general processes, dissociation and molecular
association with the maintenance of the group action of the original molecule.
Accordingly, aim with this work aims to synthesize analogues of boldine by
esterification with maleic anhydride and nucleophilic substitution of the chloride
palmitoíl, in order to change its solubility and allow greater bioavailability of boldine in
cell membranes, favoring the increase of its antioxidant action. It was characterized
the analog - hydrophilic maloil boldine that showed an antioxidant profile against the
DPPH radical more stable, presenting 15% more antioxidant capacity and 300 times
faster kinetic velocity when compared with the initial prototype.
Key-words: boldine, antioxidant, esterification, DPPH.
X
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Etapas reacionais para redução tetravalente do Oxigênio molecular
(O2) nas cadeia respiratória mitocondrial...........................................................
20
Figura 2. Etapas da ionização do ácido ascórbico (1) em ascorbato (2) e
posterior oxidação em desihidroascorbato (3) e seus produtos irreversíveis
oxalato (4) e treonato (5)....................................................................................
23
Figura 3. Etapas da ionização do ácido úrico (1) em urato (2) e posterior
oxidação em radical urato (3) em equilíbrio com ânion radical urato (4) e seu
produto de quelação metálica (Me) (5)...............................................................
23
Figura 4. Defesas antioxidantes contra radicais livres.......................................
26
Figura 5. Estrutura geral de substituição e orientação em anel aromático.........
27
Figura 6. Ligações de hidrogênio na espécie neutra de substâncias contendo
oxigênio em grupo substituinte...........................................................................
28
Figura 7. Ligações de hidrogênio nas interações intra-moleculares na
molécula da wogonina........................................................................................
28
Figura 8. Estrutura geral de um flavan e em destaque (vermelho) regiões
importantes para atividade antioxidante.............................................................
Figura
9.
Mecanismo
das
reações
de
oxidação
em
29
espécies
fenólicas..............................................................................................................
30
Figura 10. Participação mitocondrial na geração e consumo de radicais livres
em relação à idade da célula..............................................................................
32
Figura 11. Mecanismo das reações de iniciação do processo de peroxidação
lipídica.................................................................................................................
33
Figura 12. Mecanismo das reações de propagação da peroxidação lipídica.....
34
Figura 13. Mecanismo das reações de terminação da peroxidação lipídica......
34
Figura 14. Fórmula estrutural da Boldina...........................................................
38
Figura 15. Reação de síntese da Mono maloil-boldina......................................
47
Figura 16. Espectro de RMN 1H do produto da primeira reação de síntese da
Mono-maloil-boldina em DMSO-d6, 300 MHz....................................................
49
Figura 17. Reação de síntese solvent-free da maloil boldina.............................
50
Figura 18. Reação de síntese da palmitoil boldina.............................................
50
XI
Figura 19. Curva de calibração do DPPH...........................................................
51
Figura 20. Absorbância de DPPH com 2,5% de solução de boldina (padrão)
em solução de DPPH 60mM em triplicata..........................................................
53
Figura 21. Traço cinético da concentração media de DPPH com 2,5% de
solução de boldina (padrão)...............................................................................
53
Figura 22. Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de
boldina (padrão) 8 min iniciais............................................................................
54
Figura 23. Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de
boldina (padrão) de 9 a 25 min..........................................................................
54
Figura 24. Absorbância de DPPH com 2,5% de solução de Mono-maloilBoldina em solução de DPPH 60mM em triplicata.............................................
55
Figura 25. Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de
Mono-maloil-boldina em triplicata.......................................................................
57
Figura 26. Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de
Mono-maloil-boldina 8 minutos iniciais...............................................................
57
Figura 27. Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de
Mono-maloil- boldina de 9 a 60 min....................................................................
58
Figura 28. Decaimento comparativo do % DPPH remanescente frente a
solução de Boldina e Mono-maloi-Boldina a 20 mM após 60 min.....................
58
Figura 29. Compostos aporfínicos fenólicos e não fenólicos utilizados nos
estudos da relação estrutura–atividade antioxidante: boldina [1], clocaurina
[2], glaucina [3], norarmepavina [4], aporfina [5], reticulina [6] e grupo
59
farmacofórico [7].................................................................................................
Figura 30. Planejamento da síntese de derivados hidro e lipofílicos da Boldina
60
Figura 31: Mecanismo de reação de produção da maloil-boldina a partir do
anidrido maleico [2] e boldina [1]........................................................................
61
Figura 32. Mecanismo de reação de produção da palmitoil-boldina a partir do
cloreto de palmitoíla [2] e boldina [1]..................................................................
64
Figura 33. Reação geral entre o radical DPPH e substratos orgânicos (R).......
65
Figura 34. Modificação molecular e regiões de estabilização do radical............
71
Figura 35. Mecanismo para estabilização do radical maloil do protótipo...........
71
Figura 36. Compostos aporfínicos dehidroaporfina [1] e oxiaporfina [2]............
72
XII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Emprego farmacológico do Pneumus boldus Molina em culturas
populares......................................................................................................... 37
Tabela 2. Ação farmacológica e efeito da boldina..........................................
41
Tabela 3. Resultado Rf nos diferentes meios de eluição................................
47
Tabela 4. Resultado Espectro de RMN 1H do produto da reação da maolilboldina pela 1ª rota.........................................................................................
48
Tabela 5. Resultado da análise em triplicata da absorbância da solução
metanólica de Boldina.....................................................................................
52
Tabela 6. Resultado da análise em triplicata da absorbância da solução
metanólica de Mono-Maloil-Boldina................................................................
56
XIII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP - Adenosina Tri Fosfato
ROS - Espécies Reativas de Oxigênio
RNS - Espécies Reativas de Nitrogênio
NADPH - Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato Reduzida
DNA - Ácido Desoxiribo Nucléico
DMF - Dimetilformamida
CCD - Cromatografia de Camada Delgada
DPPH - 2,2-Diphenyl-1-picryl-hidrazil
XIV
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................ 16
1.1. Objetivo geral......................................................................................
18
1.2 Objetivos específicos............................................................................ 18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................
19
2.1. Os antioxidantes e os radicais livres celulares.................................... 19
2.2 - Processos oxidativos fisiológicos e patológicos................................. 31
2.3. Fitoterápico.......................................................................................... 35
2.3.1. Boldo e seu alcaloide majoritário Boldina......................................... 35
3. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................
42
3.1. Reagentes e solventes........................................................................
42
3.2. Síntese dos derivados da Boldina.......................................................
42
3.2.1. Síntese química da Maloil-boldina.................................................... 42
3.2.2. Síntese química da Maloil-boldina (Solvent-free)............................. 43
3.2.3. Síntese química da Palmitoil-boldina...............................................
44
3.3. Análise de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H)......................
44
3.4. Análise da atividade antioxidante........................................................
45
3.5. Análise estatística................................................................................ 46
4. RESULTADOS...........................................................................................
47
4.1 - Síntese e caracterização dos derivados da Boldina..........................
47
4.1.1 - Síntese e caracterização da Maloil-boldina..................................... 47
4.1.2. Síntese e caracterização da Palmitoil-boldina.................................. 50
4.2. Capacidade antioxidante.....................................................................
51
4.3. Relação estrutura-atividade antioxidante............................................
59
5. DISCUSSÃO............................................................................................... 60
5.1. Síntese e caracterização dos derivados da Boldina............................ 60
5.1.1. Síntese e caracterização da Maloil-boldina...................................... 61
5.1.2. Síntese e caracterização da Palmitoil-boldina.................................. 64
5.2. Capacidade antioxidante.....................................................................
65
5.3. Relação estrutura-atividade antioxidante............................................
71
6. CONCLUSÃO.............................................................................................
73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................................
74
XV
APÊNDICE - Bibliografia consultada..............................................................
80
16
1. INTRODUÇÃO
A participação de espécies reativas de oxigênio (ROS) entre elas de oxigênio
singletes (1O2), no desenvolvimento de processos patológicos, que podem ser
mediados ou não pela radiação luminosa (eventos fotoquímicos), e dentre diversos
outros danos provocam em especial o envelhecimento precoce das células e
favorecem a peroxidação lipídica tanto em ensaios in vitro quanto in vivo (HALUSKA
et al., 2012; UCHOA et al., 2011).
O balanço oxidativo envolvendo ROS somados a outros agentes oxidantes
como as espécies reativas de Nitrogênio (RNS) e os compostos endógenos ou
exógenos com atividade antioxidante está diretamente relacionado com fatores
externos, tais como fumo, exposição à radiação ultravioleta e a compostos oxidantes
tais como ozônio; o envelhecimento celular também é sendo descrito como
responsável pelo aumento dessas espécies em diversos organismos, bem como a
inativação ou ineficiência na recuperação de importantes enzimas que atuam em
vários momentos na inativação das espécies oxidante (GROß; DURNER;
GAUPELS, 2013; JOMOVA et al., 2010; KELLY et al., 1995; SMITH; CAPPAI;
BARNHAM, 2007; VALKO; MORRIS; CRONIN, 2005).
Dessa maneira, há um desequilíbrio entre as quantidades de ROS/RNS em
relação aos compostos antioxidantes, que é definido o termo estresse oxidativo,
responsável pelo acometimento de diversas patologias ao organismo de plantas,
microorganismo e mamíferos, com destaque as que envolvem a degradação de
constituintes lipídicos celulares e os eventos associados à apoptose (GILL; TUTEJA,
2010; LEVINE; KROEMER, 2008); SIES, 1997; SOHAL; WEINDRUCH,1996)
Mais recentemente, tem-se verificado que as substâncias antioxidantes são
capazes de reverter estados patológicos, como a disfunção endotelial provocada
pela hipercolesterolemia e também reduzir o numero de eventos coronários,
melhorar a viabilidade fecundativa de espermatozóides na prática clínica, bem como
promover uma melhorar significativa em pacientes portadores de diabetes mellitus
do tipo 2. (AMINBAKHSH; MANCINI, 1999; FARID et al., 2013; MENEZO et al.,
2014).
17
No entanto a ação antioxidante parece ocorrer por ação preventiva em muitos
desses processos de melhora fisiológica, tal como consta ser no centro de reação
fotossintético onde o oxigênio singlete é suprimido pela presença de carotenóides os
quais estão inseridos nas proteínas em posição estratégica, tendo como função
suprimir ROS entre outras espécies formadas por eventuais falhas no vazamento da
espécie Mix-triplete-singlete do centro de reação fotossintético de Rhodobacter
sphaeroides (TANDORI et al., 1996; UCHOA, 2008).
Os estudos de novas estruturas antioxidantes para interação com os diversos
sistemas onde a sua ação preventiva demonstra atividade estão centralizados nos
compostos fenólicos de origem vegetal, pois eles agem como aceptores de radicais
livres, interrompendo a reação em cadeia provocada por estes, além de atuarem
também nos processos oxidativos catalisados por metais, tanto in vitro, como in vivo.
Entretanto, observa-se em diferentes outros compostos naturais com destaque para
os alcalóides aporfínicos uma atividade antioxidante e fotoprotetora que os tornam
novos protótipos para pesquisa dessas estruturas (CASSELS; ASENCIO; CONGET,
1995; HALLIWELL et al.,1995; SHAHIDI; WANASUNDARA, 1992; SUI; GAO, 2014).
O interesse em produtos naturais com atividade antioxidante, visa permitir a
substituição dos compostos sintéticos ou promover associações entre eles, com o
intuito de otimizar sua eficiência. Isso porque a toxicidade provocada pelo consumo
de antioxidantes sintéticos, bem como de seus produtos de degradação ainda não
estão bem esclarecidas (PEDRIALI et al., 2008; SIDRA; HUSSAIN; MALIK, 2013).
Tendo em vista esse aumento nas pesquisas de produtos naturais com
atividade antioxidante, destacam-se para esse fim os flavonóides, compostos
derivados dos polifenóis, e alcalóides aporfínicos dentro os quais se destaca a
boldina o principal alcalóide do Boldo-do-Chile (Pneumus boldus), representando
cerca de 12 a 19% do conteúdo total de alcalóides. Alguns experimentos in vitro e in
vivo a fim de conhecer melhor a farmacocinética da boldina descreveram que tanto
após administração oral quanto intravenosa, a concentração plasmática de boldina
decai rapidamente, indicando aparentemente uma cinética de primeira ordem.
Quando administrada por via oral, a boldina foi rapidamente absorvida e
concentrada preferencialmente no fígado, sendo encontradas concentrações
substancialmente menores no coração e no cérebro (ALMEIDA; MELO; XAVIER,
2000; HIDALGO et al., 2005; KONRATH et al., 2008; O’BRIEN; CARRASCO-POZO;
SPEISKY, 2006; YEH et al., 2012; YOUN et al., 2002).
18
Portanto, por possuirmos diversos sistemas fisio-patológicos em que a
participação dos antioxidantes demonstra uma redução do estresse oxidativo e
consequentemente
alterações
o
estruturais
restabelecimento
que
permitam
fisiológico
uma
desses
melhor
processos,
disponibilidade
novas
desses
antioxidantes à esses sistemas, com destaque para as diferentes solubilidades dos
compostos, promovem um interesse crescente na geração de novas estruturas com
o menor efeito nocivo à outros sistemas fisiológicos, principalmente associado a
metabolização, tendo assim, os produtos de origem natural um papel relevante
devido a predição de seus produtos de degradação e interações fisiológicas, tais
alterações visam também, aumentar a atividade antioxidante e seu tempo de meia
vida, para otimização de seu efeito terapêutico, farmacocinética e farmacodinâmica.
1.1. Objetivo geral
Sintetizar derivados do alcalóide boldina, a fim de otimizar sua ação antioxidante,
neste sentido foi realizada a esterificação de suas hidroxilas fenólicas por dois
diferentes mecanismos.
1.2 Objetivos específicos
a) Obter derivados com diferentes solubilidade à partir da Boldina;
b) Determinar a atividade antioxidante dos análogos;
c) Determinar a relação estrutura-atividade antioxidante entre os análogos da
Boldina.
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Os antioxidantes e os radicais livres celulares
As vias metabólicas celulares utilizam em seus processos catabólicos e anabólicos
fisiológicos o oxigênio molecular em seu estado fundamental (O2), por possuir
capacidade aceptora de elétrons, sendo desta forma, essencial para catalisação de
algumas reações endógenas relacionadas à produção de energia (ATP) a partir dos
alimentos da dieta (HALLIWELL, 1994; SOHAL; ALLEN, 1986).
Durante esses processos metabólicos ocorre a formação de subprodutos das
reações como os ROS, termo que generaliza espécies químicas radicalares livres
que possuem como característica a presença de um elétron desemparelhado, tais
como, radicais hidroxilas (OH·), oxido nítrico (NO·), radical peroxila (ROO·), ânion
radical superoxido (O2·-), como também os que não são radicais livres, como,
peróxido de Hidrogênio (H2O2), ozônio (O3), oxigênio singlete (1O2), ácido
hipocloroso (HOCl). Radicais são fracamente atraídos para um campo magnético e
são considerados paramagnéticos. Muitos radicais são altamente reativos e podem
doar um elétron ou extrair um elétron de outras moléculas, portanto, comportando-se
como oxidantes ou redutores. Esta elevada reatividade, faz com que a maioria dos
radicais possua uma semi vida muito curta (10-6 segundos ou menos), em sistemas
biológicos, embora algumas espécies possam se manter por muito tempo
(ARUOMA, 1994; HALLIWELL, 1994).
Os processos metabólicos ocorrem em organelas celulares especificas tais
como as mitocôndrias durante a respiração aeróbia, onde ocorre a conversão do
oxigênio molecular em água (Figura 1), nos perisossomas na metabolização de
lipídios e outras moléculas orgânicas com a produção de peróxido de Hidrogênio e
em processos de degradação enzimática do citocromo P450, visando a
metabolização e inativação de substancias químicas com atividade biológica, com o
intuito de facilitar sua excreção (SIES, 1997).
A redução tetravalente do oxigênio intracelular se dá inicialmente de modo
completo, para evitar a formação de derivados monoeletrônicos, sendo esse
processo de redução mediado enzimaticamente, via citocromo oxidase, porém
estudos mostram que cerca de 5% deste oxigênio segue para a formação de
20
espécies reativas, iniciando com os radicais superoxidos (O2-.), seguido da formação
de hidroperoxila (HO2-.) que passa posteriormente a formação de peróxidos de
hidrogênio (H2O2) e após recebimento de 1 elétron passa a hidroxila (OH-),
estabilizando com a formação final de água (H2O). A figura 1 a seguir demonstra a
interação eletrônica ao processo de metabolização do oxigênio intracelular (LIU et al.
1999).
O O
eHO O
O O
+
e-
2H
HO OH
+
e-
H
H2O
+
HO
+
e-
H
H2O
Figura 1: Etapas reacionais para redução tetravalente do Oxigênio molecular (O2) nas cadeia
respiratória mitocondrial.
Fonte: Adaptado de Cohen (1990).
A geração de radicais livres também pode ocorrer em processos patológicos
e fontes exógenas tais como o uso de alguns medicamento e alimentos, exposição à
radiação ionizante e ultravioleta, como também associados aos hábitos como fumo,
etilismo, poluição, entre outros fatores (EBADI, 2001).
O termo antioxidante é empregado como definição de uma substância que,
quando presente em baixas concentrações comparadas com o substrato oxidado,
decai ou previne significativamente a sua oxidação (HALLIWELL et al.,1995).
De acordo com esta definição pode-se classificar em quatro níveis o processo
oxidativo nos quais os antioxidantes podem atuar: 1º aprisionamento de radicais de
iniciação que podem exercer sua atividade por dois mecanismos, o primeiro está
relacionado com a quebra da cadeia de oxidação, mecanismo empregado aos
antioxidantes primários, que promovem a doação de um elétron para o radical livre,
já o segundo envolve a remoção das espécies reativas (ROS/RNS), por inibir o
21
catalisador inicial da cadeia de oxidação; 2º ligação a íons metálicos, 3º
aprisionamento de radicais peroxilas (OH-2) e 4º remoção de biomoléculas
danificadas pela oxidação (STAHL et al., 1998). Em tecidos biológicos os
antioxidantes podem ainda atuar como co-antioxidantes ou por regulação da
expressão genética. Tais processos antioxidantes podem ser mediados por
substancias que se apresentam no meio intra ou extracelular e são classificadas
como enzimáticas ou não-enzimáticas (KRINSKY, 1992).
Evolutivamente o organismo possui um sistema para supressão das espécies
oxidantes, para isso possuímos uma família de enzimas, as superoxidos dismutases,
que possuem como função a catálise da dismutação do radical superoxido em H2O2
e O2 na presença do próton H+, sendo encontrada no citosol com zinco-cobre e na
mitocôndria das células aeróbicas com manganês, a isoforma desta enzima com
ferro e níquel também já foram encontradas em vegetais superiores (BANNISTER;
BANNISTER; ROTILIO, 1987; ZELKO; MARIANI; FOLZ, 2002).
Há outras enzimas também encontradas nos seres humanos e que possuem
atividades supressoras de espécies reativas, tais como as catalases, uma classe de
hemeproteína citoplasmática que catalisa a redução do H2O2 a H2O e O2, compostos
menos nocivos às células (CHELIKANI; FITA; LOEWEN, 2004; GAETANI, 1996).
O sistema Glutationa reúne um apanhando de enzimas e já foram descritas
em diversos vegetais, animais e microorganismos. A glutationa-peroxidase, uma das
integrantes deste sistema é responsável por catalisar a redução do H2O2 e peróxidos
orgânicos para álcoois pela conversão da glutationa reduzida (GSH) à glutationa
oxidada (GSSG). Atualmente quatro isoenzima foram descritas entre as quais
destacam-se a glutationa-peroxidase 1 por sua alta eficiência e a glutationaperoxidase 4 por sua participação na prevenção da oxidação dos hidroperóxidos
lipídicos. A glutationa-redutase, uma flavoproteína dependente de NADPH
recuperadora da glutationa reduzida (GSH), é o tiol mais abundante no meio
intracelular, se tornando um dos agentes antioxidantes celulares mais importantes
na proteção das células à exposição a agentes como íons ferro, oxigênio
hiperbárico, ozônio, radiação e luz ultravioleta (BRIGELIUS-FLOHÉ, 1999; HAYES;
FLANAGAN; JOWSEY, 2005; MEISTER; ANDERSON, 1983).
Enzimas proteolíticas, como as proteases, proteinases e peptidases
presentes no citosol e nas mitocôndrias das células de mamíferos, reconhecem,
degradam e removem as proteínas oxidadas, a fim de impedir o seu acumulo. Os
22
sistemas de reparação de DNA, também desempenham um papel importante em
todo o sistema de defesa contra o dano oxidativo, vários tipos de enzimas, tais como
nucleases, e glicosidases reparam o DNA danificado. Há outra importante função
chamada de adaptação em que o sinal para as reações de produção de radicais
livres induz a formação e transporte do antioxidante ao local apropriado (LEE; JANG,
2004).
Processos não enzimáticos também são descritos na proteção do dano
oxidativo celular, os quais são classificados como antoxidantes hidrofílicos e
lipofílicos, conforme sua natureza química:
O acido ascórbico “vitamina C” é o antioxidante hidrofílico exógeno de maior
expressão comercial, trata-se de monossacarídeo encontrado tanto em animais
quanto em plantas, não é biosintetizado em humanos e deve ser obtido da dieta,
encontrado circulante nos fluídos biológicos sob a forma de ascorbato, sendo
mantido na sua forma reduzida, inclusive no meio intracelular por reação com a
glutationa, que pode ser catalisada pela proteína dissulfito isomerase e
glutarredoxinas. O ácido ascórbico é um agente redutor e pode, assim, neutralizar
ROS e nitroaminas carcinogênicas, possuindo um efeito antioxidante direto
(MEISTER, 1994; PADAYATTY et al., 2003).
O ascorbato possui também propriedades pró-oxidantes, pois os íons Fe2+ e
Cu1+ reagem com o peróxido de hidrogênio gerando o radical hidroxila.
Indiretamente, o ascorbato pode induzir as reações de radicais livres (Figura 2).
Porém, em função do Ferro encontrar-se, na maior parte do tempo, ligado a
proteínas de transporte ou armazenamento, em situação fisiológica, as propriedades
antioxidantes do ascorbato suplantam suas propriedades pró-oxidantes (HALLIWEL
et al., 1995).
23
OH
O
O
OH
O
OH
HO
OH
O
O
OH
HO
OH
O
OH
O
O
1
O
O
O
O
OH
+
3
OH
OH
O
2
O
4
OH
5
Figura 2: Etapas da ionização do ácido ascórbico (1) em ascorbato (2) e posterior oxidação em
desihidroascorbato (3) e seus produtos irreversíveis oxalato (4) e treonato (5).
Fonte: Adaptado de Meister (1994).
O ácido úrico é responsável por cerca de metade da capacidade antioxidante
do plasma. Nos mamíferos, é produto secundário de excreção, derivado das bases
purínicas. Na maioria dos tecidos orgânicos encontra-se na forma de ânion urato
(pKa1=5,4). O mecanismo antioxidante do urato pode ser resumido pela reação com
a maioria dos agentes oxidantes em velocidade superior a das outras purinas. Nessa
reação, há formação do radical urato estabilizado devido ao pH, esse se encontra na
forma de ânion radical urato, o que facilita a doação de um próton em conjunto com
o elétron. O urato possui grande atividade contra os radicais peroxila é a base do
seu efeito antioxidante protetor do DNA e lipídios, isso ocorre principalmente, devido
o íon estar em meio aquoso, o urato reage com os radicais peroxila antes de esses
penetrarem a membrana e iniciarem seus danos. Outra ação relevante do ácido
úrico está associada a sua capacidade de inibir a reação que torna o ascorbato uma
espécie pró-oxidante, por promover a quelação de íons metálicos (Figura 3)
(JAESCHKE et al., 2002; NIETO et al., 2000).
H
N
O
H
N
HO
O
HN
O
N
H
1
H
N
N
HO
-
O
N
N
H
OH
H
N
N
O
O
N
H
N
N
O
N
N
H
OH
2
-
OH
3
N
H
+
H
4
Me
HO
N
N
Me
H
N
HN
OH
OH
Me
5
Figura 3: Etapas da ionização do ácido úrico (1) em urato (2) e posterior oxidação em radical urato
(3) em equilíbrio com ânion radical urato (4) e seu produto de quelação metálica (Me) (5).
Fonte: Adaptado de Jaeschke et al. (2002).
+
24
Um peptídeo de grande importância entre os antioxidantes hidrofílicos é a
glutationa, tendo como base estrutural o glutamato, cisteína e glicina é encontrada
na maioria das formas de vida aeróbica, sendo sintetizada nas células a partir dos
seus aminoácidos constituintes. Possui propriedades antioxidantes devido a
presença do grupo tiol da cisteína, é um agente redutor e pode ser oxidado e
reduzido reversivelmente. Nas células, a glutationa é mantida na forma reduzida
pela enzima glutationa redutase e, por sua vez, reduz a outros metabólitos e
sistemas enzimáticos. Devido à sua elevada concentração e papel central na
manutenção do estado redox da célula, glutationa é um dos mais importantes
antioxidantes celulares em alguns organismos (MEISTER, 1988).
Já a melatonina, um hormônio secretado pela glândula pineal, também
conhecido quimicamente como N-acetil-5-metoxitriptamina, sendo esta uma
indolamina obtida bioquimicamente a partir do triptofano, encontrado em animais e
em alguns outros organismos vivos, incluindo algas; possui uma potente ação
antioxidante por facilmente atravessar as membranas celulares e a barreira hematoencefálica devido o seu caráter anfifílico, ao contrário de outros antioxidantes, a
melatonina não sofre ciclos redox e uma vez oxidada, mediante a reação com os
radicais livres, não pode ser reduzido ao seu estado anterior, pois forma vários subprodutos finais estáveis. Por isso, tem sido referido como um antioxidante terminal
ou suicida (CANIATO et al., 2003; REITER; CARNEIRO; OH, 1997).
Como antioxidantes lipossolúveis destaca-se o acetato de tocoferol, “vitamina
E”, por sua potente ação antioxidante na quebra de cadeia e também como
sequestrador de radicais livres (ROS/RNS). Ela consiste de 4 tocoferóis e 4
tocotrienóis, o α-tocoferol é o tocoferol mais abundante e mais bioativo in vivo graças
a suas altas taxas de biodisponilidade, seguida pelo γ-tocoferol. O grupo cromanol é
o responsável pela atividade antioxidante, e a provável função da longa cadeia
carbônica é reter a molécula na membrana, justificando sua proteção à peroxidação
lipídica de membranas celulares, este pode ser reciclado de volta para a forma ativa
reduzida por meio da redução de outros antioxidantes, tais como ácido ascórbico,
retinol, ou ubiquinol (HERRERA; BARBAS; VITAMIN, 2001; TRABER; ATKINSON,
2007; WANG; QUINN, 1999).
Ubiquinona
(2,3-dimetoxi-5-metil-6-multiprenyl-1,4-benzoquinona),
ou
a
coenzima Q, é um composto lipossolúvel constituída por um núcleo quinóide redoxativo e uma cadeia lateral hidrofóbica monoinsaturadas de unidades trans-
25
isoprenóides. Ubiquinol é o produto da redução de dois elétrons da ubiquinona. A
forma predominante de ubiquinona em animais e seres humanos é a ubiquinona-10,
contendo 10 unidades isoprenóides na cadeia lateral (o que também tem sido
chamada de ubiquinona 50 para o número total de átomos de carbono na cadeia
lateral). A principal função biológica da ubiquinona é a de funcionar como
componente de redox dos sistemas de transporte de elétrons transmembranas, tais
como a cadeia respiratória mitocondrial, sendo também sugerido para o transporte
de prótons através da membrana mitocondrial interna, por difusão transversal, o que
resulta na conservação de energia. Estudos mostram que mostraram que o
ubiquinol-6, em contraste com ubiquinona-6, é um bom antioxidante e é ligeiramente
mais eficiente do que o α-tocoferol na inibição da peroxidação de hemoglobina
catalisada por ácido araquidônico. Eles também demonstraram que a ubiquinona
reduzida a ubiquinol inibe fortemente a peroxidação lipídica em mitocôndrias
isoladas (DRÖSE; BRANDT, 2012; GOKBEL et al., 2011; ORR et al., 2013).
Uma classe de antioxidantes lipofílicos os retinóides, termo genericamente
usado para compostos sintéticos ou naturais que atuam como pró-vitamina A e
agem sobre radicais peroxilas, incluem também como principais representantes da
classe os carotenóides (α- e β-caroteno e criptoxantina) que podem apresentar-se
clivados enzimaticamente na mucosa intestinal e no fígado. Entre eles, o β-caroteno
é um pigmento encontrado em todas as plantas e é o maior carotenóide precursor
de vitamina A (ARUOMA, 1994; BARBER; HARRIS, 1994).
Outros produtos naturais que se destacam como agentes antioxidantes são
os flavonóides, são derivados fenólicos compreendem um grande grupo de
compostos químicos caracterizados por um esqueleto de carbono C6-C3-C6, onde
C6 são estruturas de anéis aromáticos, e com a presença de um anel oxigenado em
C3, apresentam-se como flavonóide reduzido e flavonóide oxidado previnem a
peroxidação lipídica através do aprisionamento de radicais de iniciação da
peroxidação lipídica, entre eles os ROS, por ligação a íons metálicos, podendo
complexarem-se com íons de ferro e suprimir a reação de Fenton e ainda inibição do
sistema enzimático responsável pela produção de radicais livres (ACKER et al.,
1996; AFANAS’EV et al., 1989).
O papel geral das defesas antioxidantes frente à cadeia de geração das
diferentes espécies de radicais livres está ilustrado na figura 4, onde observa-se a
ação antioxidante de substancias endógenas e exógenas divididas segundo a
26
natureza de seus compostos. As enzimas têm sua ação na catálise da quebra de
espécies de radicalares livres, geralmente no meio intracelular. As proteínas ligamse a metal de transição, tais como ferro e cobre, impedindo a interação desses
metais com peróxido de hidrogênio e superóxido para a posterior formação de
radicais hidroxila altamente reativos. Os antioxidantes de quebra de cadeia são
doadores de elétrons poderosos e reagem preferencialmente com os radicais livres,
passando a ser oxidado, gerando os radicais antioxidantes, e estes eventualmente
serão regenerados ou substituídos. Por definição, o radical antioxidante é
relativamente inerte e incapaz de atacar outras moléculas, de modo a impedir que
moléculas de estruturas importantes, tais como lipídios, proteínas e ácidos nucléicos
sejam danificados (O'CONNELL,1986; YOUNG; WOODSIDE, 2001).
Enzimas antioxidantes
Superóxido dismutase
Catalase
Glutationa peroxidase
Produção de Radicais Livres
O2-, H2O2
Metais de
Transição
Fe2+, Cu+
Antioxidantes de Quebra de Cadeia
Antioxidantes diretos
Antioxidantes secundários
Fase Lipídica
Tocoferóis;
Coenzima Q10
Carotenóides
Flavonóides
Fase Aquosa
Ácido Ascórbico
Ácido Úrico
Sistema glutationa
Outros Tiois
Proteínas ligadas a metais
Transferrina
Ferrina
Lactoferrina
OH-
Danos Teciduais
Mecanismos de Reparo
Figura 4: Defesas antioxidantes contra radicais livres.
Fonte: Adaptado de Young e Woodside (2001).
A relação estrutural para determinação da atividade antioxidante já vem
sendo estudada a algumas décadas, o estudo das relações estrutura-atividade de
um composto-protótipo e seus análogos auxilia na determinação de quais partes da
molécula são responsáveis pela atividade biológica, ou seja, o grupo farmacóforo
(THOMAS; STOCKER, 2000).
27
As relações estrutura-atividade geralmente são elaboradas alterando-se parte
da estrutura química do protótipo e observando-se qual influência na atividade sob o
ponto de vista qualitativo e quantitativo. Pode-se alterar a dimensão e a
conformação do esqueleto de carbono, a natureza e o grau de substituição, a
estereoquímica ou ainda a solubilidade (THOMAS; STOCKER, 2000).
A atividade antioxidante está altamente relacionada à capacidade de doação
de elétrons. A etapa de transferência do hidrogênio tem se destacado, mas a
atividade antioxidante não depende apenas força de energia da ligação O-H. A
estabilização das espécies cátion-radicalar e radicalar formadas também deve ser
considerada (CAO et al., 2005; WRIGHT; JOHNSON; DILABIO, 2001). Muitos
fatores influenciam a atividade antioxidante dos compostos de natureza fenólica, em
especial a posição de substituição e o número de grupos hidroxila (OH), as
propriedades de outros grupos substituintes e a possibilidade de formação de
ligações de hidrogênio.
Inicialmente a posição de substituição da hidroxila no anel fenólico,
considerada em relação a uma posição fixa, influencia diretamente a atividade
antioxidante. Compostos contendo a hidroxila em para são mais ativos do que
aqueles substituídos em orto devido ao impedimento ou meta desfavorecia pela
ressonância (Figura 5). Entre os compostos naturais polifenólicos, notamos que os
compostos com dois (mais comum) ou três substituintes hidroxilas no anel
benzênico possuem maior atividade antioxidante do que os monohidroxilados,
demonstrando haver uma relação direta entre a posição e quantidade das hidroxilas
frente à ação antioxidante (CHENG et al., 2002; CHENG et al., 2003; PANNALA et
al., 2001).
Figura 5: Estrutura geral de substituição e orientação em anel aromático.
Fonte: Adaptado de Cheng et al. (2002).
28
Na presença de grupo hidroxila substituído em posição orto e/ou para em anel
contendo
heteroátomo
nitrogênio
ou
oxigênio,
a
atividade
antioxidante
é
potencializada por efeito de ressonância entre o par de elétrons do tipo π do
heteroátomo e o radical fenóxi formado, para exemplificar o mecanismo desta
atividade temos na figura 6 moléculas que possuem atividade antioxidante
comprovada por apresentarem heteroátomo oxigênio em orto (PANNALA et al.,
2001, WANG; QUINN, 1999).
Figura 6: Ligações de hidrogênio na espécie neutra de substâncias contendo oxigênio em grupo
substituinte
Fonte: Adaptado de Pannala et al. (2001).
As ligações de hidrogênio no composto na forma neutra não aumentam a
atividade antioxidante, mas após a abstração do hidrogênio fenólico, estabilizam o
radical, favorecendo a ação. Um exemplo disso é a baixa atividade antioxidante na
wogonina, molécula representada na figura 7, que possui uma OH (em destaque), se
deve à estabilização do composto que se encontra em equilíbrio químico
estabelecido entre os anéis conjugados. De forma análoga, encontra-se o equilíbrio
entre os grupos O-CH3 e OH (PANNALA et al., 2001).
Figura 7: Ligações de hidrogênio nas interações intra-moleculares na molécula da wogonina
Fonte: Adaptado de Pannala et al. (2001).
29
Posteriormente por meio de estudo cinético, foi avaliada a capacidade antioxidante
de substâncias derivadas de flavonóides, os quais apresentam as seguintes
características estruturais em relação à estrutura protótipo apresentada na figura 8
(CHENG et al., 2002; CHENG et al., 2003; WANG; QUINN, 1999).
Figura 8: Estrutura geral de um flavan e em destaque (vermelho) regiões importantes para atividade
antioxidante
Fonte: Adaptado de Wang e Quinn, (1999).
A relação estrutura-atividade antioxidante de polifenóis conjugados podem ser
resumidas quanto às seguintes características:
- a posição do grupo hidroxila no anel B: em posição para (R²) favorece
atividade, em posições orto e meta essa atividade será reduzida ou ausente e a
presença de um segundo grupo hidroxila no anel B (R¹) potencializa a atividade
antioxidante;
- a presença de dupla ligação (em destaque) conjugada ao grupo oxo, no anel
C: essencial à atividade antioxidante;
- a presença de grupo hidroxila na posição R do anel heterocíclico C: contribui
na atividade antioxidante porém não é essencial;
- grupos hidroxila no anel A: são de menor importância dado a posição
desses grupos (CHENG et al., 2003).
Outro estudo analisou comparativamente a atividade potencial antioxidante de
15 moléculas, por modelagem molecular, observaram a reatividade do ácido gálico e
pirogalol. Entretanto, ressaltaram também a elevada atividade pró-oxidante em
30
soluções de pirogalol e ácido gálico devido à pró-oxidação em espécies quinóides,
como mostrado no figura 9 (PANNALA et al., 2001).
Figura 9: Mecanismo das reações de oxidação em espécies fenólicas
Fonte: Adaptado de Pannala et al. (2001)
A redução do Fe III ao Fe II provocada por estes compostos em incubação, foi
reportada em estudos influenciando na reação de Fenton (Equação 1) e formação
de radicais OH•. Ocorre, também, auto-oxidação, produção de H2O2, aumentando a
concentração de radicais hidroxila segundo a reação de Fenton e ciclo Haber-Weiss
(Equação 2).
Fe²+ + H2O2 → Fe³+ + OH●
(Equação 1)
Fe³+ + ●O2 → Fe²+ + O2
(Equação 2)
Às propriedades eletrônicas soma-se a lipofilicidade (CHENG et al., 2002;
GHOSE; PRITCHETT; CRIPPEN, 1988), que representa a afinidade de uma
molécula ou de um fragmento por ambiente lipofílico (GHOSE; PRITCHETT;
CRIPPEN, 1988; LEACH, 2001). O cálculo de propriedade lipofílica é adicional aos
processos de cálculos de energia e análise conformacional. Esta propriedade está
relacionada ao coeficiente de partição (LogP). O coeficiente de partição é definido
pela razão entre a concentração da substância na fase orgânica e sua concentração
na fase aquosa em um sistema de dois compartimentos sob condições de equilíbrio,
podendo ser obtido por método experimental, como por determinação por shakeflask, ou ainda por método teórico, como o desenvolvido por Ghose-Pritchett-Crippe,
disponível nos programas de Modelagem Molecular (GHOSE; PRITCHETT;
CRIPPEN, 1988).
A Modelagem Molecular pode ser utilizada como ferramenta, calculando
propriedades físico-químicas de compostos em estudo, como a lipofilicidade,
31
entalpia de formação, dentre outras. Assim, podem-se empregar programas de
Modelagem para obtenção teórica do parâmetro de lipofilicidade de substâncias
(THOMAS; STOCKER, 2000).
2.2. Processos oxidativos fisiológicos e patológicos
Os processos oxidativos vêm sendo descritos nos últimos anos como papel
extremamente relevante na patologia de diversas doenças, as espécies com maior
relevância nesses processos são o radical hidroxila, radical ânion superóxido,
peróxido de hidrogênio, oxigênio singlete, o hipoclorito, os radicais de óxido nítrico, e
radical peroxinitrito, o qual é formado a partir de óxido nítrico e de superóxido. Estas
espécies são altamente capazes, de reagir em nível nuclear, em membranas
celulares, danificando as moléculas biologicamente relevantes, tais como o DNA,
proteínas, carboidratos e lipídios, dentre eles, lipídios, ácidos nucleicos e proteínas,
são os principais alvos, desta forma os radicais livres atacam macromoléculas
importantes e conduzem a danos celulares e perturbações da homeostase
(CHEESEMAN; SLATER, 1993; LEVINE; KROEMER, 2008).
Os radicais livres mais importantes em muitos estados de doença são
derivados de oxigênio, particularmente o radical superóxido e radicais hidroxilas, a
formação de radicais no organismo ocorre através de vários mecanismos, que
envolvem tanto os fatores endógenos quanto ambientais (GIORGIO et al., 2007).
Os radicais livres são derivados de processos metabólicos fisiológicos
essenciais aos seres humanos ou a partir de fontes externas, tais como a exposição
aos raios X, ozônio, cigarros, os poluentes do ar, e produtos químicos industriais, a
formação de radicais livres ocorre de forma contínua nas células como
consequência de reações tanto enzimáticas quanto não enzimáticas. As reações
enzimáticas, que servem como fonte de radicais livres, incluem aqueles que estão
envolvidas na cadeia respiratória, na fagocitose, na síntese de prostaglandina, e no
sistema de citocromo P-450. Os radicais livres podem também ser formados em
reações não enzimáticas, onde temos de oxigênio como substituinte em um
composto orgânico, bem como as iniciadas por reações ionizantes (KELLY et al.,
1995; McCAUGHAN, 1999; POURCELOT et al.,1999).
32
Figura 10: Participação mitocondrial na geração e consumo de radicais livres em relação à idade da
célula.
Fonte: Adaptado de Sohal e Weindruch (1996).
O estresse oxidativo é definido como sendo um desequilíbrio entre oxidantes
e antioxidantes em favor dos oxidantes (SIES, 1997) como consequência do
aumento desses radicais livres é a reação dessas espécies com ácidos graxos poliinsaturados (PUFA) presentes nas membranas celulares e nas lipoproteínas,
iniciando um processo em cadeia conhecido como peroxidação lipídica ou
lipoperoxidação que pode ser avaliado e utilizado como um indicador do estresse
oxidativo celular (ANDERSON; KATUNGA; FILIPE et al., 2013; WILLIS, 2012;
SHOEB et al., 2014).
A membrana é o componente celular mais atingido pela peroxidação lipídica,
acarretando alterações em sua estrutura e permeabilidade e, além disso, podemos
ter as seguintes situações: (a) perda de seletividade na troca iônica, (b) liberação do
conteúdo das organelas, como as enzimas hidrolíticas dos lisossomas, (c) formação
de produtos citotóxicos, como o malonaldeído, (d) morte celular (CHANDRA et al.,
2003; GUÉRAUD et al., 2010; JELVEH et al., 2013).
Nos sistemas biológicos a lipoperoxidação pode ocorrer principalmente por
uma via enzimática envolvendo as ciclo-oxigenases e lipoxigenases e por outra via
33
não enzimática envolvendo a participação das espécies reativas do oxigênio, metais
de transição e outros radicais livres, ao que se atribui em especial o processo de
envelhecimento de diversos órgãos e tecidos (JANERO, 1990; PORTER;
CALDWELL; MILLS, 1995).
A membrana é o componente celular mais atingido pela peroxidação lipídica,
conforme ilustrado na figura 10, acarretando alterações em sua estrutura e
permeabilidade e, além disso, podemos ter as seguintes situações: (a) perda de
seletividade na troca iônica, (b) liberação do conteúdo das organelas, como as
enzimas hidrolíticas dos lisossomas, (c) formação de produtos citotóxicos, como o
malonaldeído, (d) morte celular (CHANDRA et al., 2003; GUÉRAUD et al., 2010;
JELVEH et al., 2013).
O processo da lipoperoxidação pode ser dividido em três etapas, a fase de
iniciação representa o início da peroxidação (Figura 11), em que o ácido graxo poliinsaturado sofre ataque de uma espécie que é suficientemente reativa para abstrair
um átomo de hidrogênio a partir de um grupo metileno (-CH2-), formando um radical
de carbono. Este radical é estabilizado por um rearranjo molecular para formar um
dieno conjugado, ou seja, duas duplas ligações intercaladas por uma ligação simples
(CADENAS; SIES, 1985).
Figura 11: Mecanismo das reações de iniciação do processo de peroxidação lipídica.
Fonte: Adaptado de Hsieh e Kinsella (1989).
Em meio aeróbio, o radical alquila inicialmente formado se combina com o
oxigênio formando o radical peroxila, o qual pode abstrair um hidrogênio alílico de
outro ácido graxo, gerando outro radical de carbono e promovendo a etapa de
propagação (Figura 12). Essa reação do radical peroxila com o átomo de hidrogênio
abstraído gera um hidroperóxido lipídico. Peróxidos cíclicos também podem ser
formados, quando o radical peroxila reage com uma dupla ligação na mesma cadeia
de ácido graxo, o que também pode propagar a lipoperoxidação (CADENAS; SIES,
1985).
34
Figura 12: Mecanismo das reações de propagação da peroxidação lipídica.
Fonte: Adaptado de Hsieh e Kinsella (1989).
A fase de terminação é regida pela aniquilação dos radicais formados
originando produtos não radicalares (Figura 13), a velocidade do processo de
lipoperoxidação é limitada pelas fases de iniciação e propagação (HSIEH;
KINSELLA, 1989).
Figura 13: Mecanismo das reações de terminação da peroxidação lipídica.
Fonte: Adaptado de Hsieh e Kinsella (1989).
Os radicais peroxila e alcoxila também podem: sofrer dismutação ou clivagem
beta formando aldeídos; formar uma ligação covalente com resíduos de aminoácidos
ou sofrer um rearranjo formando produtos secundários da lipoperoxidação
35
(derivados hidroxi-, ceto-, cetohidroxi- e epoxi-hidroxi-ácido graxo) (SPITELLER;
SPITELLER, 1998).
O resultado da peroxidação lipídica é observado com o aumento da
quantidade de produtos de radicais livres, especialmente os marcadores da
peroxidação em fluidos corporais. É importante lembrar, no entanto, que a
peroxidação lipídica é um acompanhamento inevitável da morte celular. Na maioria
dos casos, a peroxidação é um fenômeno secundário e, portanto, não indicam
diretamente um papel importante na causa de doenças. As observações, no entanto,
apontam para o aumento do estresse oxidativo através de um mecanismo plausível
gerando o aumento da produção de radicais livres ou uma ineficiência das espécies
antioxidante, para que sua relação com a geração de patologias seja demonstrada.
Além disso, a prova de esforço oxidativo deve ser detectável antes do aparecimento
dos danos no tecido e o aumento das defesas antioxidante numa fase inicial deve
prevenir ou reduzir significativamente os danos aos tecidos (ROSENFELD, 1998;
STEFANIS; BURKE; GREENE, 1997).
Um dos papeis do estresse oxidativo tem sido postulado por sua participação
em diversos processos patológicos, incluindo arteriosclerose, algumas condições
inflamatórias e certos tipos de câncer. Sendo atualmente pensado em relação a sua
contribuição significativa para todas as doenças inflamatórias (artrite, vasculite,
glomerulonefrite, o lúpus eritematoso, síndrome de doenças respiratória do adulto),
doenças isquêmicas (doenças cardíacas, acidente vascular cerebral, isquemia
intestinal), hemocromatose, síndrome da imunodeficiência adquirida, enfisema,
transplante de órgãos, úlceras gástricas, hipertensão e pré-eclampsia, perturbações
neurológicas (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, distrofia muscular),
alcoolismo, doenças relacionadas com o tabaco, e muitos outros, graças a
mudanças estruturais em diversas macromoléculas, alterando assim sua função
(GUÉRAUD et al., 2010; LOVELL et al., 1995).
2.3. Fitoterápico
2.3.1. Boldo e seu alcalóide majoritário Boldina
Peumus boldus Molina pertence à família Monimiaceae da ordem Laurales,
subordem Monimiineae. É considerada uma pequena família, com cerca de 450
36
espécies e 32 gêneros e é originário das montanhas do Chile (ALONSO, 1998) No
Brasil, está representada por 6 gêneros e cerca de 84 espécies (BARROSO, 1978),
sendo que o gênero Peumus possui apenas esta espécie.
O Peumus boldus, conhecido popularmente como boldo ou boldo-do-chile, é
um arbusto ou árvore pequena de, em média, 5 a 6 metros de altura, dióica, em
cujas populações a relação de indivíduos masculinos e femininos é de 1:5
respectivamente (HOFFMANN, 1981). Possui uma copa arredondada e tronco curto
com ramificações cilíndricas e abundantes. As flores são unissexuais, pistiladas e
estaminadas, brancas a branco-amareladas, dispostas em inflorescências do tipo
racemosa com 3 a 15 flores, terminais ou axilares. Os frutos são drupas carnosas e
doces, ligeiramente amarelos, aromáticos possuindo entre 4 a 8 mm de
comprimento podendo permanecer na planta até a próxima temporada, com um
invólucro seco de coloração negra (MARTÍN; DOLI, 1998).
A etnofarmacologia desta espécie é descrita sendo muito empregada pelas
comunidades indígenas dos Andes chilenos, sobretudo pelas etnias qollahuayas e
mapuche, que o aplicavam em casos de luxações e dores reumáticas, já na
medicina tradicional, preparações contendo boldo são geralmente indicadas para o
tratamento de doenças dos sistemas digestivo e hepatobiliar (SPEISKY; CASSELS,
1995).
Nacionalmente utiliza-se a planta na forma de tintura, obtida pela maceração
ou percolação em etanol a 60% (VV), com um teor de 10% (PV) de Pneumus boldus
Molina expressos com no mínimo 0,01% em alcaloides (Boldina) (BRASIL, 2010) ou
em infusão de 1 a 2 gr. de suas folhas secas em 150 mL de água possuindo ambas
apresentações indicação como antidispéptico, colagogo e colerético (BRASIL, 2011).
Outras aplicações tradicionais do boldo por culturas populares estão descritas na
tabela a seguir (Tabela 1):
37
Tabela 1: Emprego farmacológico do Pneumus boldus Molina em culturas populares.
Emprego Farmacológico
Referencia
Estimulante de secreções gástricas
GUPTA, 1995; THE COMPLETE, 1998;
DUKE, 2000
Antidispéptico
THE COMPLETE, 1998; PDR, 2000;
BRUNETON, 2001
Colerético e colagogo
PDR, 2000; NEWALL et al., 2002;
Antiespasmódico
PDR, 2000
Disfunções intestinais, perda do apetite e tensão
muscular
DUKE, 2000
Associado a alcachofra é utilizado para ardores
esofágicos e epigástricos
BRUNETON, 2001;
Associado com cáscara sagrada são usadas em
constipação
BRUNETON, 2001;
Diurético
BISSET et al., 1994; NEWALL et al., 2002
No tratamento de cálculos biliares, dor hepática,
cistite, reumatismo e colelitíase
NEWALL et al., 2002
Fitoquimicamente as folhas de Peumus boldus são caracterizadas pela
presença de taninos (1,2%), óleos essenciais (2-3%), cumarinas (0,5%), alcalóides
(0,1-0,7%) e flavonóides (BLUMENTHAL; GOLDBERG; BRINCKMANN, 2000;
NEWALL; ANDERSON; PHILLIPSON, 2002).
A composição química do óleo essencial, apresenta cerca de 46
componentes diferentes, em sua maioria compostos monoterpenos (90,5% do total)
com maior expressão em limoneno (17%), p-cimeno (13,6%), 1,8-cineol (11,8%), βfelandreno (8,4%), sabineno (6,3%), α-pimeno (5,3%), terpine-4-ol (5,3%), αterpineol (5,2%) e ascaridol (1,0%) (VILA; VALENZUELA, L; BELLO, 1999).
Em flavonóides estão descritos a presença de cinco glicosídeos flavônicos o
pneumosídeo (ramnetina-3-arabinosídeo-3’-ramnosídeo), boldosídeo (isoramnetina
3-glucosídeo-7-ramnosídeo), fragosídeo (isoramnetina diramnosídeo), campferol-3glucosídeo-7-ramnosídeo e isoramnetina-3-arabinosídeo-7-ramnosídeo (SPEISKY;
CASSELS, 1995).
38
Os alcalóides são os responsáveis pelas atividades farmacológicas do boldo.
A boldina ((S) - 1,10-dimetoxi-2, 9 dihidroxiaporfina), com estrutura elucidada na
figura 14, é um alcalóide benzilisoquinolínico extraído do Boldo (Peumus boldus
Molina), e foi o primeiro alcalóide isolado, logo, foram identificados outros alcaloides
isoboldina (II) um isômero da boldina, a isocoridina (III), a norisocoridina (IV), a
isocoridina N-óxido (V), a nmetilaurotetanina (VI), a laurotetanina (VII), a laurolitsina
(VIII) e a reticulina (IX). Também foram isolados alguns alcalóides não-aporfinóides
como a coclaurina, laudanosina e laudanosolina (SPEISKY; CASSELS,1995).
A presença desses alcalóides, principal o de maior expressão (mínimo de 1%
P;P) a boldina, nas preparações da droga vegetal, atribui-se as atividades
antioxidantes, a qual promove um efeito antitumoral, citoprotetor, anti-inflamatório,
anticolinérgica por ação de bloqueio dos receptores adrenérgicos e antagonistas de
canais de cálcio, também mostra uma boa afinidade para os receptores
dopaminérgicos. Tem-se caracterizado nos últimos anos como um antioxidante que
protege as células eficazmente contra a peroxidação lipídica induzida por radicaislivres ou inativação de enzimas antioxidantes.
A capacidade de supressão de oxigênio singlete da boldina e de um de seus
análogos, a glaucina (X) foi avaliada em diversos solventes apresentando um melhor
rendimento.
OH
O
O
HO
N
Figura 14: Fórmula estutural da Boldina.
Fonte: Adaptado de Hughes, Genest e Skakum (1968).
Alguns alcalóides benzilisoquinolínicos fenólicos inibiram a LPO induzida por
Fe2+/cisteína (como produção de substâncias reativas ao tiobarbitúrico ou TBARS)
de membranas microssomais de fígados de ratos, sendo observado efeito similar
com a boldina, utilizando o mesmo modelo experimental (MARTÍNEZ et al., 1992).
Outra propriedade destes alcalóides consiste na proteção da desoxirribose contra a
degradação induzida por Fe3+ - EDTA na presença de peróxido de hidrogênio,
39
agindo como seqüestrador de radicais hidroxil (HO●) (JANG et al., 2000; UBEDA et
al., 1993; YOUN et al., 2002).
A boldina (Figura 14) mostrou também inibição contra a oxidação de
Lipoproteínas de Baixa Densidade (LDL) in vitro e da aterosclerose in vivo em ratos
(SANTANAM et al., 1991) e atividade antioxidante em ensaio de peroxidação
lipídica, onde se mostrou seis vezes mais potente que o padrão catequina
(SCHMEDA-HIRSCHIMANN et al., 2003).
Já em baixas concentrações (IC50 = de 5 x 10-6 a 15 x 10-6 M) a boldina
mostrou proteger efetivamente membranas de células plasmáticas vermelhas contra
o AAPH (2,2’ – azobis [2-amidinopropano]), gerador hidrossolúvel de radicais
alquilperoxil em condições de decomposição térmica, ficando evidenciado também
sua capacidade de inibição da autoxidação espontânea de lipídios de membrana de
células cerebrais determinada pela produção de TBARS e quimioluminescência
(SPEISKY et al., 1992).
Assim como também se mostraram capazes de proteger hepatócitos contra
danos induzidos pela t-BOOH, confirmando sua ação hepatoprotetora através de
testes in vitro e in vivo. Porém, não se confirmou a possível ação colerética em
ratos, mencionada em indicações tradicionais da planta (LANHERS et al., 1991).
Enquanto que posteriormente constatou-se o efeito preventivo da boldina na
peroxidação não-enzimática de lipídios microssomais do fígado humano iniciado por
Fe3+- ATP com NADPH ou NADH como cofatores ou iniciado por CC14 e NADPH
como cofator. Além disso, a boldina demonstrou prevenir a peroxidação e inativação
do citocromo P4502E1 (KRINGSTEIN; CEDERBAUM, 1995).
Contra danos oxidativos mitocondrial em ratos diabéticos induzido por
estreptozotocina (STZ), a boldina demonstrou um efeito protetor inibindo os efeitos
causados pelo dano e alterando a atividade antioxidante da enzima pela
decomposição de ROS e pela inibição da produção de óxido nítrico e redução da
formação do produto de peroxidação. Além disso, pode atenuar o desenvolvimento
de diabetes em ratos provocado por STZ e interferir no estresse oxidativo, uma das
patogêneses do diabetes mellitus (LEE et al., 2002).
Seus efeitos quimioprotetores foram investigados com a modulação in vitro de
enzimas metabolizantes de fármacos em linhagens de células Hepa-1 de hepatomas
de ratos e microssomos hepáticos de ratos, observando-se atividade inibitória no
microssomo hepático e estimulo da atividade de células Hepa-1, podendo decrescer
40
a ativação metabólica de outros xenobióticos incluindo mutações químicas. Estas
descobertas sugerem a possibilidade que, em adição a sua atividade sequestrante
de radicais livres, a boldina pode também proteger componentes de células vitais,
não só pelo decréscimo da ativação metabólica de xenobióticos potencialmente
tóxicos, mas, também, por aumentar a sua remoção (KUBÍNOVÁ et al., 2001).
Os efeitos protetores da boldina foram analisadas em apresentações
comerciais como a tintura de Peumus boldus, onde em células sangüíneas
vermelhas e proteínas do plasma (REINIGER, 1999a) e em células bacterianas
(REINIGER, 1999b) apresentou proteção contra o Tenécio-99, na injúria neuronal
associada com oxidação da catecolamina, apresentou um potencial efeito protetor
neuronal (YOUN et al., 2002). Além disso, o extrato aquoso de Peumus boldus
mostrou atividade antioxidante pela descoloração de uma solução metanólica de
1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) (SCHMEDA-HIRSCHIMANN et al., 2003).
Considerando a atividade anti-inflamatória, a boldina se mostrou muito efetiva
em reduzir edema em pata de cobaias induzido por carragenina e na prevenção do
aumento da temperatura retal em coelhos tratados com pirogênios bacterianos isso
pode ser atribuído à ação antioxidante do alcalóide, já que moléculas que podem
interferir na geração de ROS podem, também, possuir propriedades antiinflamatórias (BACKHOUSE, 1994).
A boldina apresentou foto-instabilidade quando submetida a comprimentos de
ondas maiores que 300 nm, o que levou a investigação de suas propriedades
fotoprotetoras, que evidenciou que a aplicação da boldina (25 mM) em uma área de
12 cm2 protegeu a pele contra a formação de eritemas, na mesma extensão de um
fotoprotetor com fator de proteção solar 5 (HIDALGO,1998; RANCAN, 2002).
As atividades farmacológicas da boldina, portanto podem ser divididas
conforme evidencia-se a atividade anti-oxidante, a tabela 2 traz os principais
mecanismos de ação dessas atividades.
41
Tabela 2: Ação farmacológica e efeito da boldina.
Ação
Farmacológica
Efeito
Referencia
Redução e Prevenção de edema
Prevenção de ROS in vitro por Neutrofilos
Polimorfonucleares
Backhouse, et al., 1994
Antipirético
Prevenção da hipotermia
Backhouse et al., 1994
Antidiabético
Prevenção da hiperglicemia e perda de peso
Redução de TBARS e níveis de carbonil em
vários tecidos
Normalização das enzimas antioxidantes
mitocondriais
Jang et al., 2002
Antiaterogênico
Inibição da oxidação de LDL humana isolada
Inibição da oxidação de plasma ex vivo
Redução de lesões ateroscleróticas aorta
Santanam et al., 2004
Antiplaquetária
Inibição da agregação
Youn et al., 2002
Anti-tumoral
Inibição induzida por TPA de regulação negativa
Prevenção do aumento oxidativo celular induzido
por TPA e na translocação de PKC
Hu et al., 1995
Fotoproteção
Prevenção de aumento de temperatura da pele
Prevenção da formação de eritema cutâneo
Prevenção de danos no fígado GPT (plasma)
Hidalgo et al., 1998
F. Rancan et al., 2002
Lanhers et al., 1991
Anti-inflamatória
Milian et al., 2004
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Reagentes e Solventes
Boldina P.A. (sigma aldrich);
Anidrido Maleico P.A. (cinética);
Dimetilformamida (DMF) (labsynth);
Tolueno (labsynth);
Propanona (labsynth);
Etanol 92% (labsynth);
Éter Etílico (labsynth);
Cloreto de Palmitoíla;
Sílica Gel 60G 70~230 Mesh;
Clorofórmio (labsynth);
Acetato de Etila (labsynth);
n-Hexano (labsynth);
DPPH (2,2-Diphenil-1-picril-hidrazil) (sigma aldrich).
3.2. Síntese dos derivados da Boldina
3.2.1. Síntese química da Maloil-boldina
A síntese foi realizada utilizando uma solução de boldina, obtidos dissolvendo 0,1 g
em 10 mL de DMF (0,305 mmol), em balão de fundo redondo, posteriormente foi
adicionado em excesso de anidrido maleico uma solução preparada por 0,3 g de
anidrido maleico em 10 mL de DMF (3 mmol) e transferida quantitativamente para o
balão volumétrico, essa mistura foi mantida sob agitação magnética constante, por 4
horas, sendo protegida da umidade por um tubo secante.
Decorrendo esse período o solvente foi removido por rotaevaporação e o
precipitado lavado sucessivamente com éter etílico (frações de 20 mL) com o
objetivo de purificarmos o produto formado, do excesso de anidrido empregado na
síntese.
43
O grau de pureza foi determinado por cromatografia em camada delgada
(CCD) utilizando sílica-gel GF254 eluido com tolueno/propanona/etanol (54:40:6) na
fase móvel, seguida de visualização em câmara escura com luz ultravioleta (λ= 365
nm), obtendo Rf de 0,3.
A CCD foi realizada em cuba específica aplicando sob a placa de sílica-gel
pequenas frações de Boldina solubilizada na solução eluente como padrão e a uma
distancia de 1 cm o produto da síntese, a uma altura de 0,5 cm do inicio da placa, foi
demarcada uma altura final na placa de 5 cm para a corrida cromatográfica. Iniciouse a corrida com o eluente na cuba em uma altura inferior à 0,5 cm. O termino se
deu quando o eluente atingiu a marca de 5 cm de altura na placa. Sendo retirada a
placa da cuba, seca à temperatura ambiente e lida em câmara escura.
O mesmo procedimento cromatográfico foi seguido com as alíquotas de éter
etílico da lavagem do precipitado, após não identificarmos outra mancha na CCD,
fora o padrão, o produto cristalizado foi caracterizado por RMN ¹H.
3.2.2. Síntese química da Maloil-boldina (Solvent-free)
Inicialmente o anidrido maleico (0,3 g - 3 mmol) em excesso foi fundido em um
banho de óleo a uma temperatura de 53 + 2 ºC sob agitação magnética constante
em balão de fundo redondo, acoplado a um condensador para evitar entrada de
umidade, assim toda a massa de anidrido passou para o estado líquido foi
adicionado no balão a boldina (0,1 g - 0,305 mmol) e mantida a agitação por 24
horas.
Posteriormente foi resfriado à temperatura ambiente, em dessecador, e os
cristais foram purificados através de lavagens sucessivas com éter etílico (frações
de 20 mL) com o auxílio de banho de ultrassom. O grau de pureza foi determinado
por CCD utilizando sílica-gel GF254 eluido com tolueno/propanona/etanol (54:40:6)
como fase móvel, seguida de visualização em câmara escura com luz ultravioleta
(λ= 365 nm), obtendo Rf de 0,15.
O mesmo procedimento cromatográfico descrito no item 3.2.1 foi seguido
para o produto desta síntese tanto para definir seu Rf quanto para acompanhamento
da purificação do precipitado, após não identificarmos outra mancha na CCD, fora o
padrão, o produto cristalizado foi caracterizado por RMN ¹H.
44
3.2.3. Síntese química da Palmitoil-boldina
Inicialmente o cloreto de palmitoíla (0,3 g – 1,090 mmol) em excesso foi solubilizado
em DMF sob agitação magnética constante em balão de fundo redondo, acoplado a
um condensador para evitar entrada de umidade, posteriormente foi adicionado no
balão a boldina (0,1 g - 0,305 mmol) e mantida a agitação por 24 horas.
Posteriormente foi removido o solvente por rotaevaporação e o precipitado
solubilizado em uma mistura de n-Hexano/Acetato de Etila (70:30) e submetido à
purificação em coluna cromatográfica com sílica-gel 60G 70~230 Mesh, e teve como
fase móvel a mistura de n-Hexano/Acetato de Etila (70:30).
O grau de pureza foi determinado por CCD utilizando sílica-gel GF254 eluido
com n-Hexano/Acetato de Etila (70:30) como fase móvel, seguida de visualização
em câmara escura com luz ultravioleta (λ= 365 nm), obtendo Rf de 0,7.
O procedimento para realização da CCD, seguiu os mesmos princípios
descritos no item 3.2.1 para o produto desta síntese tanto para definir seu Rf quanto
para a purificação e seu acompanhamento, após não identificarmos outra mancha
na CCD, fora o produto de interesse, o solvente foi rotaevaporado e o produto
cristalizado foi caracterizado por RMN ¹H.
3.3. Análise de Ressonância Magnética Nuclear (RMN 1H)
Os espectros de RMN
1
H foram realizados no Laboratório de Processos
Fotoinduzidos e Interfaces (LPFI) do Instituto de Química da Universidade de São
Paulo, utilizando espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear, modelo Varian
a 300 MHz. O solvente utilizado foi DMSO-d6, sendo posteriormente inspecionados
em software MestRe-c.
A técnica de RMN baseia-se na propriedade de alguns núcleos apresentarem
momentos magnéticos (spin) não nulos. O número quântico de spin I, está ligado ao
número de massa e atômico, os núcleos mais frequentemente estudados na RMN
são: 1H, 2H(D), 11B, 13C, 14N, 17O, 19F e 31P.
Ao submeter um núcleo a um campo magnético externo forte, o seu momento
magnético tende a se alinhar com o campo, havendo uma mudança de energia. O
núcleo não se alinha completamente com o campo, mas sofre o movimento de
precessão.
45
Para átomos com I=1/2, há dois números quânticos possíveis, +1/2 e -1/2 que
representam as duas orientações possíveis dos campos. Fazendo-se uma varredura
na frequência de radiação eletromagnética, aparecem transições em frequências
definidas, onde há absorção de energia, causada pela ressonância. Elas também
podem ser obtidas variando o campo magnético.
Ao aplicarmos uma frequência constante, nem todos os núcleos apresentam
ressonância no mesmo campo magnético. Se o núcleo é o próton, o valor onde a
ressonância aparece é diferente para cada próton, dependendo de seu ambiente
químico. No caso do Hidrogênio (1H) as variações do campo magnético estão na
ordem de até 15 ppm. O deslocamento químico (δ)1 é definido como a blindagem do
núcleo pelos elétrons dividido pelo campo aplicado, e é sempre medido a partir de
uma referência que neste método foi o tetrametilsilano (TMS).
1- δ = [(νalor da amostra – νalor da referência)/frequência do espectrômetro]x106
(ppm).
3.4. Análise da atividade antioxidante
As leituras de absorbância foram realizadas em Espectrofotômetro UV-Vis,
Shimadzu, modelo UV-1201, cubeta de quartzo com 1 cm de caminho óptico.
A partir de uma solução inicial de DPPH (60 µM), preparada dissolvendo 2,4
mg de DPPH em um balão volumétrico de 100 mL com álcool metílico,
homogeneizado com auxilio de banho ultrassom e transferido para um frasco de
vidro âmbar, limpo e seco para armazenamento, a solução foi preparada e utilizada
apenas no dia da análise.
Para construção da curva de calibração preparou-se soluções variando a
concentração de 10 µM a 50 µM, a partir da solução inicial em balões volumétricos
de 10 mL, obtendo-se as absorbâncias relativas a cada concentração em
comprimentos de onda (l) de 515 nm, utilizamos como branco álcool metílico, para
calibrar o espectrofotômetro.
Foram preparadas soluções com os produtos sintetizados a 2,5% (20 µM)
utilizando álcool metílico como solvente.
Na ausência de luz, transferiu-se uma alíquota de 0,1 mL da solução de cada
produto da síntese e da boldina para tubos de ensaio com 3,9 mL do radical DPPH
46
(60 µM) e homogeneizou-se em agitador de tubos. Utilizou-se 0,1 mL da solução
controle de álcool metílico com 3,9 mL do radical DPPH.
As leituras (515 nm) foram monitoradas a cada minuto, a fim de observarmos
a redução da absorbância até sua estabilização. A leitura da absorbância final para o
cálculo da quantidade de amostra necessária para reduzir em 50% a concentração
inicial do radical DPPH (EC50), foi feita após a estabilização da absorbância (tempo
EC50).
3.5. Análise estatística
Os ensaios apresentados neste trabalho foram realizados em triplicata e seus
resultados apresentados a partir da média de três repetições (n=3) com a
determinação do desvio padrão. Foram considerados estatisticamente diferentes os
resultados de atividade antioxidante que apresentaram probabilidade de ocorrência
de hipótese de nulidade menor que 5% (ρ < 0,05) aplicando-se o teste T de student.
Os cálculos e gráficos serão gerados com auxílio do software MS-Excel versão
2002.
47
4. RESULTADOS
4.1. Síntese e caracterização dos derivados da Boldina
4.1.1. Síntese e caracterização da Maloil-boldina
Os resultados colhidos nas cromatografias de camada delgada dispostos na tabela 3
demonstram a obtenção do produto pretendido pela reação ilustrada na figura 15.
Figura 15: Reação de síntese da Mono maloil-boldina.
Tabela 3: Resultado Rf nos diferentes meios de eluição.
Produto
Boldina
Maloil Boldina
Maloil Boldina Solvent-free
Palmitoil Boldina
Eluente 1 - tolueno/acetona/etanol (54:40:6)
Eluente 2 - n-Hexano/Acetato de Etila (70:30)
Eluente 1
Eluente 2
0,50
0,30
0,15
-
0,0
0,7
48
A primeira rota de reação para produção da Mono-maloil-boldina gerou os
resultados espectrais descritos na tabela 4 quando submetido a espectroscopia de
ressonância magnética nuclear de 1H, a atribuição desses resultados pode ser vista
na figura 16.
1
Tabela 4: Resultado Espectro de RMN H do produto da reação da maolil-boldina pela 1ª rota.
Próton
Deslocamento Químico (PPM)
Integral
NCH3 [18]
2,599
3,17
CH3 [20,26]*
3,783
3,03
CH [27,28]
6,081
2,01
CH [13]
6,634
1,00
CH [14]
6,787
1,00
CH [17]
7,666
1,00
OH [30]
9,414 / 9,566
0,56 /0,59
*Sinal encoberto pelo solvente em 3,5 ppm.
49
1
Figura 16: Espectro de RMN H do produto da primeira reação de síntese da Mono-maloil-boldina em
DMSO-d6, 300 MHz.
50
A segunda rota de síntese do derivado maloil-boldina (Figura 17), conta com
um sistema livre de solvente em que os reagentes foram solubilizados entre si após
serem fundidos.
Figura 17 Reação de síntese solvent-free da maloil boldina.
4.1.2. Síntese e caracterização da Palmitoil-boldina
A reação de síntese da palmitoil-boldina (Figura 18) foi efetiva conforme
demonstrada nos valores obtidos na CCD conforme tabela 3.
Figura 18: Reação de síntese da palmitoil boldina.
51
4.2. Capacidade antioxidante
O resultado da curva de calibração da solução metanólica de DPPH está ilustrado
na figura 19.
Figura 19: Curva de calibração do DPPH.
A figura 20 traz os resultados espectrofotométricos da triplicata realizada para
acompanhamento da reação entre a Boldina, em solução metanólica a 20 µM (2,5%)
e a solução de DPPH à 60 µM determinado a absorbância à 515 nm e seu desvio
padrão, esses dados foram obtidos à partir da tabela 5.
Os resultados referentes ao traço cinético do ao longo de 60 min. de
acompanhamento, e fragmentação para verificação das cinéticas da reação do 0 aos
8 min iniciais e dos 9 aos 25 min, estão dispostos respectivamente nas figuras 21,
22 e 23.
52
Tabela 5: Resultado da análise em triplicata da absorbância da solução metanólica de Boldina.
tempo
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
0
0,557
0,557
0,558
0,558
0,558
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,556
0,556
0,557
0,557
0,557
0,556
0,557
0,557
0,557
0,557
0,556
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
1
0,557
0,381
0,295
0,257
0,229
0,216
0,204
0,195
0,182
0,178
0,174
0,172
0,17
0,17
0,169
0,169
0,168
0,167
0,167
0,167
0,166
0,166
0,165
0,165
0,164
0,164
0,164
0,164
0,163
0,164
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
2
0,557
0,377
0,282
0,259
0,227
0,215
0,203
0,192
0,185
0,181
0,179
0,177
0,175
0,173
0,171
0,169
0,168
0,168
0,167
0,167
0,167
0,166
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
0,165
3
0,557
0,383
0,29
0,252
0,229
0,213
0,202
0,193
0,187
0,18
0,176
0,172
0,17
0,168
0,166
0,164
0,164
0,164
0,163
0,163
0,163
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
0,162
Média
0,557
0,380
0,289
0,256
0,228
0,215
0,203
0,193
0,185
0,180
0,176
0,174
0,172
0,170
0,169
0,167
0,167
0,166
0,166
0,166
0,165
0,165
0,164
0,164
0,164
0,164
0,164
0,164
0,163
0,164
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
0,163
Desvio Padrão
0,0000
0,0031
0,0066
0,0036
0,0012
0,0015
0,0010
0,0015
0,0025
0,0015
0,0025
0,0029
0,0029
0,0025
0,0025
0,0029
0,0023
0,0021
0,0023
0,0023
0,0021
0,0023
0,0017
0,0017
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
0,0015
53
Figura 20: Absorbância de DPPH com 2,5% de solução de boldina (padrão) em solução de DPPH
60mM em triplicata.
y = -0,0069x + 3,0797
R2 = 0,3129
4,30
4,10
Ln (Concentração mM)
3,90
3,70
3,50
3,30
3,10
2,90
2,70
2,50
0
10
20
30
40
Tempo (Minutos)
50
60
70
Boldina
Linear (Boldina)
Figura 21: Traço cinético da concentração media de DPPH com 2,5% de solução de boldina (padrão)
54
y = -0,1233x + 3,7634
R2 = 0,8485
4,3
4,1
Ln (Concentração mM)
3,9
3,7
K1= 0,1233 Min-1
3,5
3,3
3,1
2,9
2,7
2,5
0
1
2
3
4
5
6
Tempo (Minutos)
7
8
9
Boldina
Linear (Boldina)
Figura 22: Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de boldina (padrão) 8 min
iniciais.
2,90
y = -0,0055x + 2,9178
R2 = 0,8535
Ln (Concentração mM)
2,88
2,86
K2 = 0,0055 Min-1
2,84
2,82
2,80
2,78
7
9
11
13
15
17
Tempo (Minutos)
19
21
23
25
Boldina
Linear (Boldina)
Figura 23: Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de boldina (padrão) de 9 a
25 min.
55
A figura 24 traz os resultados espectrofotométricos da triplicata realizada para
acompanhamento da reação entre a Mono-maloil-boldina, em solução metanólica à
20 µM (2,5%) e a solução de DPPH à 60 µM determinado pela absorbância à 515
nm e seu desvio padrão, esses dados foram obtidos à partir da tabela 6.
Os resultados referentes ao traço cinético do ao longo de 60 min de
acompanhamento, e a fragmentação para verificação das cinéticas da reação do 0
aos 8 min iniciais e dos 9 aos 25 min, estão dispostos respectivamente nas figuras
25, 26 e 27.
O decaimento percentual do radical de DPPH ao longo dos sessenta minutos
de análise, após a introdução do antioxidante boldina comparativamente com o
derivado mono-maloil-boldina está disposto na figura 28.
0,6
Desvio Padrão Médio:
0,0085
0,5
ABS
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (Minutos)
1
2
3
Média Maloil Boldina
Figura 24: Absorbância de DPPH com 2,5% de solução de Mono-maloil-Boldina em solução de
DPPH 60mM em triplicata.
56
Tabela 6: Resultado da análise em triplicata da absorbância da solução metanólica de Mono-MaloilBoldina.
tempo
0
1
2
3
Média
Desvio Padrão
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
0,557
0,557
0,558
0,558
0,558
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,556
0,556
0,557
0,557
0,557
0,556
0,557
0,557
0,557
0,557
0,556
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,557
0,468
0,379
0,268
0,257
0,244
0,221
0,216
0,21
0,203
0,189
0,186
0,182
0,177
0,173
0,169
0,167
0,163
0,16
0,158
0,154
0,153
0,15
0,147
0,146
0,144
0,144
0,144
0,144
0,144
0,144
0,142
0,14
0,138
0,136
0,134
0,132
0,13
0,128
0,126
0,124
0,122
0,12
0,118
0,116
0,114
0,112
0,11
0,108
0,106
0,104
0,102
0,1
0,097
0,095
0,094
0,092
0,09
0,088
0,09
0,089
0,557
0,478
0,389
0,283
0,266
0,25
0,224
0,218
0,21
0,202
0,188
0,184
0,179
0,175
0,17
0,166
0,163
0,159
0,155
0,153
0,149
0,153
0,15
0,147
0,146
0,144
0,142
0,14
0,138
0,136
0,134
0,132
0,13
0,128
0,126
0,124
0,122
0,12
0,118
0,116
0,114
0,112
0,11
0,108
0,106
0,104
0,102
0,1
0,098
0,096
0,094
0,092
0,09
0,088
0,086
0,086
0,086
0,086
0,086
0,086
0,086
0,557
0,46
0,371
0,329
0,302
0,281
0,252
0,241
0,232
0,224
0,209
0,203
0,198
0,193
0,188
0,183
0,18
0,176
0,172
0,17
0,166
0,148
0,145
0,141
0,14
0,138
0,135
0,134
0,132
0,13
0,128
0,126
0,124
0,122
0,12
0,118
0,116
0,114
0,112
0,11
0,108
0,106
0,104
0,102
0,1
0,098
0,096
0,094
0,092
0,09
0,088
0,086
0,084
0,082
0,082
0,082
0,082
0,082
0,082
0,082
0,082
0,557
0,469
0,380
0,293
0,275
0,258
0,232
0,225
0,217
0,210
0,195
0,191
0,186
0,182
0,177
0,173
0,170
0,166
0,162
0,160
0,156
0,151
0,148
0,145
0,144
0,142
0,140
0,139
0,138
0,137
0,135
0,133
0,131
0,129
0,127
0,125
0,123
0,121
0,119
0,117
0,115
0,113
0,111
0,109
0,107
0,105
0,103
0,101
0,099
0,097
0,095
0,093
0,091
0,089
0,088
0,087
0,087
0,086
0,085
0,086
0,086
0,0000
0,0090
0,0090
0,0318
0,0238
0,0199
0,0171
0,0139
0,0127
0,0124
0,0118
0,0104
0,0102
0,0099
0,0096
0,0091
0,0089
0,0089
0,0087
0,0087
0,0087
0,0029
0,0029
0,0035
0,0035
0,0035
0,0047
0,0050
0,0060
0,0070
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0081
0,0075
0,0067
0,0061
0,0050
0,0040
0,0031
0,0040
0,0035
57
4,50
y = -0,0225x + 3,3303
R2 = 0,8708
Ln (Concentração mM)
4,00
3,50
3,00
2,50
2,00
0
10
20
30
40
50
Tempo (minutos)
60
70
Maloil-Boldina
Linear (Maloil-Boldina)
Figura 25: Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de Mono-maloil-boldina
em triplicata.
4,30
y = -0,1189x + 3,9073
R2 = 0,9109
Ln (Concentração mM)
4,10
3,90
3,70
K1 = 0,1189 Min-1
3,50
3,30
3,10
2,90
2,70
0
1
2
3
4
Tempo (Minutos)
5
6
7
8
9
Maloil-Boldina
Linear (Maloil-Boldina)
Figura 26: Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de Mono-maloil-boldina 8
minutos iniciais.
58
3,20
y = -0,0173x + 3,1197
R2 = 0,9923
Ln (Concentração mM)
3,00
2,80
K2 = 0,0173 Min-1
2,60
2,40
2,20
2,00
0
10
20
30
40
Tempo (Minuto)
50
60
70
Maloil-Boldina
Linear (Maloil-Boldina)
Figura 27: Traço cinético da concentração de DPPH com 2,5% de solução de Mono-maloil- boldina
de 9 a 60 min.
120%
P=3,3373.10-5
% DPPH Remanescente
100%
80%
60%
40%
20%
0%
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (minutos)
Boldina
Maloil-Boldina
Figura 28: Decaimento comparativo do % DPPH remanescente frente a solução de Boldina e Monomaloi-Boldina a 20 mM após 60 min.
59
4.3. Relação estrutura-atividade antioxidante
A partir dos dados estruturais de diferentes grupos aporfinicos, foi realizada através
da sobreposição estrutural a definição de um grupamento mínimo para atividade
antioxidante (grupo farmacofórico) conforme descrito na figura 29 ao protótipo.
N
H
Grupo Aporfinico
OH
O
O
CH3
O
HO
O
O
H3C
HO
HO
N
CH3
1
HO
H3C
NH
HO
H3C
N
N
O
3
5
O
H3C
N
O
CH3
O
N
HO
CH3
HO
HO
H3C
HO
2
4
H3C
H3C
6
O
CH3
O
O
O
H3C
O
N
7
CH3
Figura 29: Compostos aporfínicos fenólicos e não fenólicos utilizados nos estudos da relação
estrutura–atividade antioxidante: boldina [1], clocaurina [2], glaucina [3], norarmepavina [4], aporfina
[5], reticulina [6] e grupo farmacofórico [7].
60
5. DISCUSSÃO
5.1. Síntese e caracterização dos derivados da Boldina
O planejamento para construção dos derivados da boldina, parte das alterações de
suas propriedades físico-químicas, com ênfase em seu coeficiente de partição,
utilizando como ferramenta a substituição do grupo hidroxila ligado aos anéis
aromáticos, por derivados estruturais mais hidrofílicos (carboxilas) presentes no
anidrido maleico e outros mais lipofílicos (cadeias longas saturadas) proveniente do
cloreto de palmitoíla, conforme observado na figura 30.
HO
O
O
O
O
O
O
DMF
HO
O
O
N
O
O
H id ro fílic o
O
HO
OH
O
O
O
O
O
HO
∆ 53 + 2 °C
N
O
HO
O
O
O
O
24 horas
O
N
O
O
CH3
CH3
O
O
DMF
O
O
O
L ip o fílic o
O
N
Cl
O
Figura 30: Planejamento da síntese de derivados hidro e lipofílicos da Boldina.
CH3
61
5.1.1. Síntese e caracterização da Maloil-boldina
As etapas para produção do análogo mono maloil-boldina (Figura 15), envolve um
ataque nucleofílico das hidroxilas fenólicas presentes na boldina pela carboxila do
anidrido
maleico,
promovendo
a
cisão
da
carbonila,
com
seu
posterior
restabelecimento e ruptura da ligação anidra e formação da carboxila, conforme está
descrita na figura 31.
Figura 31: Mecanismo de reação de produção da maloil-boldina a partir do anidrido maleico [2] e
boldina [1].
Como demonstrado acima as hidroxilas livres em anéis diferentes permitem a
substituição em ambas as unidades, tendo como produto mais comum neste tipo de
reação a bissubstituição das hidroxilas, tendo em vista a alta reatividade dos álcoois
frente aos anidridos devido a diferença de acidez entre o hidrogênio da carboxila e o
da hidroxila alcoólica.
Essa alta reatividade é justificada por dois mecanismos principais:
a- Baseados no efeito de ressonância: onde é promovida uma maior estabilização
por ressonância do íon carboxilato, devido o íon poder ser representado por duas
estruturas de ressonância de estabilidades iguais, diminuindo assim a energia
62
livre do íon tornando-o mais ácido. Efeito esse que não é observado nos álcoois
alifáticos o que justifica a baixa acidez destes compostos.
b- Baseados no efeito indutivo: dado ao diferencial de eletronegatividade entre o
oxigênio e hidrogênio das hidroxilas, em ambos os compostos observaríamos um
comportamento similar quanto sua acidez. A chave para explicação da maior
acidez dos ácidos carboxílicos está no efeito induzido de atração dos elétrons da
hidroxila exercido pela presença da carbonila, permitindo a formação de uma
carga positiva mais forte no carbono da carbonila, justificando assim o mecanismo
descrito na figura 31.
Porém a mono substituição da hidroxila alcoólica pode ser justificada pela
presença do efeito de ressonância entre os elétrons do oxigênio e o anel aromático,
conforme a teoria dos efeitos de ressonância, fazendo com que, a hidroxila se torne
mais ácida, e o ataque à carboxila não ocorra, tendo em vista que o solvente e
reagentes utilizados para essa síntese não permitem solvólise.
As diferenças nos Rf do padrão (boldina) e dos produtos da reação
demonstram uma maior afinidade desses produtos pela sílica-gel, caracterizando o
caráter polar desses compostos, uma vez que a eluição foi realizada com solventes
de baixa polaridade, conforme observado na tabela 1.
Os resultados da espectroscopia corroboram com os encontrados para
elucidação estrutural de outros análogos da boldina (THOMET et al., 2011), com a
presença de dois singletos correspondente a dois grupos metóxi em torno de 3,12 à
3,88 ppm, observa-se na figura 16 a atribuição dos grupos metoxilas o achado em
3,78 ppm, corresponde aos três hidrogênios do carbono 26 e um pico de igual
intensidade, com deslocamento menor porém não identificado dado à interferência
do solvente, caracteriza um descolamento mais baixo por estar mais blindado pelo
efeito anisotrópico gerado pelo anel nitrogenado, o que nos permite atribuí-lo ao
carbono 20 (SULZBACH; SCHLEYER; SCHAEFER, 1994).
Três singletos, representando três prótons aromáticos podem ser atribuídos
da seguinte forma: 7,86 ppm para o hidrogênio do anel aromático localizado no
carbono 17, 6,78 ppm para o hidrogênio do carbono 14 e 6,63 ppm para o
hidrogênio do carbono 13, o que está de acordo com outros achados de hidrogênios
aromáticos em anéis substituídos por grupos hidroxilas em posição orto (MADRID
VILLEGAS et al., 2011).
63
O N-metil que está em ressonância com o anel aromático mais próximo (anel
C), tem seus hidrogênios representados pelo singleto em 2,59 ppm, dados
espectrais mostram que podemos localizar os hidrogênios do grupo entre 2,35 e
2,65 ppm, devido a variáveis como o solvente empregado (ALIAS et al., 2010).
O multipletos da região de 2,8 a 3,4 ppm estão encobertos pelo sinal do
solvente, porém segundo as referencias demonstrariam um par de dupletos
apareceu em 3,4 ppm, que atribuiria-se ao hidrogênio do carbono 2, observaríamos
também, três dupletos de dupletos em aproximadamente 2,7 e 2,8 ppm, que seriam
atribuídos respectivamente aos hidrogênios dos carbonos 3, 6 e 7. Além disso, outro
hidrogênio, o do carbono 8 ressoado em torno de 2,5 como um dupleto de tripletos
teve seu sinal acoplado em 2,59 ao do N-metila (NAFIAH et al., 2011).
Os demais sinais apontam para a substituição feita no grupo aporfinico, a
presença do singleto em 6,081 ppm, está atribuído aos dois hidrogênios dos
carbonos 26 e 27 do grupo maloil, tendo em vista que tais hidrogênios são vistos
frequentemente entre 6,0 e 6,2 ppm, a proporção representada é indicativo de uma
mono substituição da hidroxila fenólica presente na boldina (GADAPE; PARIKH,
2011), confirmando com a quebra do sinal em 9,5 ppm correspondente a carboxila,
nos fazendo supor a presença de dois isômeros de posição conforme descrito na
figura 16.
A segunda rota de síntese do derivado maloil-boldina (Figura 17), conta com
um sistema livre de solvente em que os reagentes foram solubilizados entre si após
serem fundidos.
O mecanismo reacional conta com as mesmas etapas descritas na figura 31,
porém neste sistema a reação tende a ser mais lenta, contando com a manutenção
de um equilíbrio entre os reagentes e o produto formado, sendo assim justificado o
excesso de anidrido maleico na síntese para deslocar o equilíbrio a uma maior
formação de produtos.
Dado ao aquecimento para fusão dos compostos, a reatividade das hidroxilas
poderá ser alterada, visto que o aumento da temperatura favorece o mecanismo de
reação por aumentar a energia cinética no sistema e desta forma facilitar a formação
do complexo ativado, o que levaria a bissubstituição dos anéis. Os dados de CCD
mostram a formação de um produto mais hidrofílico (Rf = 0,15), o que se justificaria
pela introdução da outra carboxila à estrutura.
64
O produto maloil boldina obtido pela segunda rota de reação encontrasse em
fase elucidação estrutural e seus dados ainda não estão disponíveis.
5.1.2. Síntese e caracterização da Palmitoil-boldina
A síntese da palmitoil-boldina teve seu mecanismo baseado em uma substituição
nucleofílica unimolecular (SN1), em que inicialmente ocorre a ionização do cloreto
de palmitoíla, formando o carbocátion que posteriormente recebe os elétrons da
hidroxila fenólica, conforme descrito na figura 32.
Figura 32: Mecanismo de reação de produção da palmitoil-boldina a partir do cloreto de palmitoíla [2]
e boldina [1].
Conforme observado na tabela 1 o produto gerado por essa substituição
apresenta uma alta lipofilicidade, tendo maior afinidade pelo solvente da eluição,
todavia o processo de separação e purificação dos produtos formados nesta reação
não obteve pureza suficiente para promovermos a caracterização estrutural. Tal
impureza apresenta como prováveis causas a interação de partes dos reagentes aos
produtos ou solvente da cromatografia por ligações de hidrogênio, baixa efetividade
da fase móvel ou relação ineficiente entre os solventes do eluente.
65
5.2. Capacidade antioxidante
O comportamento cinético da boldina em suprimir o radical livre do DPPH foi
estimado quantitativamente a partir da curva de calibração obtida por diferentes
concentrações de DPPH, neste trabalho pode ser encontrado na figura 19, que foi
realizado empregando valores de absorbância que se mantiveram abaixo de 1,0 e
superior à 0,1 com uma linearidade de 0,997, mostrando um fator baixo de erro
(BLOIS, 1958).
O radical livre DPPH é um cromóforo extremamente estável que apresenta
um pico de absorção no comprimento de onda de 515 nm em meio metanólico e sua
solução possui uma coloração violeta intensa, essa coloração da solução de DPPH
em contato com as amostras em testes passa desta coloração para amarela. A
intensidade da cor varia de acordo com a concentração de DPPH radicalar no meio,
conforme reação geral da figura 33 (ARNAO, 2000; BLOIS, 1958).
Figura 33: Reação geral entre o radical DPPH e substratos orgânicos (R).
O comprimento de onda máximo utilizado para as medições de absorbância
já descritos são de 515 nm (GOMEZ-ALONSO et al., 2003; LEBEAU et al., 2000),
516 nm (SCHWARZ et al., 2001), 517 nm (LU; FOO, 2000; ZHU et al., 2002), 518
nm (LEITÃO; LEITÃO; VILEGAS, 2002) e 520 nm (KIM et al., 2002), portanto para
excussão deste trabalho optamos por uma comprimento de 515 nm e como solvente
para solução estoque do DPPH metanol.
Posteriormente foram realizados os ensaios com o padrão antioxidante, neste
trabalho utilizamos a boldina, para verificarmos a cinética de inibição antioxidante,
66
velocidade da reação e a concentração capaz de reduzir em 50% a concentração
inicial de DPPH (EC50) (SANCHEZ-MORENO; LARRAURI; SAURA-CALIXTO,
1998).
A cinética da boldina obtida no estudo é observada na figura 20, o “plateau”
de absorbância foi identificado em torno dos 25 min, com um desvio padrão médio
de 0,0018, demonstrando robustez aos valores determinados. Os dados predizem
um comportamento cinético antioxidante intermediário para a boldina, o que
corrobora com os resultados encontrados na literatura (PÉREZ-JIMÉNEZ et al.,
2008).
Podem ocorrer três tipos de comportamento cinético entre compostos com
atividade antioxidante: substâncias que reagem rapidamente com o DPPH,
chegando ao final da reação em menos de um minuto (cinética rápida); substâncias
que finalizam a reação em até 30 min (cinética intermediária) e substâncias de
cinética lenta que demoram mais de uma hora para completar a reação (cinética
lenta) (BRAND-WILLIAMS; CUVELIER; BERSET, 1995).
O tempo de reação de 30 min é sugerido na maior parte dos ensaios (KIM et
al., 2002). No entanto, como a reação pode apresentar tempos menores em torno de
5 a 10 min (LEBEAU et al., 2000; SCHWARZ et al., 2001), fazendo com que a taxa
de reação varie muito entre os substratos (BONDET; BRAND-WILLIAMS; BERSET,
1997), optamos em seguir a reação até sua conclusão, identificando esse momento
através da formação de um “plateau" na sua absorbância (LU; FOO 2000; YEPEZ et
al., 2002).
Estudos cinéticos das reações entre grupos aporfinas e oxigênio singlete
sugerem que um complexo de transferência de carga formada inicialmente entre o
anel aromático e radical livre e posteriormente, esse complexo, pode transferir o
elétron, retornando o oxigênio singlete e os alcalóides aporfinicos ao estado
fundamental ou prosseguir para produtos não descritos (ZANOCCO; LEMP;
GÜNTER, 1997).
Quando utilizado o radical DPPH, existem duas principais formas de alcançar
a estabilização dos radicais livres entre a boldina e o DPPH. A primeira é através da
formação de uma ligação covalente entre um hidrogênio frágil com o segundo átomo
de nitrogênio do DPPH e a segunda é responsável pela formação do complexo
descrito anteriormente. No primeiro caso, é necessário que a molécula da boldina
desloque o radical livre gerado na reação.
67
A boldina por possuir dois grupos fenólicos com átomos de hidrogênio lábil
com a capacidade de gerar cargas negativas resultantes da captação de cada
hidrogênio, pode estabilizar essas cargas através dos anéis aromáticos adjacentes,
sendo este mecanismo o que sustenta a atividade anti-radicalar da boldina frente ao
DPPH. Pois a interação direta do DPPH com os grupos fenólicos mostra uma alta
taxa de reação e consequentemente refletindo a alta atividade antioxidante. Estudos
anteriores têm mostrado que os grupos fenólicos nos anéis aromáticos influenciam
fortemente a atividade anti-radicalar de substâncias polifenólicas (GÓMEZ-ALONSO,
et al., 2003).
Para determinação da velocidade da reação entre a boldina e o DPPH foram
avaliadas as curvas cinéticas da concentração em relação ao tempo indicando um
comportamento de primeira ordem, e através do coeficiente angular obtido da
equação calculada a partir reta média determinou-se por tanto o valor de “a” com a
constante da velocidade “k”.
A figura 21 foi gerada utilizando os valores da média das absorbâncias em
cada ponto de medição da reação entre boldina e DPPH, e calculado o valor da
concentração através da equação da reta gerada na figura 19, conforme abaixo:
Ln ([mM de DPPH radicalar]) = (Absorbância – 0,0027) / 0,0098
(Equação 3)
Os resultados demonstram uma baixa linearidade como resultado da reta
(R² = 0,3219), isso se justifica dada a existência de duas velocidades de reações,
uma nos primeiros 8 min, onde mais de 67% da reação ocorre. Para atingir o final da
reação, foi necessário medir de forma contínua até 25 min. A constante da
velocidade de reação “k1” na primeira etapa está relacionada com a facilidade da
boldina em interagir com DPPH, enquanto que a amplitude da curva está
relacionada com a eficiência da interação, conforme elucidado nos gráficos 4 e 5.
A constante k1 foi obtida através da seleção dos dados relativos ao curto
tempo, 8 primeiros minutos da reação, resultando em uma linearidade mais
expressiva de 0,8485, com um valor de k1 igual à 0,1233 Min-1 (Figura 22) enquanto
que a constante k2 obtido pelos dados da concentração de DPPH dos 9 min iniciais
de leitura até a estabilização aos 25 min (Figura 23) relacionados ao longo tempo
forneceram uma linearidade semelhante para o traço da reta média 0,8535 com um
valor de k2 igual à 0,0055 Min-1.
68
Estes resultados evidenciam que a constante cinética calculada no curto
período de tempo está relacionada com a eficiência da reação, já a constante no
tempo longo (k2) está relacionada com a constante de difusão das moléculas no
solvente, sendo que este resultado está de acordo com o observado em estudos
anteriores (RACKOVÁ, 2004).
Quando aplicado a mesma análise á mono-maloil-boldina observou-se que
esta apresentou cinética diferente da encontrada para a boldina, a determinação da
velocidade da reação entre a mono-maloil-boldina e o DPPH foi avaliado indicando
um comportamento de primeira ordem, e a exemplo da boldina, através do
coeficiente angular obtido da equação calculada da reta média definiu-se o valor de
“a” como a constante da velocidade “k” conforme observado na figura 24.
Os resultados demonstram um resultado de linearidade mais robusto que o
encontrado para a boldina com valor da regressão linear (R²) de 0,8708, isso se
justifica dado uma cinética mais constante e coerente com um comportamento
cinético de primeira ordem (Figura 25).
Entre tanto é notável da mesma forma que a boldina, a existência de duas
velocidades de reações, dessa maneira traçou-se uma reta média para os primeiros
8 min, onde mais de 61% da reação ocorre. Para atingir o final da reação, foi
necessário medir de forma contínua até 60 min. Atribuindo-se a constante da
velocidade de reação “k1” na primeira etapa, a facilidade da interação da molécula
com o DPPH , enquanto que a amplitude da curva está relacionada com a eficiência
da interação, conforme visto nas figuras 26 e 27.
A constante k1 foi obtida através da seleção dos dados relativos ao curto
tempo, 8 primeiros minutos da reação, resultando em uma linearidade mais
expressiva de 0,9109, com um valor de k1 igual à 0,1189 Min-1 (Figura 26) enquanto
que a constante k2 obtida pelos dados da concentração de DPPH dos 9 min iniciais
de leitura até a estabilização aos 60 min relacionados ao longo tempo forneceram
uma linearidade semelhante para o traço da reta média 0,9923 com um valor de k2
igual à 0,0173 Min-1.
Portanto considerando que as constantes cinéticas calculada no curto período
de tempo estão relacionadas com a eficiência da reação, a reação entre o padrão
(boldina)
e
o
análogo
(mono-maloil-boldina)
não
apresentaram
diferenças
significativas entre elas, fazendo-nos compreender que o análogo não sofreu
alterações permanentes nos grupos químicos responsáveis pela atividade ou
69
favorecimento da atividade anti-oxidante, o que se assemelha ao comportamento de
diferentes estruturas do mesmo grupo aporfinico quando ensaiado sua relação
estrutura-atividade.
Já a constante no tempo longo (k2) mostrou um aumento na velocidade da
reação em mais de 300% sendo de 0,0055 Min-1 para 0,0173 Min-1, entre a boldina e
o análogo mono-maloil-boldina respectivamente, tomando a relação entre a
velocidade de longo prazo com a constante de difusão das moléculas no solvente,
tais resultados levam a crer que a alteração estrutural promovida no análogo da
boldina gerou uma maior interação entre a molécula e o solvente reacional.
Para compararmos o comportamento cinético na diminuição do DPPH
remanescente para cada um dos compostos plotamos no gráfico 10 os resultados
obtidos experimentalmente após definição da concentração de DPPH em cada ponto
de leitura, utilizando para isso a seguinte equação baseada na reta de calibração
(Figura 19) e sua regressão linear:
A515nm = 0,0098.[DPPH*]T+0,0027
Onde A515nm, corresponde ao valor da absorbância medida a 515 nm em um
tempo zero e [DPPH*]T, corresponde ao valor da concentração em mM de DPPH
radicalar no ponto de leitura. A partir dos dados obtidos das absorbâncias coletadas
durante o experimento, foi determinado o percentual de DPPH radicalar
remanescente (%DPPH*REM) utilizando a razão entre a concentração em mM de
DPPH radicalar no ponto de leitura ([DPPH*]T) pela concentração em mM de DPPH
radicalar no momento inicial ([DPPH*]T0) através da equação abaixo:
%DPPH*REM = [DPPH*]T / [DPPH*]T0
A atividade antioxidante do análogo (mono-maloil-boldina) demonstrou-se
superior ao protótipo (boldina), uma vez que a estabilização da leitura se deu com
um percentual final de DPPH remanescente de 15% enquanto a boldina estabilizou
sua leitura em 29%, esses dados foram submetidos à análise estatística teste-T
Student e demonstraram significância (P< 0,05).
Tal diferença pode-se justificar pelo mecanismo de interação entre a molécula
do análogo e o radical DPPH. O mecanismo de reação do DPPH é baseado em
transferência de elétrons, enquanto a abstração de átomo de hidrogênio é uma
70
reação periférica, pois a mesma acontece lentamente em solventes que
estabelecem fortes ligações de hidrogênio, sendo assim assume-se o feito do
solvente sobre a mecanística da reação com a maloil-boldina, pois o hidrogênio da
carboxila fica livre para promover tais ligações com o solvente, mesmo a hidroxila
fenólica da boldina estando esterificada e, portanto não sendo inicialmente envolvida
na reação.
Outro fator já discutido é a participação do hidrogênio ligado ao carbono alfa
ao grupo amina com potencial redutor, na molécula do análogo tal hidrogênio
encontra-se livre para reação com o radical DPPH, reação essa que se iniciaria com
a homólise da ligação covalente com o carbono, gerando um radical no anel D da
estrutura, sendo posteriormente estabilizado pelo efeito de ressonância do anel
aromático C (Figura 9) e o par de elétrons emparelhados do nitrogênio terciário
(CASSELS; ASENCIO; CONGET, 1995).
A presença de uma insaturação no grupo maloil adicionado a molécula, pode
também ter contribuído para o aumento da sua atividade antioxidante, isso se daria
pela homólise da ligação pi gerando um radical, cuja estabilização seria promovida
pelo par de elétrons das carboxilas adjacentes à insaturação, formando assim uma
nova estrutura de ressonância, muito similar ao observado em moléculas
polinsaturadas como os carotenóides e ácidos graxos polinsaturados (HIRAYAMA et
al., 1994). Esse mecanismo ocorre através da transferência de elétrons, podendo
ser um processo químico ou físico, sendo esse processo físico, a energia recebida
pela insaturação é dispersada através de interações vibracionais e rotacionais com o
solvente, recuperando assim o estado fundamental da insaturação, não gerando
degradação do produto (Figura 22) (STAHL; SIES, 1993), o que tornaria essa
interação menos provável, tendo em vista que o plateau de absorbância foi
encontrado antes do DPPH remanescente chegar a zero.
Tendo em vista que a ligação éster utilizada para formação do análogo é
hidrolisada na presença da água, dependendo do pH ou por reação enzimática, a
reconstituição da hidroxila fenólica seguiria uma cinética independente, o que
promoveria mais uma região na molécula para geração de um hidrogênio labil
(Figura 35), e consequente aumento de seu efeito antioxidante (Figura 34).
71
H
H
H
O
O
H
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
H
H
N
O
O
O
O
O
O
H
O
H
O
H
N
H
H
+
O
N
H
O
O
O
H
H
O
N
H
H
Figura 34: Modificação molecular e regiões de estabilização do radical.
A abstração do radical maloil do análogo estudado pode ser definida pelo
esquema a seguir:
Figura 35: Mecanismo para estabilização do radical maloil do protótipo.
5.3. Relação estrutura-atividade antioxidante
Boldina é um alcalóide difenólico em que cada função fenol está um tanto protegido
por um grupo orto-metoxi, uma característica estrutural que é normalmente
associada com propriedades antioxidantes. Porém em estudos de peroxidação
lipídica microssomal induzido quimicamente (Fe+2-cisteína), verificou-se que a
coclaurine e outras apomorfina catecólicas são antioxidantes muito mais potentes do
72
que a boldina, no mesmo ensaio, a glaucina, também contendo duas porções de
orto-metoxifenol, e a norarmepavine, incorporando um grupo igual, demonstraram
inibição da peroxidação em concentrações um pouco mais baixas do que a boldina.
No entanto, a reticulina, um alcalóide benzilisoquinolina que, como boldina
contém dois grupos orto-metoxifenol, exibiu pouca atividade protetora. Por outro
lado, o alcalóide não fenólico glaucina foi apenas ligeiramente menos potente do que
a boldina como antioxidante. Sugerindo assim, que o efeito antioxidante da glaucina
pode estar relacionado com as propriedades químicas do grupo aporfina, que podem
ser prontamente oxidados para dehidroaporfina ou oxiaporfinico (Figura 36).
Figura 36: Compostos aporfínicos dehidroaporfina [1] e oxiaporfina [2].
Outro destaque está na relação entre N-metilação de glaucina que quando na
forma de quaternário de amônio reduziu o seu efeito antioxidante em dois terços.
Este resultado sugere que um átomo de hidrogênio vizinho de um par de elétrons
desemparelhado de um nitrogênio benzílico pode ser a chave para o efeito protetor
das aporfinas não fenólicas. (MARTÍNEZ et al., 1992).
Desta forma as alterações propostas nas reações de síntese da maloilboldina mostram não alterar de modo irreversível quaisquer dos grupos
responsáveis pela atividade antioxidante da estrutura da boldina, por exclusão dos
grupos referenciados nos estudos da relação estrutura-atividade dos alcalóides
aporfinicos, chegamos a um grupo farmacofórico (Figura 29) que foi preservado
durante a síntese.
73
6. CONCLUSÃO
De acordo com o exposto anteriormente é possível concluir que:
a) Foi possível promover a síntese através da reação entre o anidrido maleíco e a
boldina em DMF produzindo um derivado hidrofílico, mono substituído através de
uma reação de esterificação com uma das hidroxilas fenólicas, com a presença
de isômeros de posição;
b) Houve um efetivo aumento de atividade antioxidante frente ao método de
absorção de radicais de DPPH, entre o análogo e o protótipo, bem como foi
possível traçar o comportamento cinético desta reação;
c) Foi possível através dos estudos da literatura definir o grupo farmacofórico
responsável pela atividade antioxidante dos compostos aporfínicos, a fim de
orientar as substituições para planejamento de seus análogos, bem como definir a
relação estrutura-atividade antioxidante para esse grupo.
PERSPECTIVAS
Pretende-se otimizar o processo de purificação da palmitoil-boldina, com o objetivo
de solucionar os problemas apontados na discussão, e posteriormente realizar a
caracterização estrutural deste composto.
Após da caracterização estrutural destes compostos realizar os ensaios de
atividade antioxidante, através da redução do radical DPPH para determinar a
cinética do derivado lipofílico.
As perspectivas para trabalhos posteriores envolvem a avaliação biológica in
vitro e in vivo da atividade destes compostos, bem como elucidar sua
farmacocinética, farmacodinâmica e posologia para futuras aplicações clínicas.
74
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