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Laboratório de Bioquímica da Faculdade de Medicina do Porto
Este paper é um marco histórico na medicina e na bioquímica.
Cori, G. T. & Cori, C. F. (1952) Glucose-6-phosphatase of the liver in glycogen storage
disease, J Biol Chem. 199, 661-7.
Foi a primeira vez que se conseguiu provar
uma hipótese que havia sido formulada no
início do século XX: que algumas doenças
congénitas poderiam ter como causa o deficit
de uma enzima.
O trabalho foi feito por dois investigadores que
tinham ganho o prémio Nobel da medicina em
1947.
Em 1952, já se
conhecia a via
de degradação
do glicogénio.
A via de
síntese só foi
descoberta no
final dessa
década (por
Luis Leloir em
1959).
Fosforílase do
glicogénio
fosfoglicomútase
H2O
Glicose-6fosfátase
Alguns doentes tinham acumulação de glicogénio no fígado e episódios de hipoglicemia
e porque em 1929 von Gierke tinha descrito os achados morfológicos em doentes com
estas características a doença (de facto um síndrome a que correspondem várias
doenças) tinha sido designada de “doença de von Gierke”.
Com base no que se conhecia sobre o metabolismo do glicogénio, Cori e Cori
formularam hipóteses acerca da patogenia da doença de von Gierke e testaram essas
hipóteses.
De acordo com o que se conhecia na época que hipóteses seriam plausíveis?
Será que o defeito está na glicose-6-fosfátase? Como testar esta hipótese?
1- Colheram amostras de fígado em indivíduos normais, em doentes com patologias
hepáticas não relacionadas e com “doença de von Gierke”.
2- Prepararam homogeneizados de fígado a partir dessas amostras.
3- Mediram a actividade da enzima suspeita nesses homogeneizados.
4- Compararam os resultados obtidos com as diferentes amostras.
5- Procuraram interpretar os resultados.
6- Formularam novas hipóteses com base nesses resultados e testaram-nas.
Biopsia
hepática
Homogeneizado
de fígado
Método geral usado para medir a
glicose-6-fosfátase.
A actividade da enzima foi calculada
subtraindo os valores de Pi formado em
ensaios gémeos que não incluíam o
substrato.
G6P
Reagente que desnatura a
enzima e reage com o Pi
permitindo o seu doseamento
Meio de ensaio:
Volume = 1 mL
Tampão = citrato 30 mM, pH 6.8
Homogeneizado hepático equivalente a 4 a 33 mg de fígado.
Substrato = glicose-6-fosfato 5 mM
Temperatura = 30ºC
Tempo de ensaio = 1 hora
Pararam a reacção com ácido tricloroacético, filtraram e dosearam a Pi formado.
Expressaram os resultados em Pi formado por 100 mg de fígado.
Que doentes tinham,
claramente valores
muito baixos de
glicose-6-fosfátase?
A análise do glicogénio
de CH mostrou que era
anormal: demasiado
ramificado.
Porque é que o
resultado de CH era
algo mais baixo que o
normal?
Perguntas?
1- Dando-se a coincidência
de 2 dos 3 resultados com
valores muito baixos
corresponderem a material
de autópsia poderia isto
querer dizer que a glicose6-fosfátase sofreu
degradação após a morte
dos pacientes MAS e PS?
Os dados pareciam negar
esta hipótese…que dados?
2- Será que o fígado de MAS continha um inibidor que impedia a acção catalítica da
glicose-6-fosfátase?
Testaram e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese. Que dados?
3- Será a glicose-6-fosfátase era normal mas faltava uma substância não enzímica no
fígado de MAS e PS que era essencial à actividade da enzima?
Ferveram fígado de CS… e os dados obtidos também pareciam negar esta hipótese.
Que dados?
4- Será que o deficit poderia ser na fosfoglicomútase (e não na glicose-6-fosfátase) ?
Para isso substituíram a glicose-6-P por glicose-1-P no meio de ensaio voltaram a
testar a formação de Pi.
No caso MAS: baixo Pi formado nos dois ensaios, acumulação de glicose-6-P quando
se usou glicose-1-P como substrato.
No caso CS (controlo): alta produção de Pi nos dois ensaios e não ocorreu acumulação
de glicose-6-P quando se usou glicose-1-P como substrato.
Serão estes dados compatíveis com deficit de fosfoglicomútase?
5- Também se testaram as actividades de duas enzimas conhecidas como fosfátase
ácida e alcalina.
Usaram como substrato glicerofosfato e pH 5 no primeiro caso e pH 9 no segundo.
pH 5
pH 9
CS (controlo sem doença)
135
48
CH (deficit de enzima desramificante ?)
127
17
PS (deficit de glicose-6-fosfátase)
122
39
Serão estes dados compatíveis com deficit de fosfátase ácida
ou com deficit de fosfátase alcalina?