“Exposição à hiperoxia leva à morte
celular no desenvolvimento cerebral”
Hyperoxic exposure leads to cell death in the developing brain
Uluc Yis a,*, Semra Hız Kurul a,
Abdullah Kumral b, Serap Cilaker c,
Kazım Tug˘yan c, Sermin Genc d, Osman Yılmaz e
Brain & Development 2008 Oct ;30 (9):
556–562
Realizado por: Ana Graziela S. Antón1; Eduardo Carrari1; Rodolfo Bregion1.
Coordenação: Paulo R. Margotto
. www.paulomargotto.com.br
1
Ddos curso de medicina da Escola Superior de Ciências da Saúde – ESCS.
Obrigado!
Dr. Paulo R. Margotto, Ddo Eduardo, Dda Ana e Ddo Rodolfo
25-10-2008
Introdução
• Evidências: prematuros apresentam elevada prevalência de
comprometimento cognitivo e motor devido a encefalopatia
hipóxico-isquêmica, hemorragia intracerebral, infarto
cerebral.
• Mas: uso de concentrações supra-fisiológicas de O2 em
UTINeo (ressuscitação, desconforto respiratório...)
 altas concentrações de O2 exercem efeitos tóxicos;
prematuros possuem menos antioxidantes
enzimáticos;
• Hiperoxia: fator de risco aditivo para morte neuronal em RN
que apresentaram asfixia intraparto;
• Poucos estudos analisaram os efeitos da hiperoxia no
desenvolvimento cerebral.
Objetivo
• “investigar os efeitos da hiperoxia em
diferentes regiões do desenvolvimento
cerebral”.
Materiais e métodos
• Modelo animal:
– Em conformidade com as orientações do Laboratório Animal
Experimental e aprovado pelo Comitê de Uso e Cuidados Animal do
Dokuz Eylul University School of Medicine;
– Filhotes de ratos Wistar (IG semelhante) em 2 grupos acompanhados do
nascimento ao 5º dia pós-natal P(5):
caso (n=8): expostos, em câmara, a 80% de O2, com concentração do
O2 controlada 2x/dia, umidade mantida a 80% e CO2 removido;
controle (n=8): mantidos em local com ar ambiente (21% O2);
– Mães trocadas a cada 24h (prevenção de dist. respiratório no adulto);
– Determinação da concentração sanguínea de O2 : coleta em cavidade
cardíaca esquerda (sob anestesia);
– Em P(5): sacrifício dos animais animais pesados, anestesiados com
éter e tecidos cerebrais coletados.
– Desenvolvimento cerebral desses ratos (nesta idade pós-natal) é
semelhante ao de um RN nascido com ± 24 sem de gestação.
Materiais e métodos
• Avaliação histopatológica:
– Realizada por investigador “cego” em relação
ao estudo;
– Animais perfundidos por formalina, tecidos
fixados em formol, processados em blocos de
parafina, cortados em 6µm e corados com
cresilo violeta;
– Imagens analisadas em microscópio
equipado com câmera de vídeo, computador
e software (padronizados).
Materiais e métodos
• Estimativa do hipocampo, córtex préfrontal, córtex parietal, subiculum e córtex
retrosplenial :
– Estimativa das áreas cerebrais em toda as
amostras (de acordo com Mouse Brain Atlas);
– Densidade/contagem de neurônios
determinadas com uso de software;
– Procedimentos realizados às cegas.
Materiais e métodos
• Detecção de morte celular in situ :
– Detecção de fragmentação de DNA com “deoxynucleotidyl
transferase-mediated dUTP nick endlabeling (TUNEL)”;
• Morte celular detectada por ELISA:
– Para detecção de fragmentação de DNA;
– Técnica utilizada para detecção específica de fração citoplasmática
de tecido cerebral;
• Peso dos cérebros:
– Após removido da cavidade craniana, encéfalos pesados em
balança com sensibilidade de 0,0001g;
• Análise estatística:
– Valores apresentados como média ±SEM;
– Comparações: teste Mann-Whitney U;
– p<0,05: estatisticamente significativo.
Resultados
• Avaliação de pesos corporais e gasometria
sanguínea:
– Média do peso corporal: sem diferença estatística
(12.14 ± 0.69 vs 12.57 ± 0.53; P = 0.318);
– PaO2 arterial: 82 ± 2 mm Hg nas crias expostas a
21% O2 e 324 ± 18 mm Hg naquelas expostas a
80% O2 (n = 2 por grupo);
Resultados
• Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:
– TUNEL: revelou típicas características morfológicas de
apoptose (condensação de cromatina e corpos
apoptóticos);
– Seguem tabelas e figuras.
Resultados
• Efeitos da densidade neuronal em hiperoxia:
Fig. 1: efeitos da hiperoxia na densidade
Fig. 2: efeitos da hiperoxia na densidade
neuronal e TUNEL na região CA1 do
hipocampo. Ampliações de secção coronal
de CA1 tecidos cerebrais de ratos do grupo
controle (A) e grupo de hiperoxia (B),
coradas com cresilo violeta. A densidade
neuronal é significativamente menor no
grupo de hiperoxia. (C) Resultados de
TUNEL imunorreatividade no grupo
controle. TUNEL células positivas reforçada
no grupo de hiperoxia (D)
(setas).
neuronal e TUNEL no córtex pré-frontal.
Ampliações de secção coronal partir do
córtex pré-frontal tecidos cerebrais de ratos
do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia
(B), coradas com cresilo violeta. A
densidade neuronal é significativamente
menor no grupo de hiperoxia. (C)
Resultados de TUNEL imunorreatividade no
grupo controle. TUNEL células positivas
significativamente reforçada no grupo de
hiperoxia (D).
Fig. 3: efeitos da hiperoxia na densidade
neuronal e TUNEL no córtex parietal.
Ampliações de secção coronal de córtex
parietal dos
tecidos cerebrais dos ratos do grupo
controle (A) e grupo de hiperoxia (B),
coradas com cresilo violeta. A densidade
neuronal é significativamente menor no
grupo de hiperoxia. (C e D) Resultados
de TUNEL imunorreatividade no grupo
controle. TUNEL células positivas
reforçada no grupo hiperoxia (E e F).
Fig. 4: efeitos da hiperoxia na densidade
Fig. 5: efeitos da hiperoxia na densidade
neuronal e TUNEL no subiculum.
Ampliações de secção coronal de córtex
parietal tecidos cerebrais de ratos do grupo
controle (A) e grupo de hiperoxia (B),
coradas com cresilo violeta. A densidade
neuronal é significativamente menor no
grupo de hiperoxia. (C) Resultados de
TUNEL imunorreatividade no grupo
controle. TUNEL células positivas
reforçada no grupo de hiperoxia
(D).
neuronal e TUNEL no córtex retrosplenial.
Ampliações da secção coronal
de tecidos do córtex retrosplenial dos ratos
do grupo controle (A) e grupo de hiperoxia
(B), coradas com cresilo violeta. A
densidade neuronal é
significativamente menor no grupo de
hiperoxia. (C) Resultados de TUNEL
imunorreatividade no grupo controle. TUNEL
reforçada nas células positivas
grupo de hiperoxia(D).
Resultados
• Efeitos da hiperoxia em quebra da fita de
DNA:
Resultados
• Efeitos da hiperoxia sobre a morte celular no
ELISA:
Fig 6: Comparação dos resultados teste
ELISA morte celular (grama / absorvância
proteína) entre os grupos controle e
hiperóxia.
Resultados
• Peso dos cérebros:
Fig 7: Comparação dos pesos dos
cérebros entre controle e grupo de
hiperoxia.
Discussão
• Estudo:
– Concentrações suprafisiológicas levam a reação
apoptótica e neurodegenerativas, morte celular
e diminuição da massa cerebral alteração do
desenvolvimento cerebral;
– Morte celular relacionada à hiperoxia em todas
as regiões estudadas locais importantes de
controle cognitivo, motor, sensorial, além de
funções de memória e aprendizagem.
Discussão
• Animais selecionados devido à semelhança com o
desenvolvimento pós-natal de um RN nascido com ± 24sem
de IG:
– Período crítico para o desenvolvimento cerebral;
– RN comumente intubados e recebendo quantidades excessivas de
O2;
• Estudos sobre os efeitos da hiperoxia no desenvolvimento
cerebral são escassos;
• Um estudo: exposição de prematuros à hiperoxia é
importante fator de risco para desenvolvimento de paralisia
cerebral, piora o resultado em RN com asfixia;
• Lembrar que em UTINeo existem muitos fatores de risco
que levam a morte neuronal silenciosa (sedativos,
antiepiléticos), que somam os riscos com a hiperoxia.
Discussão
• Mecanismos da hiperoxia responsáveis pela
morte celular no cérebro em desenvolvimento
ainda não são conhecidos;
• Hiperoxia: produção de radicais livres:
-danos ao DNA-mitocôndriamembranas;
-mudança na expressão de genes;
-fosforilação de proteínas;
Conclusão
• Hiperoxia:
– Capaz de produzir morte celular no cérebro em
desenvolvimento, assim como no pulmão e na
retina;
– Estudo sugere que a morte neuronal induzida
pela hiperoxia pode ter parte na responsabilidade
da deficiência cognitiva e motora desenvolvida
posteriormente em prematuros.
Consultem também:
• Danilov CA, Fiskum G.
Hyperoxia promotes astrocyte cell death
after oxygen and glucose deprivation.
Glia. 2008 May;56(7):801-8
(A hiperoxia promove a morte celular do astrócito
após deprivação de oxigênio e glucose)
Impacto das práticas clínicas no cérebro em
desenvolvimento
Autor(es): Augusto Sola (EUA). Realizado por
Paulo R. Margotto