UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE A VACINAS DE ANTÍGENO
PARTICULADO DE Leishmania sp E SUA ASSOCIAÇÃO COM VACINA
DE DNA pCI-neo-p36(LACK) EM CAMUNDONGOS BALB/c
DESAFIADOS COM Leishmania chagasi
AUTORA: RAFAELLA FORTINI PINTO GRENFELL
ORIENTADORA: PROFA. DRA. SIMONE APARECIDA REZENDE
COLABORADORES: PROFA. DRA. ANA PAULA SALLES MOURA FERNANDES
PROF. DR. LUÍS CARLOS CROCCO AFONSO
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto,
como parte integrante dos requisitos para a obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas. Área de
concentração: Imunobiologia de Protozoários.
Ouro Preto, fevereiro de 2007
G826a
Grenfell, Rafaella Fortini Pinto.
Avaliação da resposta imune a vacinas de antígeno particulado de
Leishmania sp e sua associação com vacina de DNA pCI-neo-p36 (lack) em
camundongos balb/c desafiados com Leishmania chagasi [manuscrito] /
Rafaella Fortini Pinto Grenfell. – 2007.
xvi, 109 f.: il., color; graf.
Orientadora: Profa. Dra.Simone Aparecida Rezende.
Co-orientadora: Profa. Dra. Ana Paula Salles Moura Fernandes.
Co-orientador: Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de
Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Imunoparasitologia.
1. Leishmaniose - Teses. 2. Vacinas -Teses. 3. Saponinas - Teses.
4. Antígenos - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
CDU: 616.993.161
Catalogação: [email protected]
1
Trabalho
desenvolvido
no
Laboratório
de
Imunoparasitologia do Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro
Preto, sob a orientação da Profa. Dra. Simone
Aparecida Rezende, com auxílio financeiro da
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
Gerais (FAPEMIG).
2
“Foi o tempo que perdi com minha rosa que a fez tão importante.”
Antoine de Saint-Exupery
3
AGRADECIMENTOS
A Profa. Dra. Simone Aparecida Rezende, minha orientadora, por compartilhar comigo
o tema da pesquisa e por oferecer estímulos para a realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Luís Carlos Crocco Afonso pelos sábios conselhos e disponibilidade em
trocar informações.
Aos Profs. Drs. Milton Hércules, Ieso de Miranda, Rogélio Lopes, Juliana Fietto, Elio
Hideo Babá, Renata Guerra, Jorge de Lena e Alexandre Reis por grandes momentos de
auxílio.
A Profa. Ana Paula Fernandes e ao Doutorando Eduardo Antônio Ferraz Coelho, da
UFMG, pela preciosa colaboração e ajuda no desenvolver deste trabalho.
Ao Eduardo de Almeida Marques da Silva, pela constante disponibilidade, ajuda e
intercâmbio de idéias.
A Miriam Souza pela incansável disposição, boas conversas e grandes ensinamentos
sobre muito do que passou a texto.
Aos amigos do LIP (Jamile, Elisângela, Roberta, Wagner, Leandro, Marcorélio, Lucas,
Carlos, Djalma, Leonardo), só o que é bom dura tempo o bastante para se tornar
inesquecível, em especial a Fernanda, Tiago e Guilherme pelo fundamental auxílio no
trabalho prático.
Aos grandes mestres que me fizeram amar o meu ofício com o coração, especialmente a
grande professora Zezé que me ensinou a não querer ficar apenas no que sou.
A Heloísa Brandão Federman (in memoriam), pelo maior exemplo de pesquisadora,
pelo compartilhamento de interesses comuns e por ter me presenteado com grande parte
de sua riquíssima pesquisa, o que a tornou companheira fiel deste projeto.
4
Aos ´meninos´ BALB/c pelo entusiasmado convívio e por permitirem o entendimento
completo da metodologia de pesquisa.
Agradecimentos especiais
A Deus, meu agradecimento maior, pelo amor que me deu pela profissão, pela liberdade
de pensar, querer, crescer e optar. Agradeço por não ter me livrado muitas vezes do
perigo, mas por ter me ensinado a enfrentá-lo sem temor.
A Cida, grande companheira e amiga, por ter enriquecido minha estadia em Ouro Preto
transformando qualquer necessidade em ajuda desinteressada.
As amigas de mestrado, Lílian, Daniela, Vanda e Fernanda pela importante amizade nos
dias frios.
A amiga Maria Cláudia, pela maior amizade e laço eterno.
As amigas de toda a vida, sem nenhuma ordem em particular, Marina, Izabella e Lycia
pelas mãos dadas nessa longa estrada.
Aos demais amigos, os quais não cito nomes, pela dedicada amizade e importante
incentivo.
Especialmente, aos meus pais pela confiança que me incurtiram ao longo dos meus anos
de vida.
Ao meu pai, Silvio, pela imensa confiança, saudade e amor sempre proporcionados, de
perto ou à distância.
A minha mãe, Eliane, pela devoção e inestimável amor, e por ter suportado
pacientemente minha ausência da vida familiar.
Aos meus irmãos, Camilla e Silvio, pelo exemplo de luta na busca profissional que
tanto me engrandece.
5
A D. Helena, Expedito, Júnior e Marcelo pelo amor e carinho que me deram desde o
primeiro dia, tornando-se uma importante fonte de apoio afetivo, e por me permitir ter
hoje minha família multiplicada por dois.
Ao Fabiano, meu amor e amigo, minha mais importante fonte de apoio intelectual e
afetiva, que conforme prometido me apoiou nos bons e maus momentos. Pela excitação
e orgulho com que sempre reagiu aos meus resultados e vitórias, pelo encorajamento
transmitido e por ter abraçado também este sonho como se fosse seu. Ele é nosso, a bem
da verdade.
Estendo meus agradecimentos a todos aqueles que de alguma forma foram me ajudando
anonimamente ao longo destes dois anos.
6
RESUMO
A leishmaniose visceral é uma enfermidade crônica que pode atingir 98% de
mortalidade em humanos não tratados. Pela sua gravidade e alta prevalência, a
vacinação é um meio importante de proteção. Alguns tipos de vacinas vêm sendo
testados, dentre eles, as vacinas de antígeno particulado e a de DNA. Estas vacinas
demonstraram a capacidade de reduzir a carga parasitária no fígado e no baço em
modelo murino e induzir a produção de IFN-γ, com indução de uma resposta celular
prolongada, em alguns casos. No nosso estudo, camundongos BALB/c foram vacinados
com três doses de uma vacina subcutânea contendo 100 µg de antígeno particulado de
L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis e 50 µg de saponina como adjuvante,
associada ou não a uma vacina intramuscular, em duas doses, com 100 µg de pCI-neop36(LACK). Esta vacina de DNA continha um gene que codifica a proteína LACK
(homóloga de Leishmania de receptores de proteína kinase C ativada), uma proteína de
36 kDa, conservada nas várias espécies e formas do ciclo de vida da Leishmania. Nos
dois protocolos de vacinação, os camundongos foram desafiados 4 ou 12 semanas após
a administração da vacina com 1 x 107 formas promastigotas de L. chagasi e
sacrificados 5 semanas após o desafio para análise da capacidade protetora das vacinas,
no fígado e no baço, e de indução da produção de IFN-γ e IL-4 pelos esplenócitos. Os
dados mostraram que a vacina pCI-neo-p36(LACK) associada à vacina de antígeno
particulado de L. chagasi induziu maior grau de proteção que a vacina de antígeno
particulado administrada isoladamente, especialmente no fígado quando o desafio foi
feito 4 semanas após a vacinação. Além disso, a vacina de antígeno de L. amazonensis,
quando associada ou não a vacina pCI-neo-p36(LACK), induziu uma maior redução da
carga parasitária do que a de L. braziliensis, no entanto nenhuma destas duas vacinas
induziu proteção maior que a vacina de antígeno de L. chagasi. As vacinas induziram a
produção significativa de IFN-γ mas não de IL-4 que, em alguns casos, foi suprimida.
Apesar da capacidade da associação das vacinas em aumentar a proteção contra o
parasito, problemas relacionados com o uso de vacinas de DNA precisam ser melhor
compreendidos.
7
ABSTRACT
American visceral leishmaniasis is a chronic disease that can reach 98% of
human mortality when not treated. Due to its severity and high incidence, vaccination
has become an important approach to protection. Several vaccines have been tested,
amongst then, freeze-thawed antigen and DNA vaccines. These two vaccines have
demonstrated the capacity to reduce the parasite burden in liver and spleen in murine
model and to induce the production of IFN-γ, with the induction of a long-term cellular
immunity in some cases. In our study, BALB/c mice were vaccinated with a three doses
subcutaneous vaccine containing 100 µg of L. chagasi, L. braziliensis or L. amazonensis
freeze-thawed antigen with 50 µg of saponin as an adjuvant, associated or not with an
intramuscular one, in two doses, with 100 µg of pCI-neo-p36(LACK). This DNA
vaccine was constituted of LACK (Leishmania homologue of receptors for activated C
kinase) expression gene, a 36 kDa protein highly conserved in all species and life cycle
stages of Leishmania. In the two vaccines protocols, mice were challenged
intravenously with 1 x 107 L. chagasi promastigotes 4 or 12 weeks after booster and
sacrified 5 weeks after challenge for the analysis of the vaccines protective capacity in
liver and spleen and the measure of the production of IFN-γ and IL-4 by splenocytes.
Data showed that the pCI-neo-p36(LACK) associated to L. chagasi freeze-thawed
antigen induced a higher protection than the freeze-thawed antigen alone, specially in
liver when the challenge was performed 4 weeks after booster. In addiction, L.
amazonensis vaccine induced a greater reduction in parasite burden than L. braziliensis.
The vaccines induced a significant production of IFN-γ but not of IL-4, that was
suppressed is some cases. Despite the showed capability of the vaccines association in
increase the protection against the parasite, problems with the use of DNA vaccines
must be reviewed.
8
ÍNDICE
Agradecimentos................................................................................................................iv
Agradecimentos especiais..................................................................................................v
Resumo............................................................................................................................vii
Abstract..........................................................................................................................viii
Lista de figuras................................................................................................................xii
Lista de quadros..............................................................................................................xiv
Lista de siglas..................................................................................................................xv
Introdução........................................................................................................................18
Leishmanioses: conceituação...............................................................................18
Leishmanioses: grupos e formas clínicas.............................................................19
Leishmanioses: epidemiologia.............................................................................20
Ciclo biológico da Leishmania............................................................................21
Resposta imunológica do hospedeiro..................................................................22
Resposta imunológica do hospedeiro com leishmaniose visceral.......................24
Ação do parasito nas células do hospedeiro........................................................25
Tratamento das leishmanioses.............................................................................27
Modelos experimentais........................................................................................28
Vacinas: definição e tipos....................................................................................29
Adjuvantes de vacinas.........................................................................................32
Tipos de vacinas contra leishmaniose visceral....................................................33
Vacinas de DNA..................................................................................................36
Vacinas e leishmaniose visceral..........................................................................38
Objetivos..........................................................................................................................40
Objetivo Geral......................................................................................................40
Objetivos Específicos..........................................................................................40
Delineamento Experimental............................................................................................42
Material e Métodos..........................................................................................................44
Animal experimental............................................................................................44
Parasito e antígeno...............................................................................................44
9
Quantificação de parasitos...................................................................................46
Obtenção de células mononucleares do baço para dosagem de citocinas (IFN-γ e
IL-4).....................................................................................................................47
Dosagens de IFN-γ e IL-4....................................................................................47
Transformação e cultura de Escherichia coli......................................................49
Extração e purificação do DNA plasmidial.........................................................51
Verificação da presença de enxertos do gene p36(LACK) no DNA
extraído................................................................................................................52
Preparo do DNA para vacinação.........................................................................52
Preparo do antígeno para vacinação....................................................................54
Experimentos de imunização...............................................................................54
Análise estatística................................................................................................57
Resultados .......................................................................................................................59
Eletroforese das amostras de DNA extraídas e purificadas.................................59
Curva de crescimento de L. chagasi em meio DMEM........................................60
Curva de crescimento de L. braziliensis e L. amazonensis em meio
GRACE’s.............................................................................................................61
Padrão de infecção no baço e no fígado e produção de citocinas em
camundongos BALB/c inoculados com L. chagasi.............................................61
Avaliação da carga parasitária no baço e no fígado de camundongos após
vacinação com antígeno particulado de L. chagasi, L. braziliensis ou L.
amazonensis.........................................................................................................62
Avaliação da produção das citocinas IFN-γ e IL-4 por esplenócitos de
camundongos vacinados com antígeno particulado de L. chagasi, L. braziliensis
ou L. amazonensis e desafiados com L. chagasi 4 ou 12 semanas após a
vacinação.............................................................................................................64
Avaliação da carga parasitária no baço e no fígado de camundongos após
vacinação com pCI-neo-p36(LACK) e antígeno particulado de L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis............................................................................69
Avaliação da produção das citocinas IFN-γ e IL-4 por esplenócitos de
camundongos vacinados com a associação de pCI-neo-p36(LACK) e antígeno
10
particulado de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis, desafiados com L.
chagasi 4 ou 12 semanas após a vacinação.........................................................74
Sumário............................................................................................................................82
Discussão.........................................................................................................................86
Conclusões ......................................................................................................................98
Referências Bibliográficas ............................................................................................100
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Camundongo BALB/c utilizado como modelo experimental
Figura 2. Plasmídeo pCI-neo
Figura 3. Curva padrão para quantificação de DNA
Figura 4. Sítios de vacinação subcutânea, na base da cauda, e intramuscular, na região
anterior mediana da coxa direita, em camundongo BALB/c
Figura 5. Eletroforese em gel de agarose a 0,8% do plasmídeo pCI-neo-p36(LACK)
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 0,8% do plasmídeo pCI-neo
Figura 7. Curva de crescimento de L. chagasi M2682 em DMEM 20% SFB, 0,0625%
hemina e 5% urina humana, pH 6,8
Figura 8. Carga parasitária no baço de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania
Figura 9. Carga parasitária no fígado de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania
Figura 10. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com
antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi,
desafiados 4 semanas após a vacinação
Figura 11. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania e estimulados com antígeno de L. chagasi, desafiados 4
semanas após a vacinação
Figura 12. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com
antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi,
desafiados 12 semanas após a vacinação
Figura 13. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi, desafiados
12 semanas após a vacinação
Figura 14. Carga parasitária no baço de camundongos vacinados com pCI-neop36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania
12
Figura 15. Carga parasitária no fígado de camundongos vacinados com pCI-neop36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania
Figura 16. Lesão desenvolvida no sítio de vacinação intramuscular de pCI-neop36(LACK)
Figura 17. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 4 semanas após a vacinação
Figura 18. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 4 semanas após a vacinação
Figura 19. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 12 semanas após a vacinação
Figura 20. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 12 semanas após a vacinação
Figura 21. Comparação da produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos após
vacinação com antígeno particulado de L. chagasi isoladamente ou associado ao pCIneo-p36(LACK)
Figura 22. Comparação da produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos após
vacinação com antígeno particulado de L. chagasi isoladamente ou associado ao pCIneo-p36(LACK)
13
LISTA DE QUADROS
Quadro 1. Protocolo de vacinação da vacina de Ag. Part. de L. chagasi, L. braziliensis
ou L. amazonensis.
Quadro 2. Protocolo de vacinação da associação da vacina de Ag. Part. de L. chagasi,
L. braziliensis ou L. amazonensis com a vacina de DNA pCI-neo-p36(LACK).
Quadro 3. Sumário dos resultados obtidos pelos protocolos de vacinações com Ag.
Part. de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis associado ou não com vacina de
DNA pCI-neo-p36(LACK).
14
LISTA DE SIGLAS
ABTS: Ácido 2,2’ - bis - azino (3 - etilbenzil - thiazol - 6 - sulfônico)
ADP: Adenosina Difosfato
Ag Lc: Antígeno particulado de Leishmania chagasi
Ag. Part.: Antígeno particulado
APC: Célula Apresentadora de Antígeno
BSA: Albumina sérica bovina
CMV: Citomegalovírus
CP: Cisteína Proteinase
CpG ODN: Citosina-fosfato-Guanosina Oligodeoxinucleotídeo
D.O.: Densidade Ótica
DMEM: Meio Essencial Mínimo Dulbecco
FML: Ligante de Fucose-Manose
FQL: Fator Quimiotático de Leishmania
gp: Glicoproteína
IFN-γ: Interferon gama
IL: Interleucina
im: Intramuscular
iNOS: Óxido Nítrico Sintase indutível
LACK: Homóloga de Leishmania de Receptores de Proteína Quinase C Ativada
LB: Meio Luria-Bertaine
LPG: Lipofosfoglicano
LPS: Lipopolisacarídeo
LTA: Leishmaniose Tegumentar Americana
LVA: Leishmaniose Visceral Americana
MAC: Complexo de Ataque à Membrana
MCP: Proteína Quimiotática para Monócito
MHC: Complexo de Histocompatibilidade Principal
NK: Natural Killer
p24 (LACK): Versão reduzida de 24 kDa da proteína LACK
p36 (LACK): Proteína LACK de 36 kDa
15
PBS: Solução salina tamponada com fosfato
pCI-neo-p36(LACK): pCI-neo com inserto do gene p36(LACK)
PCR: Reação em cadeia da polimerase
PMN: Neutrófilos Polimorfonucleares
PPG: Proteofosfoglicano
RACK: Receptor de Proteína Quinase C Ativada
rIFN-γ: Interferon gama recombinante
rIL-4: Interleucina-4 recombinante
sc: Subcutânea
SDS: Lauril Sulfato de Sódio
SFB: Soro Fetal Bovino
SFM: Sistema Fagocítico Mononuclear
ssDNA: DNA de fita única
TAE: Tris Acetato EDTA
TCR: Receptor de Célula T
Th: Linfócito T “Helper”
TLR: Receptor “Toll-like”
TNF: Fator de Necrose Tumoral
16
1. INTRODUÇÃO
17
1. INTRODUÇÃO
Leishmanioses: conceituação
As leishmanioses são enfermidades causadas por protozoários incluídos na
ordem Kinetoplastida, na família Trypanosomatidae e no gênero Leishmania. Estes
protozoários são seres unicelulares e heteroxenos, transmitidos por flebotomíneos
pertencentes ao gênero Phlebotomus, encontrado no Velho Mundo e ao Lutzomyia, no
Novo Mundo (Machado-Coelho e cols., 1999). Este parasito foi descrito pela primeira
vez, em 1903, por W. B. Leishman, próximo da época em que L. H. Donovan descreveu
a espécie do parasito causador do Calazar. A epidemiologia da doença é hoje
extremamente diversificada com vinte espécies de Leishmania patogênicas para o
homem e trinta espécies de inseto vetor. O parasito é encontrado nas formas
promastigota e paramastigota, ambas apresentando flagelo, no trato digestivo dos
hospedeiros invertebrados e na forma amastigota, sem flagelo livre, dentro das células
do Sistema Fagocítico Mononuclear (SFM) dos hospedeiros vertebrados (Ryan e cols.,
1987).
As leishmanioses se caracterizam por dois ciclos epidemiológicos principais, o
zoonótico, onde o animal reservatório está envolvido na transmissão e, o antroponótico,
onde o homem é o reservatório e a fonte de infecção do vetor (Lainson, 1983; Rogers,
1988). Sendo assim, o ciclo zoonótico, apresenta, como principais reservatórios,
animais vertebrados como a preguiça, o cão doméstico, os ratos, o gerbil e a paca,
dentre outros (Ashford, 1996). Já o ciclo antroponótico acontece comumente na Índia,
Iraque, Senegal, Mongólia e Namíbia (Choudhury & Saxena, 1987).
A leishmaniose é uma doença que pode apresentar várias formas clínicas,
dependendo da espécie do parasito e do estado imunológico do hospedeiro, sendo um
sério problema de saúde pública decorrente de mudanças do comportamento humano
em relação ao meio ambiente (Wilson & Streit, 1996).
18
Leishmanioses: grupos e formas clínicas
As leishmanioses são classificadas em dois grupos clínicos de acordo com o
acometimento dos órgãos, sendo que a leishmaniose tegumentar acomete pele e
mucosas e a leishmaniose visceral acomete vísceras, principalmente baço, fígado e
medula óssea e, ainda, linfonodos.
A leishmaniose tegumentar é uma enfermidade polimórfica da pele e mucosas,
caracterizada pela existência de uma variedade de formas clínicas, variando de lesões
auto-resolutivas a lesões desfigurantes (Peters, 1993; Weigle & Saravia, 1996; Rocha e
cols., 2002). Assim, tem-se a forma cutânea que é caracterizada inicialmente por um
nódulo no local da picada, causado principalmente pela migração de leucócitos, o que
leva a um processo de necrose tecidual, resultando em uma lesão ulcerada. A segunda, a
forma mucocutânea, é caracterizada por lesões destrutivas secundárias envolvendo
mucosas e cartilagens, que aparecem meses ou mesmo anos após a lesão primária
ulcerada. Já a terceira forma, a cutânea difusa, é caracterizada pela formação de lesões
difusas não ulceradas na pele, nas quais se encontra grande número de formas
amastigotas e o paciente apresenta uma resposta imunológica celular prejudicada
(Peters, 1993; Weigle & Saravia, 1996; Ashford, 2000).
A leishmaniose visceral, por sua vez, é uma enfermidade caracterizada por
diferentes sinais e sintomas, alguns inespecíficos como febre irregular e de longa
duração, tosse seca e diarréia, outros como a hepatoesplenomegalia e a desnutrição e,
ainda,
sintomas
graves
como
linfadenopatia,
anemia,
leucopenia,
hipergamaglobulinemia e edema, podendo-se observar um quadro de fenômenos
hemorrágicos. A situação clínica de um paciente em estado avançado pode se agravar,
sem o correto tratamento, levando a debilidade progressiva e, até mesmo, a um quadro
de caquexia, podendo chegar inclusive ao óbito (Ashford, 2000).
A leishmaniose visceral pode ser classificada de acordo com a sua
sintomatologia. A forma assintomática se caracteriza pela ausência destes sinais e
sintomas, porém, com a persistência do parasito na forma latente no organismo, por
tempo indeterminado. A forma subclínica ou forma oligossintomática é, por sua vez,
caracterizada pelas manifestações inespecíficas como febre alta, tosse seca e diarréia, o
que muitas vezes dificulta o diagnóstico clínico. A forma aguda é caracterizada por um
19
quadro amplo de sinais e sintomas, como diarréia, febre, comprometimento das células
sanguíneas, entre outros, onde estes se apresentam de forma acentuada e com rápida
evolução. Por fim, a forma clássica crônica que também é caracterizada pelos sinais e
sintomas
clássicos,
porém
de
forma
mais
grave
como
pancitopenia,
hipergamaglobulinemia, hipoalbuminemia e hepatoesplenomegalia, além de amenorréia
e alopécia (Badaro e cols., 1986).
Leishmanioses: epidemiologia
As leishmanioses são, atualmente, prevalentes em quatro continentes (América,
África, Europa e Ásia), sendo endêmicas em 22 países no Novo Mundo e em 66 do
Velho Mundo. Na América do Sul, a primeira descrição da doença foi feita em 1913 no
Paraguai e em 1934, no Brasil, na região nordeste durante pesquisas de febre amarela.
A ocorrência de 90% dos casos de leishmaniose visceral é observada em cinco
principais países (Bangladesh, Índia, Nepal, Sudão e Brasil) e de 90% de casos de
leishmaniose tegumentar em sete países (Afeganistão, Argélia, Brasil, Irã, Peru, Arábia
Saudita e Síria). A leishmaniose visceral ocorre também em outros países da América
do Sul, como Venezuela (Delgado e cols., 1998; Aguilar e cols., 1998) e Colômbia
(Travi e cols., 1998). No Brasil, a doença ocorre em vários centros urbanos, como São
Luís, no Maranhão (Nascimento e cols., 1996), Teresina, no Piauí (Werneck e cols.,
2003) e Salvador, na Bahia (Cunha e cols., 1995).
A incidência anual no mundo está estimada em 500.000 casos de leishmaniose
visceral e 1 a 1,5 milhões de casos de leishmaniose tegumentar, com uma prevalência de
12 milhões numa população de risco de 350 milhões. Em vários países, tem-se
observado um aumento no número de casos de leishmaniose cutânea como, por
exemplo, no Brasil, onde foram notificados 21.800 casos em 1998, 30.550 em 1999 e
35.000 em 2000 (Thakur, 2006).
As leishmanioses são endêmicas no Brasil, sendo muito notificadas na região
nordeste e em cidades do norte de Minas Gerais, como Montes Claros, demonstrando a
urbanização da doença e a sua associação com condições econômicas e sociais precárias
das comunidades afetadas (Vieira & Coelho, 1998). Até a década de 1970, a infecção
humana por Leishmania esteve relacionada com o contato direto do homem com as
20
florestas. No entanto, desde a década de 1980, a doença vem sendo descrita em
indivíduos de áreas rurais, próximas a locais com indícios de devastação de florestas e
matas. Desde então, ocorreu uma modificação nos padrões de transmissão com o
aparecimento de casos nas regiões peri-urbanas (Machado-Coelho e cols., 1999), onde
animais infectados invadem o peri-domicílio para se alimentarem e são picados pelos
insetos vetores, que passam a ser potenciais transmissores para os cães domésticos e
para os homens (Lainson e cols., 1969).
No estado de Minas Gerais, tem ocorrido uma freqüente transmissão de ambas
as leishmanioses, principalmente nas regiões urbanas. Entre 1994 e 1999, 89% dos 36
municípios que formam a Região Metropolitana de Belo Horizonte apresentaram
notificações de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) e 42% de Leishmaniose
Visceral Americana (LVA) (Oliveira e cols., 2001; Profeta da Luz e cols., 2001).
Ciclo biológico da Leishmania
Os parasitos podem se apresentar em três diferentes formas no ciclo biológico, a
amastigota, a promastigota e a paramastigota. A forma amastigota tem característica
ovóide ou esférica, uninucleada, com cinetoplasto em forma de bastão e com ausência
de flagelo livre. A forma promastigota já se apresenta com formato alongado e pequeno,
é uninucleada, flagelada e possui cinetoplasto ovóide localizado na região anterior
enquanto a forma paramastigota possui formato achatado, sendo também flagelada,
uninucleada e com cinetoplasto próximo ao núcleo.
O ciclo biológico tem seu início quando a fêmea do inseto vetor pica um animal
vertebrado infectado e, durante o repasto, adquire formas amastigotas que parasitam
principalmente macrófagos presentes no sangue ingerido. Entre 15 e 221 horas após a
picada, as formas de Leishmania já estão presentes no intestino médio do inseto vetor
(Lainson & Shaw, 1988). No lúmen intestinal, ocorre o rompimento destes macrófagos,
liberando as formas amastigotas que se dividem por divisão binária e se transformam
em promastigotas procíclicas, dentro da membrana peritrófica. Estas formas se dividem
rapidamente, fazendo com que a membrana peritrófica se rompa, permitindo que a
Leishmania colonize o trato digestivo posterior, médio e anterior do flebotomíneo. Após
isso, se transformam em promastigotas procíclicas que, posteriormente, se diferenciam
21
em promastigotas metacíclicas, as formas infectantes do parasito (Lainson & Shaw,
1988). Em novo repasto, as formas promastigotas metacíclicas presentes no trato
digestivo anterior, probóscida, faringe e esôfago são transmitidas pelo flebotomíneo a
um hospedeiro não infectado, através da possível regurgitação do inseto causada pelo
bloqueio da válvula proventricular, devido ao intenso parasitismo no intestino anterior.
No hospedeiro vertebrado, as promastigotas metacíclicas são fagocitadas por células do
SFM, macrófagos teciduais e granulócitos neutrófilos, onde, dentro do vacúolo
fagocitário, sofrem diferenciação para formas amastigotas. Este vacúolo fagocitário se
funde com o lisossomo, formando o fagolisossomo onde as formas amastigotas sofrem
várias divisões binárias até que, pelo excesso de parasitismo, as células se rompem ou
realizam exocitose (Rittig & Bogdan, 2000), liberando as formas amastigotas que
podem, assim, parasitar novos macrófagos e serem transmitidas a outro flebotomíneo
durante nova picada (Murray e cols., 2005).
Resposta imunológica do hospedeiro
O hospedeiro imunocompetente é capaz de ativar as respostas inflamatórias inata
e adquirida que vão estabelecer o grau de expressão da doença. Primeiramente, os
macrófagos são ativados a um estado leishmanicida estimulado por uma resposta de
células T auxiliares do tipo 1 (Th1). Esta resposta envolve um complexo sistema com
células apresentadoras de antígeno (APCs), células T CD4+ e uma grande liberação de
citocinas pró-inflamatórias, como a interleucina-12 (IL-12), interferon-gama (IFN-γ) e
fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α). Esta mesma resposta Th1 previne a
manifestação da doença após um estado latente e o estabelecimento de fase crônica
(Stobie e cols., 2000).
No sítio da infecção, uma resposta inata complexa inclui múltiplos fatores, como
a presença de células (neutrófilos, monócitos/macrófagos, “Natural Killer” (NK),
células dendríticas), mecanismos de reconhecimento de receptores (receptores “tolllike”) e mecanismos do sistema complemento e liberação de citocinas, em especial a IL12 que auxilia na indução de imunidade mediada por células. Este complexo conjunto
de mecanismos, em grande parte iniciado por células dendríticas infectadas, tem sua
22
continuação com a ativação de células T CD4+ e CD8+. A migração destas células T
efetoras para o local da picada se dá, tanto na leishmaniose tegumentar como na
visceral, com a participação de moléculas de adesão e de quimiocinas. A partir daí, a
resposta de células T CD4+ está associada a produção de IFN-γ e de outras citocinas
como a IL-12, a IL-2 e o TNF-β. As células T CD8+ apresentam papel importante por
produzirem IFN-γ e promoverem o maior desenvolvimento de células T CD4+,
auxiliando no alcance da cura da doença (Stobie e cols., 2000b; Murray e cols., 2005).
Ao longo do desenvolvimento destes vários mecanismos na leishmaniose, são
produzidas também citocinas reguladoras que agem balanceando a resposta
imunológica. A IL-4, a IL-10 e a IL-13 são citocinas associadas com a resposta do tipo
2 (Th2), capazes de interferir na resposta do tipo 1, inibindo macrófagos e, assim,
favorecendo a infecção intracelular. Dados de um estudo realizado por Murray e cols,
2002 demonstram que a ausência da IL-10 favorece a ativação da resposta do tipo 1,
promovendo a eliminação do parasito e um sinergismo da resposta imunológica com a
quimioterapia em infecções agudas (Murray e cols., 2002).
No sítio da infecção, há migração de neutrófilos que iniciam a fagocitose dos
parasitos. Uma vez interiorizados, se inicia um processo de eliminação do parasito pelas
enzimas proteolíticas e por espécies reativas de oxigênio produzidas no interior dos
lisossomos que se fundem com os fagossomos formando os fagolisossomos. Neste
processo, ocorre ainda a produção de IL-8, essencial para a atração de novos neutrófilos.
Da mesma forma, macrófagos são atraídos ao local da infecção, fagocitam o parasito e
iniciam a produção de citocinas como TNF-α, IL-6, IL-18 e IL-12 e de metabólitos
tóxicos do oxigênio, como o ânion superóxido, o radical hidroxil e o peróxido de
hidrogênio e a produção de óxido nítrico. A IL-12 e a IL-18 são citocinas que auxiliam
na ativação de Th1, principalmente quando atuam em sinergismo. Mecanismos como a
explosão respiratória (produção de intermediários reativos do oxigênio) e a produção de
óxido nítrico pela enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) são importantes para a
eliminação dos parasitos pelos macrófagos (Bogdan & Rollinghoff, 1998; Stafford e
cols., 2002). Em humanos, o principal mecanismo de eliminação da Leishmania por
estas células resulta da ação de radicais de oxigênio e de óxido nítrico (Mossalayi e
cols., 1999).
23
As células dendríticas, por sua vez, são potentes células apresentadoras de
antígeno que induzem uma eficiente ativação de células T e produzem também citocinas
como IL-12, IL-10 e IFN-γ. A IL-12 produzida tem grande importância no controle de
infecções por L. major (Mattner e cols., 1997b; Mattner e cols., 1997a). Embora o
macrófago também seja capaz de produzir IL-12, na infecção por Leishmania, as células
dendríticas são a principal fonte desta citocina e estas células são ainda essenciais para a
manutenção de número suficiente de células Th1 de memória ou efetoras in vivo para
mediar proteção prolongada contra L. major (Stobie e cols., 2000).
Resposta imunológica do hospedeiro com leishmaniose visceral
No fígado, a Leishmania parasita as células de Kupffer, causando um influxo de
granulócitos e linfócitos T CD4+ e CD8+, resultando na formação de granulomas
(Wilson & Weinstock, 1996). Muitas células T do granuloma apresentam fenótipo de
memória ou de células ativadas em seis semanas de infecção com L. chagasi, o que
ocorre em menor nível com células do baço. Além disso, o granuloma hepático
apresenta menor quantidade de células produtoras de IFN-γ que no baço e as células
provenientes destes órgãos produzem quantidades semelhantes de IL-10, durante o
cultivo in vitro. Desta forma, a IL-10 parece modular a produção de IFN-γ pelos
esplenócitos, mas, no fígado, não é a única a modular a produção desta citocina, já que
outros fatores parecem estar envolvidos na supressão da produção de IFN-γ (Wilson e
cols., 1996). Um destes fatores é o TGF-β cuja presença nos granulomas hepáticos está
associada à inibição da resposta Th1 independente de citocinas Th2 (Wilson e cols.,
1998).
Muitos estudos indicam que a resposta imunológica Th2 predomina durante uma
infecção humana aguda num quadro de leishmaniose, com a supressão da reatividade de
células T, predominância das citocinas IL-4 e IL-10 em relação ao IFN-γ e a ativação de
células B policlonais, resultando em uma hipergamaglobulinemia (Kharazmi e cols.,
1999). O envolvimento de Th1 e Th2 na proteção e exacerbação da doença,
respectivamente, tem sido demonstrado em modelo murino de leishmaniose cutânea
(Heinzel e cols., 1989) e visceral (Rhee e cols., 2002), principalmente porque a IL-4
24
pode regular a ação de macrófagos (Hamilton e cols., 1999b). No entanto, parece
possível que, em alguns casos de leishmaniose visceral, um padrão misto Th1 e Th2
seja ativado, conforme revelado pelos altos níveis simultâneos de IFN-γ e de IL-4
detectados em camundongos (Ghosh e cols., 2001) e em cães (Ramiro e cols., 2003).
Nestes casos, a IL-4 não apresenta um padrão imunoregulatório (Kemp e cols., 1996),
como a IL-10 produzida por células Th3, macrófagos e linfócitos B. Desta forma, a
regulação da IL-10 parece ser um ponto constante na clínica, já que esta citocina está
associada à supressão da imunidade contra a leishmaniose visceral. Cillari e cols. (1995)
demonstraram, após detecção dos níveis de citocinas em soro de pacientes, um
importante papel regulatório de IL-10 sobre a resposta de células T e o envolvimento
desta citocina na patologia de infecções com L. donovani (Cillari e cols., 1995).
Quando analisados juntos, estes dados fornecem evidências da existência de uma
dicotomia da IL-4. Esta citocina pode ter a capacidade de estimular a diferenciação de
células dendríticas em células produtoras de IL-12 estimulando a resposta Th1 e a
resistência à infecção. Ao contrário, sua produção por células T CD4+ Vβ4 Vα8 pode
estar relacionada com a susceptibilidade e o direcionamento da resposta para Th2
(Melby e cols., 1998; Kharazmi e cols., 1999).
Ação do parasito nas células do hospedeiro
Algumas características do parasito e os mecanismos do hospedeiro se
relacionam diretamente com a patogênese durante a infecção. Dependendo da espécie, a
Leishmania consegue escapar da resposta humoral inata e remodelar mecanismos
intracelulares em algumas células como macrófagos e células dendríticas, afetando
fatores de transcrição e a expressão genética de citocinas (Murray e cols., 2005).
Primeiramente, formas promastigotas da Leishmania são capazes de se interiorizar nos
macrófagos de forma silenciosa, mantendo estas células desativadas e evitando assim a
ativação da resposta imune. Desta forma, a resposta do macrófago à infecção com
Leishmania é prejudicada uma vez que o parasito inibe a produção de citocinas, a
expressão de moléculas de superfície e a geração de mecanismos leishmanicidas como a
produção de intermediários reativos de oxigênio. Esta ação do parasito se extende ainda
25
para as células dendríticas, que são fundamentais na apresentação do antígeno, na
estimulação de células T e no eficiente desenvolvimento de uma resposta do tipo 1 e,
ainda, para os macrófagos o que pode se dar pela modulação negativa da expressão de
moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classes I e II (Reiner e
cols., 1987). As ações do parasito sobre estas células incluem ainda a inibição da
migração celular, da maturação e da ativação, limitando ainda a produção de IL-12
(Murray e cols., 2005).
As formas promastigotas podem utilizar mecanismos de defesa do organismo,
como as proteínas do sistema complemento, para evadirem da resposta do sistema
imune. Estas formas lançam mão da opsonização por estas proteínas para facilitar sua
interiorização nos fagócitos mononucleares através da ligação com receptores de
complemento presentes na superfície das células. No entanto, devido ao tamanho do
lipofosfoglicano (LPG), presente na superfície celular de formas promastigotas
metacíclicas, não ocorre a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) e estes
parasitos não são lisados (Desjardins & Descoteaux, 1998; Mendonca e cols., 1991).
Além disso, os
LPGs são também capazes de
interferir na
função de
monócitos/macrófagos e de células dendríticas através do bloqueio da adesão endotelial
e migração pela alteração de expressão de moléculas de adesão e síntese da proteína
quimiotática para monócitos (MCP-1) (Lo e cols., 1998; Murray e cols., 2005). A
mesma função exercem os proteofosfoglicanos (PPGs) na superfície das amastigotas
através da interferência na função de monócitos/macrófagos (Handman & Bullen, 2002;
Murray e cols., 2005).
Durante a infecção, o pH do vacúolo parasitóforo se mantém ácido, favorecendo
a ação das proteínas microbicidas e das enzimas hidrolíticas. Entretanto, o parasito é
capaz de inibir a produção de radicais de oxigênio e de água oxigenada no vacúolo,
através da inativação de NADPH oxidase e da alteração do pH para menos ácido ou
pode impedir a formação do fagolisossomo pela repulsão estérica do LPG (Handman &
Bullen, 2002), impedindo assim a ação de substâncias tóxicas presentes no lisossomo.
Um outro fator importante para o sucesso da infecção é a saliva do inseto. A
saliva possui algumas substâncias vasodilatadoras, imunoreguladoras, anticoagulantes e
com capacidade de atrair neutrófilos e monócitos/macrófagos ao sítio de infecção do
hospedeiro vertebrado. Uma destas substâncias é o maxadilan, um peptídeo presente na
26
saliva do Lutzomyia longipalpis, muito importante no estabelecimento da infecção. A
quimiotaxia gera um aumento da fagocitose, favorecendo a infecção de células e a
sobrevivência e a proliferação do parasito, uma vez que a porcentagem de células
infectadas e a porcentagem de parasitos dentro de cada uma destas células aumenta
(Guilpin e cols., 2002).
Tratamento das leishmanioses
Os medicamentos recomendados para o tratamento da leishmaniose tegumentar
e visceral, os antimoniais pentavalentes, foram introduzidos há 60 anos. Nas últimas
décadas, drogas alternativas e novas formulações se tornaram disponíveis para o uso em
alguns países, enquanto outras estão sendo testadas. Apesar da dificuldade de se
desenvolver uma droga única efetiva contra todas as formas de leishmaniose, muitos
avanços foram feitos neste setor. Alguns dos problemas em se desenvolver tal droga
incluem a diferença de órgãos acometidos na leishmaniose visceral e na tegumentar
necessitando de farmacocinéticas distintas e da variação intrínseca da sensibilidade das
várias espécies de Leishmania à droga. Além disso, há necessidade de medicamentos
que
alcancem
a
efetividade
em
pacientes
resistentes
aos
antimoniais
ou
imunossuprimidos (Croft e cols., 2006). O tratamento, no Brasil, foi padronizado com o
antimoniato de N-metil glucamina, como primeira escolha terapêutica, e, nos casos de
resistência e de segunda escolha, o isotionato de pentamidina ou a anfotericina B.
O antimoniato de N-metil glucamina, usado mundialmente, apresenta um
mecanismo de ação ainda impreciso. Este medicamento parece agir em diferentes
pontos, incluindo a interferência na glicólise do parasito, oxidação de ácidos graxos e
inibição da fosforilação da adenosina difosfato (ADP). Parece ainda bloquear de forma
inespecífica ligações de enxofre e hidrogênio de proteínas das amastigotas e inibir a
DNA topoisomerase I. Recentemente, foi demonstrado que o antimoniato pode
promover, tanto na promastigota quanto na amastigota, o influxo de tióis e de
glutationa, deixando o parasito mais susceptível ao “stress” oxidativo. Apesar de sua
ação importante, o antimoniato de N-metil glucamina apresenta uma alta
cardiotoxicidade, o que faz com que o paciente que está hospitalizado para a
27
administração parenteral, precise ser monitorado constantemente (Sundar & Chatterjee,
2006).
O isotionato de pentamidina vem sendo utilizado como segunda escolha para o
tratamento das leishmanioses. Este medicamento é uma diamidina aromática que age
como um inibidor do transporte de arginina, porém o seu exato mecanismo precisa
também ser melhor elucidado. Inicialmente, o isotionato de pentamidina demonstrou ser
efetivo nos casos de resistência ao antimonial, levando à cura cerca de 70% dos casos.
No entanto, em alguns pacientes, verificou-se uma reação adversa irreversível com a
formação de um quadro de diabetes mellitus dependente de insulina. Este fato fez com
que o uso da pentamidina em alguns países, como a Índia, fosse completamente
abandonado (Sundar & Chatterjee, 2006).
A anfotericina B, um antibiótico macrolídeo antifúngico, é uma outra opção em
casos de resistência ao antimoniato. Originalmente desenvolvida como fungicida,
mostrou ser um efetivo leishmanicida, mas apresenta um dos maiores índices de
toxicidade aguda, necessitando, por isso, ser cuidadosamente administrado. Sua ação
leishmanicida foi demonstrada no início da década de 1960 e é atribuída a sua afinidade
pelo ergosterol e por causar o efluxo de cátions e ânions pela formação de poros que
acabam resultando na lise celular. Sua toxicidade pode levar a quadros de febre alta,
tromboflebites e, ainda, miocardite, hipocalemia e disfunção renal, o que faz com que o
paciente precise ser hospitalizado para a devida monitoração (Murray e cols., 2005;
Sundar & Chatterjee, 2006).
Modelos experimentais
A escolha de um modelo experimental para o estudo da leishmaniose precisa
envolver determinados parâmetros que abrangem a boa reprodução do quadro clínico e
fatores patológicos e imunológicos observados em humanos expostos à Leishmania spp.
Por isto, são considerados bons modelos de análise camundongos, hamsters e cães. Em
estudos de desenvolvimento de vacinas, o modelo murino tem a vantagem de gerar
resultados mais rápidos e de ser de manuseio mais simples se comparado a estudos com
cães (Garg & Dube, 2006). No caso do hamster, que é o modelo de leishmaniose
visceral mais parecido com o homem, são verificadas algumas limitações, uma vez que
28
existe uma baixa disponibilidade de reagentes imunológicos no mercado e os existentes
possuem altos custos (Melby e cols., 2001a). Estudos com modelo murino, que usam
em grande parte o camundongo BALB/c, pela sua conhecida susceptibilidade à infecção
por Leishmania, permitem a caracterização de mecanismos imunológicos envolvidos na
resposta ao parasito. Neste modelo, o baço é considerado um sítio de infecção crônica
por L. chagasi enquanto o fígado, após determinado tempo de infecção, pode alcançar
uma diminuição gradativa da carga parasitária (Wilson & Weinstock, 1996; Wilson &
Streit, 1996).
Apesar de o camundongo ser um modelo experimental bastante usado em
estudos de leishmaniose visceral, uma dificuldade existente é o uso de uma via de
inoculação que reproduz a infecção natural. Em condições naturais, o inseto vetor
deposita de 10 a 1000 formas promastigotas metacíclicas na derme do hospedeiro
enquanto, nos modelos experimentais, a inoculação é feita por via subcutânea ou
intravenosa, usando uma grande quantidade de formas promastigotas (1 x 107). Devido a
isto, recentemente, tem-se testado um modelo de inoculação intradérmica para
estabelecimento da doença crônica em camundongos BALB/c. Este modelo, que ainda
apresenta resultados variáveis, servirá como uma importante ferramenta no
desenvolvimento de futuras vacinas contra a leishmaniose visceral (Garg & Dube,
2006).
Vacinas: definição e tipos
A vacinologia é uma ciência que estuda a diversidade de patógenos e de
mecanismos envolvidos com o sistema imunológico na busca pela prevenção de várias
doenças. Através dela é possível elaborar formulações que podem modular a resposta
imune humana e prevenir ou curar doenças. Muitos estudos e descobertas neste ramo já
serviram para aprimorar a análise do processamento e apresentação de antígenos e a
caracterização dos alvos na resposta imunológica (Brusic e cols., 2005). Muitas vacinas
têm ações efetivas e são utilizadas hoje como ferramentas fundamentais no controle de
determinadas doenças como poliomielite, tétano, hepatites A e B, dentre outras. Além
disso, outras doenças importantes vêm sendo alvos de grandes estudos e pesquisas,
29
como a leishmaniose, a malária, a hepatite C e a infecção pelo HIV, e permanecem na
espera por vacinas efetivas (Weiner & Kennedy, 1999).
A proteção induzida pelas vacinas ocorre pela indução de respostas imunes
humoral e/ou celular auxiliar e citotóxica e, ainda, pela formação de células de
memória. A resposta humoral, exercida por linfócitos B, atua sobre os patógenos que se
encontram do lado de fora da célula. Estas células B secretam anticorpos que atuam
neutralizando e marcando os patógenos para a destruição por outros componentes do
sistema imune. A resposta celular se baseia na ativação de células T auxiliares ou
citotóxicas. A APC infectada apresenta peptídeos protéicos do patógeno na sua
superfície e pode ser responsável pela ativação de células T auxiliares produtoras de
citocinas e de células T citotóxicas que irão destruir a célula infectada. Além desta
ativação do sistema imunológico, células de memória são ativadas e podem continuar
agindo no futuro (Weiner & Kennedy, 1999).
As vacinas usadas atualmente incluem as vacinas tradicionais e as vacinas
genéticas. As vacinas tradicionais, já estudadas há várias décadas, podem ser
constituídas por patógenos mortos, atenuados ou por antígenos isolados de agentes
infecciosos. As vacinas genéticas, por sua vez, incluem vacinas constituídas de DNA de
patógenos ou de suas proteínas recombinantes. Atualmente, existem em uso várias
vacinas tradicionais, como a vacina contra hepatite A e a injetável para pólio, que
utilizam patógenos mortos e as vacinas contra o sarampo, caxumba, rubéola e a oral
para pólio, compostas por patógenos atenuados (Weiner & Kennedy, 1999).
As vacinas tradicionais constituídas por antígeno dos agentes infecciosos são
capazes de induzir respostas imunológicas humoral e celular importantes, no entanto, os
antígenos não são interiorizados pelas células-alvos do hospedeiro, não ativando, assim,
linfócitos T citotóxicos. Já nas vacinas constituídas por patógenos atenuados, ocorre a
penetração dos patógenos nas células-alvo, ativando respostas humoral e celular,
inclusive de linfócitos T citotóxicos (Weiner & Kennedy, 1999; van Oirschot, 2001).
Como as vacinas tradicionais têm por objetivo tipos de respostas imunológicas
diferentes, elas são comumente utilizadas em associação a adjuvantes que fortalecem e
direcionam a estimulação desta resposta imune específica (Gluck & Metcalfe, 2002).
As vacinas genéticas, por outro lado, apresentam constituição diferente das
tradicionais e são capazes de induzir respostas protetoras de células T citotóxicas e
30
auxiliares e, ainda, uma imunidade humoral (Alarcon e cols., 1999). O modelo mais
estudado é constituído por plasmídeos, pequenas moléculas de DNA circular,
denominados minicromossomos, presentes em muitas bactérias como elementos
genéticos não ligados ao cromossomo principal. Os plasmídeos se replicam de forma
autônoma, ou seja, independente da multiplicação celular, dando origem a várias
moléculas. Nas vacinas, estes plasmídeos são alterados a fim de conterem genes
específicos de uma ou mais proteínas antigênicas provenientes dos patógenos em
questão (Weiner & Kennedy, 1999). Para que estes plasmídeos sirvam como vetores,
eles devem ser constituídos de um forte promotor para a expressão ótima em células
eucariotas, como o promotor do citomegalovírus (CMV), uma origem de replicação que
permita seu crescimento em bactérias e um gene de resistência a um antibiótico. Uma
característica importante do plasmídeo é a presença de seqüências nucleotídicas
específicas que têm papel crítico na imunogenicidade das vacinas, as seqüências
citosina-fosfato-guanosina oligodeoxinucleotídeo (CpG ODN). Estas seqüências se
ligam ao receptor tipo Toll – 9 (TLR-9) presente em macrófagos e células dendríticas, o
que permite que elas ajam como importantes adjuvantes nos processos de vacinação,
pois elas induzem a produção de citocina IL-12, que ativa a produção de IFN-γ
(Gurunathan e cols., 1997). O plasmídeo pCI-neo é um exemplo de forte vetor utilizado
em transfecções (Suarez & Schultz-Cherry, 2000). Para a obtenção do DNA plasmidial,
tem sido usada exclusivamente a bactéria Escherichia coli transformante. Esta bactéria
tem um longo histórico de segurança em processos biotecnológicos, experimental e
industrial, apresentando uma série de vantagens como fonte de DNA plasmidial para
terapia gênica e obtenção de proteínas recombinantes.
Outro tipo de vacina genética envolve as vacinas constituídas de proteínas
recombinantes, que, por sua vez, são elaboradas pela tecnologia do DNA recombinante,
onde um vetor contendo o material genético do patógeno é capaz de induzir um
microrganismo a produzir a proteína codificada por parte da seqüência heteróloga de
DNA. Assim, a célula transformada é submetida a condições que facilitem sua
expressão levando à formação de grandes quantidades da proteína desejada que será
utilizada nos protocolos de vacinação (Gurunathan e cols., 1997; Seth e cols., 2006).
Cada um dos tipos existentes de vacinas apresenta suas características e
vantagens na indução da resposta imunológica, porém, em determinadas situações, a
31
ação gerada por um tipo específico não é suficiente para a prevenção de uma infecção.
Muitas vezes pode ser mais vantajoso associar dois ou mais tipos de vacinas para este
propósito, na formação de uma vacina multicomponente (Weiner & Kennedy, 1999).
Adjuvantes de vacinas
Os adjuvantes podem ser divididos em duas classes de acordo com sua origem.
A primeira classe abrange os adjuvantes exógenos e a segunda os adjuvantes
imunoestimulatórios, podendo ser compostos por substâncias químicas, algumas delas
extraídas de plantas, como a saponina, ou serem derivados de patógenos, como o
lipopolisacarídeo (LPS) e CpG ODN. O uso destes adjuvantes permite o direcionamento
da resposta imunológica, com o favorecimento de determinada função imune (Singh &
Srivastava, 2003).
O uso da saponina como adjuvante tem demonstrado um forte potencial como
uma nova estratégia para o desenvolvimento de vacinas. A saponina é um triterpeno
hidrossolúvel capaz de aumentar a proteção de vacinas veterinárias e vacinas humanas
contra citomegalovírus e HIV. Possui um grupo aldeído que é o principal responsável
pela estimulação da resposta do tipo 1 além do carbono-28 ligado a um oligossacarídeo
que é responsável pela estimulação de células T citotóxicas contra proteínas exógenas
(Santos e cols., 1997).
O uso da saponina com o antígeno ligante de fucose manose (FML) de L.
donovani foi avaliado na vacinação de camundongos Swiss contra a leishmaniose
visceral. Este trabalho demonstrou que a utilização da vacina FML-saponina gerou uma
resposta protetora significativa e específica com redução da carga parasitária no fígado e
alta produção de anticorpos específicos contra o parasito e de IL-12 (Santos e cols.,
2002). Na vacinação com a gp36, uma glicoproteína extraída de L. donovani,
juntamente com a saponina, foi verificada uma forte produção de anticorpos IgG, na sua
maioria IgG2a, e de IFN-γ, reduzindo, desta forma, a carga parasitária no fígado
(Paraguai-de-Souza e cols., 2001) e demonstrando a importância da saponina na
indução do sinal co-estimulatório.
32
Tipos de vacinas contra leishmaniose visceral
O desenvolvimento de vacinas pode ser dividido em cinco diferentes estágios, a
pesquisa, o desenvolvimento pré-clínico, o desenvolvimento clínico, o registro e a
avaliação pós-registro. Para vacinas contra a leishmaniose, tem havido muita atividade
nos campos de pesquisa e de desenvolvimentos pré-clínicos por agências e
universidades nacionais e internacionais, envolvendo vários antígenos considerados
como promissores candidatos (Khamesipour e cols., 2006). A obtenção de antígenos,
candidatos a vacinas contra leishmaniose visceral, tem sido conseguida graças ao
entendimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na proteção de animais
experimentais e do homem.
Os primeiros ensaios com Leishmania morta foram conduzidos no Brasil na
década de 70, onde foi desenvolvida uma vacina composta por formas promastigotas
mortas de cinco isolados de Leishmania destinada à prevenção da leishmaniose cutânea
americana (Mayrink e cols., 1979; Genaro e cols., 1996; Khamesipour e cols., 2006).
Esta composição foi simplificada para conter somente formas promastigotas mortas da
cepa PH8 de L. amazonensis (Mayrink e cols., 1999; Mayrink e cols., 2002). Esta
vacina foi testada na Colômbia (Velez e cols., 2000; Velez e cols., 2005) e no Equador
(Armijos e cols., 2004), pelo seu potencial profilático e, como adjuvante à
quimioterapia, no Brasil (Mayrink e cols., 2002).
Um estudo feito com o uso da vacina de antígeno particulado (Ag. Part.) de L.
chagasi, em camundongos BALB/c, com Corynebacterium parvum como adjuvante,
demonstrou uma proteção significativa no fígado em 2, 4 e 6 semanas após o desafio
com L. chagasi e, no baço, em 2 semanas. Demonstrou, ainda, uma produção
significativa de IFN-γ e de IL-4 pelos esplenócitos dos camundongos vacinados, quando
o desafio foi feito duas semanas após a última dose da vacina (Vilela e cols., 2002).
Além do uso de Ag. Part. do parasito, algumas proteínas de superfície se
tornaram um foco importante no estudo de vacinas. O FML está presente na superfície
de formas promastigotas e amastigotas da L. donovani e é um potente agente
imunogênico, em camundongos e coelhos, e um antígeno sensível e específico para
sorodiagnóstico na LV humana e canina (Palatnik-de-Sousa e cols., 1995). Uma
formulação com FML e saponina foi testada e demonstrou ser segura, imunogênica e
33
protetora em camundongos BALB/c e Swiss e em hamsters (Palatnik-de-Sousa e cols.,
1995). Num foco endêmico brasileiro de LVA humana e canina, foram realizados testes
utilizando esta vacina em cães e foram obtidos bons resultados com taxa de 92 a 95% de
proteção. Esta proteção induzida foi observada por mais de três anos e meio após a
vacinação sendo que a vacina, assim, foi capaz de promover uma forte resposta
protetora contra a leishmaniose visceral canina (Borja-Cabrera e cols., 2002). A
glicoproteína gp36, o antígeno principal do complexo FML, quando administrado
juntamente com a saponina em camundongos BALB/c desafiados com L. donovani,
induziu aumento na produção de IgG e redução significativa da carga parasitária
hepática (Paraguai-de-Souza e cols., 2001).
Outro tipo de imunização com proteína de superfície é o que envolve a proteína
A2, uma proteína presente em várias espécies de Leishmania capaz de induzir uma
potente resposta Th1. Esta imunização mostrou proteção contra a infecção por L.
donovani e por L. amazonensis, associada à produção de IFN-γ, forte resposta humoral e
reduzida internalização de amastigotas nos macrófagos, o que a torna uma forte
candidata a vacina contra LVA (Ghosh e cols., 2001; Coelho e cols., 2003).
O antígeno LACK é de grande interesse para o desenvolvimento de vacinas
devido ao seu papel na imunopatogênese da infecção experimental por Leishmania e
vem sendo estudado em alguns modelos de imunização na leishmaniose visceral (Melby
e cols., 2001b). A LACK é uma proteína citoplasmática de 36 kDa e 312 aminoácidos
da família de proteínas com repetições de triptofano-ácido aspártico e está presente nos
diferentes estágios do ciclo de vida das diversas espécies de Leishmania (Mougneau e
cols., 1995). Ela é uma proteína homóloga aos Receptores de Proteína Quinase C
Ativada (RACKs) e se localiza próximo ao cinetoplasto no citoplasma celular,
provavelmente ligada a complexos multiprotéicos, incluindo isoformas de proteína
quinase C citoplasmáticas, mas não a estruturas de membrana. Membros da família
LACK estão envolvidos em varias funções fisiológicas da célula eucariota, dentre elas,
a apoptose e a interação com seqüências de proteínas envolvidas na replicação de DNA
e síntese de RNA de L. infantum (Welburn & Murphy, 1998).
A eficácia da vacina de DNA LACK e da vacina contendo a proteína LACK
vêm sendo igualmente testadas. Os resultados demonstram que a vacina de DNA LACK
é capaz de induzir uma resposta protetora em camundongos BALB/c inoculados com L.
34
major, com alta produção de IFN-γ, e que esta proteção é maior que a induzida pela
vacinação com proteína LACK recombinante (Gurunathan e cols., 1997). Em um outro
estudo com o mesmo modelo, mas com inoculação de L. chagasi, feito em nosso
laboratório, não se observou proteção no baço ou no fígado, pela vacina pCI-neop36(LACK). No entanto, também neste caso, a produção de IFN-γ foi alta e
significativa, sugerindo a capacidade da vacina de DNA LACK de induzir uma resposta
imunológica (Marques-da-Silva e cols., 2005). Porém, em outro estudo feito com o
mesmo modelo murino vacinado com vírus Vaccinia modificado para expressar o
antígeno LACK e inoculado com L. infantum, foi encontrada uma proteção significativa
no linfonodo, no fígado e no baço, após um mês da vacinação, sendo que esta proteção
foi maior no linfonodo, com alta produção de IFN-γ (Dondji e cols., 2005). Um modelo
parecido de vacinação que utilizou DNA LACK e, como reforço, o vírus Vaccinia
recombinante com o mesmo gene do antígeno LACK conferiu proteção contra a
infecção com L. chagasi em 60% dos cães vacinados (Ramiro e cols., 2003).
Alguns antígenos expressos em amastigotas são também possíveis candidatos à
vacinação. Um deles é a enzima cisteína proteinase (CP), natural ou recombinante. Esta
enzima foi testada contra a leishmaniose visceral canina e demonstrou proteção na
medula óssea dos cães vacinados, com produção alta de IFN-γ pelas células
mononucleares do sangue periférico (Rafati e cols., 1997).
Uma questão que deve ser considerada quando se usa uma vacina constituída de
um único antígeno é a variabilidade genética do hospedeiro e do parasito. Dados obtidos
usando diferentes cepas de camundongos mostram que a variação genética do
hospedeiro tem uma influência determinante na evolução da doença (Childs e cols.,
1984). Parte dessa variação reflete diferenças na capacidade do hospedeiro de responder
a antígenos individuais. Um hospedeiro pode apresentar uma alta resposta a um
antígeno e uma resposta baixa a outro antígeno. Quando se estuda uma vacina a ser
usada numa população altamente heterogênea, como os seres humanos, provavelmente
será necessário o uso de diferentes antígenos para garantir uma resposta satisfatória pela
maior parte da população, o que reforça o uso de vacinas polivalentes em relação às
monovalentes (Handman, 2001).
35
Diante das observações feitas ao longo destes estudos, houve o aumento da
evidência de que uma vacina, para ser eficaz contra a LVA, precisa envolver a ativação
de resposta do tipo 1, com ativação de células T CD4+ e CD8+ e produção de citocinas
Th1, como o IFN-γ e a IL-12 (Ravindran & Ali, 2004).
Vacinas de DNA
A aplicabilidade do recurso genético, juntamente com novas tecnologias e com o
amplo conhecimento imunológico, permite a introdução de novas pesquisas no ramo de
vacinas, tanto no desenvolvimento de novas alternativas como no aperfeiçoamento
daquelas já existentes. Vacinas de DNA ou vacinas recombinantes têm ganhado
aceitação pública e científica como uma nova geração de vacinas (Shams, 2005). Estas
vacinas foram denominadas como a terceira geração de vacinas após a imunização
satisfatória de animais experimentais contra uma série de agentes infecciosos.
Dentre as várias vantagens que possuem, existe uma de grande importância, a
capacidade de induzir resposta protetora com participação de células T CD8+
citotóxicas, além das células T auxiliares e da resposta humoral e de memória (Alarcon
e cols., 1999). Outra vantagem das vacinas de DNA é a capacidade de indução de
expressão de proteínas com estrutura e conformação similares ou idênticas às das
proteínas selvagens. Isto não é obtido quando as proteínas são feitas in vitro em
sistemas de expressão recombinante ou quando são obtidas pela inativação química de
patógenos, onde elas podem ter conformações alternativas ou sofrer ligações cruzadas.
Além destas vantagens, podemos citar, ainda, a capacidade de induzir a formação de
anticorpos com ótima especificidade, o poder de gerar respostas imunológicas
prolongadas, a facilidade econômica, por ser possível a geração de grande quantidade da
vacina a baixo custo e em curto tempo e, ainda, a facilidade de armazenamento por
serem muito estáveis (Weiner & Kennedy, 1999).
No entanto, várias questões são levantadas com relação à segurança das vacinas
de DNA, como a possibilidade de integração ao genoma do hospedeiro, aumentando-se
o risco de formação de oncogenes ou a inativação de genes supressores de tumor, a
indução de resposta contra as células transfectadas, podendo resultar em doenças
36
autoimunes e a indução de tolerância, o que poderia prejudicar a resposta a outras
vacinas e infecções (Gurunathan e cols., 1997; Glenting & Wessels, 2005).
As vacinas de DNA já foram testadas pelas vias de vacinação subcutânea e
intramuscular. Em estudo realizado em nosso laboratório, a via intramuscular
demonstrou melhores resultados na indução de resposta contra leishmaniose visceral
(Marques-da-Silva
e
cols.,
2005).
Os
miócitos
parecem
ser
as
células
predominantemente transfectadas após a vacinação intramuscular (Donnelly e cols.,
1997; Donnelly e cols., 2000). Desta forma, a proteína é sintetizada dentro das células
musculares e apresentada associada a moléculas de MHC de classe I, que auxiliadas
pelas citocinas Th1 produzidas por linfócitos primados por APCs transfectadas, podem
ativar linfócitos T citotóxicos. Estes podem se transformar em células efetoras ou de
memória. Além disso, estas vacinas induzem células B a se transformarem em células
de memória ou em células produtoras de anticorpos (Weiner & Kennedy, 1999).
Por outro lado, outras APCs podem ser trasfectadas se tornando aptas a
apresentarem peptídeos da proteína LACK via moléculas de MHC de classe I e II para
células T CD8+ e T CD4+ e de ativá-las diretamente com co-estimuladores (Gurunathan
e cols., 2000).
Além desse mecanismo de transfecção direta de células somáticas, como os
miócitos, há um terceiro mecanismo pelo qual as vacinas de DNA são processadas e
apresentadas para gerar respostas imunes, o “cross-priming” ou apresentação cruzada
(Gurunathan e cols., 1997). Neste processo, as APCs capturam os miócitos e
apresentam seus antígenos, como peptídeos que sofreram degradação pelo proteassomo
e são retrotranslocados para o fagossomo, onde ficam dispostos para se ligarem a
moléculas de MHC de classe I. Este mecanismo permite uma nova ativação de
linfócitos citotóxicos (Schoenberger e cols., 1998; Gurunathan e cols., 2000). Os
fagossomos dos macrófagos demonstram possuir elementos e características necessários
para promoverem a apresentação cruzada de antígenos exógenos de forma autosuficiente (Houde e cols., 2003).
37
Vacinas e leishmaniose visceral
A vacinação humana contra a leishmaniose visceral é um meio importante no
controle da doença já que ela, ainda, acomete várias regiões do mundo, inclusive o
Brasil. Dentro deste contexto, algumas alternativas são a verificação de resposta
protetora por vacinas previamente testadas, porém com a aplicação de modificações na
metodologia, e/ou o uso de associações de vacinas possivelmente capazes de maior
indução de resposta imunológica e maior grau de proteção. A vacina de Ag. Part. vem
apresentando resultados significativos na proteção hepática e esplênica, especialmente
na proteção de curta duração, enquanto a vacina de DNA apresenta a importante
capacidade de gerar uma resposta imune abrangente. Desta forma, numa infecção que
necessita de uma forte resposta celular, a elaboração de uma vacina genética específica
capaz de estimular tal resposta pode aumentar muito a resposta gerada pela vacina
tradicional.
38
2. OBJETIVOS
39
2. OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar a capacidade protetora de vacinas de Ag. Part. de L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis isoladamente e de sua associação com a vacina de pCIneo-p36(LACK) em camundongos BALB/c, desafiados com L. chagasi.
Objetivos específicos
a) Verificar a carga parasitária no baço e no fígado dos camundongos desafiados quatro
e doze semanas após a última dose da vacina, para avaliação da capacidade de proteção
de curta e longa duração;
b) Verificar o padrão de citocinas (IFN-γ e IL-4) produzidos pela cultura de células
mononucleares do baço estimuladas ou não com Ag. Part. de L. chagasi em
camundongos desafiados quatro e doze semanas após a vacinação.
40
3. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
41
1- Vacinação 1ª dose:
Ag. Part. (L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis)
com saponina ou saponina ou
salina, via subcutânea (base da
cauda)
7 dias
2- Vacinação 2ª dose: mesmo
procedimento do item 3
7 dias
3- Vacinação 3ª dose: mesmo
procedimento do item 3
4 sem
12 sem
Desafio: 1 x 107 promastigotas
de L. chagasi M2682
1- Vacinação 1ª dose:
pCI-neo-p36(LACK) ou pCIneo ou PBS, via intramuscular
(coxa direita)
15 dias
2- Vacinação 2ª dose: mesmo
procedimento do item 1
15 dias
3- Vacinação 1ª dose:
Ag. Part. (L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis)
com saponina ou saponina ou
salina, via subcutânea (base da
cauda)
7 dias
4- Vacinação 2ª dose: mesmo
procedimento do item 3
5 sem - sacrifício
7 dias
- Carga parasitária
(baço e fígado)
- Dosagens (baço/ELISA):
IFN-γ e IL-4
5- Vacinação 3ª dose: mesmo
procedimento do item 3
4 sem
12 sem
Desafio: 1 x 107 promastigotas
de L. chagasi M2682
5 sem - sacrifício
- Carga parasitária
(baço e fígado)
- Dosagens (baço/ELISA):
IFN-γ e IL-4
42
4. MATERIAL E MÉTODOS
43
4. MATERIAL E MÉTODOS
Animal experimental
Durante os experimentos, foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas com
idade entre cinco e oito semanas. Estes animais foram adquiridos no Centro de
Bioterismo da Universidade Federal de Minas Gerais e submetidos a tratamento com o
vermífugo Ivermectina (CHEMITEC – São Paulo, SP, BR), durante dez dias, na
concentração de 0,01% em água potável nas garrafas e de 0,1% para borrifamento nas
gaiolas. Os animais foram mantidos em gaiolas convencionais no biotério da
Universidade Federal de Ouro Preto, sendo utilizados quatro camundongos por grupo
para cada etapa do experimento.
Figura 1. Camundongo BALB/c utilizado como modelo experimental.
Parasito e antígeno
Foram utilizadas formas promastigotas de Leishmania chagasi, cepa de
referência M2682 (MHOM/BR/1975/M2682), isoladas de adulto humano em 1975, no
estado da Bahia, Brasil, pelo Prof. Ralph Lainson do Instituto Evandro Chagas, da
Oraganização Mundial de Saúde, Belém, Brasil. Estes parasitos foram cultivados em
Meio Essencial Mínimo Dulbecco (DMEM) (HYCLONE – Logan, Utah, USA), pH 6,8,
suplementado com 20% de soro fetal bovino (SFB) (CULTILAB – Campinas, SP, BR)
previamente inativado a 56ºC/30 minutos, 2 mM de L-glutamina (GIBCOBRL – Life
Technologies – Grand Island, NY, MO, USA), 100 unidades/mL de penicilina G
44
potássica (USB CORPORATION – Cleveland, OH, USA), 0,05 mM de 2mercaptoetanol (PHARMACIA BIOTECH AB – Uppsala, Sweden), 25 mM de HEPES
(SIGMA – St. Louis, MO, USA), 0,1 mM de adenina (SIGMA – St. Louis, MO, USA),
0,0625% de hemina (SIGMA – St. Louis, MO, USA) e 5% de urina humana
previamente centrifugada a 250 xg/4ºC/10 min. Para o desafio, foram utilizadas formas
promastigotas de Leishmania chagasi, em final de fase logarítmica de crescimento, com
aproximadamente 8,0 x 107 Leishmania/mL (4,5 dias de cultura), com no máximo oito
repiques, para evitar a diminuição da virulência comumente observada após longo
tempo de cultura.
Foram utilizadas ainda formas promastigotas de Leishmania braziliensis, cepa
de referência M2903 (MHOM/BR/75/M2903) e de Leishmania amazonensis, cepa PH8
(IFLA/BR/67/PH8). Ambos os parasitos foram cultivados em Meio GRACE´S INSECT
MEDIUM (SIGMA – St. Louis, MO, USA), pH 6,5, suplementado com 20% de SFB
previamente inativado a 56ºC/30 minutos, 2 mM de L-glutamina e 100 unidades/mL de
penicilina G potássica (Scott, 1991).
Para a obtenção de antígeno particulado, as formas promastigotas do parasito,
em final de fase logarítmica de crescimento, foram submetidas à centrifugação a 1540
xg/4ºC/10 min seguido de duas lavagens em solução salina tamponada com fosfato
(PBS) 0,1 M, pH 7,2 esterilizada nas mesmas condições de centrifugação. O sedimento
foi ressuspendido em 10 mL de PBS, pH 7,2 esterilizado para a contagem do número
total de parasitos. Para esta contagem, foi feita a diluição 1:50 da solução em formalina
4% para contagem na câmara de Neubauer. Em seguida, o material foi centrifugado
novamente a 1540 xg/4ºC/10 min e o sedimento foi armazenado a -20ºC. Para o preparo
do antígeno, o material armazenado foi submetido a cinco seqüências de resfriamento
em nitrogênio líquido a -120ºC e aquecimento a 37ºC em banho-maria. Após a lise, o
material obtido dos parasitos foi ressuspendido em PBS, pH 7,2, numa concentração
equivalente a 5 x 107 parasitos/mL para posterior dosagem de proteínas pelo método de
Lowry (LOWRY e cols., 1951). Após a dosagem, o antígeno particulado foi
ressuspendido em PBS, pH 7,2 esterilizado de modo a se obter a concentração final de 1
mg/mL de proteínas. Estas alíquotas foram armazenadas a -70ºC até o uso. As etapas
que intercalaram as centrifugações foram realizadas com material em gelo e sob
condições assépticas.
45
Para o preparo do parasito destinado ao desafio, os parasitos foram centrifugados
a 1540 xg/4ºC/10 min, lavados por duas vezes com PBS esterilizado de pH 7,2, e a
seguir o material foi ressuspendido em meio RPMI (SIGMA – St. Louis, MO, USA),
pH 7,2 numa concentração final de 1 x 107 parasitos/dose. Para cada dose foram
utilizados 200 µL desta preparação, que foram inoculados na veia da cauda.
Quantificação de parasitos
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical para a extração de
baço e fígado, sendo o fígado dividido em dois fragmentos que foram pesados. O
fragmento menor, com cerca de 1/5 do tamanho total do órgão, foi utilizado para a
quantificação de parasitos pela técnica de diluição limitante modificada (Titus e cols.,
1985). O fragmento do fígado e o baço foram macerados separadamente em meio de
lavagem de células, pH 7,2, contendo DMEM preparado com 0,4% de bicarbonato de
sódio (VETEC – Rio de Janeiro, RJ) e suplementado com SFB previamente inativado a
56ºC/30 min a 1%, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL de penicilina G potássica e
25 mM de HEPES e a suspensão foi centrifugada a 42 xg/4ºC/1 min em tubo de fundo
cônico de 15 mL. O sobrenadante foi centrifugado a 1540 xg/4ºC/10 min e o sedimento
foi ressuspendido em 500 µL de DMEM 20% SFB, pH 6,8 para a posterior distribuição
em placa de fundo chato de 96 poços (NALGE NUNC International – Rochester, NY,
USA), em duplicata. Inicialmente, foram adicionado 200 µL da suspensão nos primeiros
poços e 160 µL de DMEM 20% SFB, pH 6,8 nos poços seguintes. Foram feitas, em
seguida, diluições sucessivas de 1:5 transferindo-se 40 µL de um poço para o poço
seguinte, até o décimo segundo poço. As placas foram incubadas em estufa a 25ºC por
14 dias. Ao final, foi calculado o número de parasitos por fragmento observando-se o
último poço que continha o parasito. Isto foi feito seguindo-se o critério de que o
primeiro poço continha 3 parasitos por fragmento, o segundo, 15, o terceiro, 75 e assim
por diante, num fator múltiplo de cinco. A seguir, foi calculado o número de parasitos
por órgão. O resultado foi expresso como a média dos logaritmos do número de
parasitos equivalente ao órgão total. O material utilizado foi mantido em gelo durante
todo o processo, sendo previamente esterilizado.
46
Obtenção de células mononucleares do baço para dosagem de citocinas (IFN-γγ e
IL-4)
O baço foi adicionado ao meio de lavagem de células e, a seguir, processado em
macerador de tecidos, como relatado anteriormente. A suspensão foi centrifugada a 170
xg/4ºC/10 min, em tubo de fundo cônico de 15 mL e o sedimento foi ressuspendido em
5 mL de solução de lise de hemácias, constituída de 17 mM de Tris base (GIBCO BRL
– Grand Island, NY, USA) e 144 mM de cloreto de amônio (SYNTH – São Paulo), pH
7,2, onde foi mantido por cerca de dois minutos. A seguir foram adicionados 8 mL de
meio de lavagem a estes tubos que seguiram para centrifugação a 170 xg/4ºC/10 min. O
sedimento obtido foi ressuspendido em 10 mL de meio de lavagem e as células desta
suspensão foram contadas. Para isso, as células foram diluídas em meio de lavagem e,
posteriormente, em solução de azul de Tripan a 0,4% (SIGMA-ALDRICH – St. Louis,
MO, USA) em PBS (1:50) e então contadas em câmara de Neubauer. Para cada poço, o
volume correspondente a 2,5 x 106 células foi centrifugado a 170 xg/4ºC/10 min e o
sedimento foi ressuspendido em 500 µL de DMEM 10% SFB, pH 7,2. Em placa de
fundo chato de 48 poços (NALGE NUNC International – Rochester, NY, USA), foram
preparados poços de amostra controle (células sem estímulo) e poços separados com
células às quais foi adicionado 50 µg/mL de Ag. Part. de L. chagasi. Em cada poço,
foram adicionadas 2,5 x 106 células, em 500 µL de DMEM 10% SFB, pH 7,2. As placas
foram incubadas em estufa a 37ºC/5% de CO2 por três dias e os sobrenadantes coletados
e armazenados a -20ºC para a dosagem de citocinas. Todo o material utilizado durante o
processo foi mantido em gelo, sendo previamente esterilizado.
Dosagens de IFN-γγ e IL-4
As dosagens de IFN-γ e de IL-4 foram feitas pelo método de ELISA de captura
em placas de fundo chato de 96 poços (Gral – São Paulo, SP; Greiner Bio-one –
Americana, SP) usando sobrenadantes de cultura coletados após 72 horas de incubação
(Scott, 1991; Chatelain e cols., 1992).
47
Para a dosagem de IFN-γ, a placa foi coberta com o anticorpo monoclonal
R46A2, obtido em nosso laboratório, na concentração de 2,5 µg/mL, e incubada à 4ºC
por 18 h para, em seguida, ser adicionada a solução de bloqueio (PBS com 5% SFB). A
placa foi lavada cinco vezes em solução salina contendo 0,05% de tween-20 (SIGMA –
St. Louis, MO, USA). A seguir, o sobrenadante de cultura e o padrão, Interferon gama
recombinante (rIFN-γ) murino (R&D Systems Inc. - Mineapolis, MN, USA), em várias
concentrações a partir de 1000 pg/mL, foram adicionados às placas. Após 2 horas de
incubação a 25ºC, a placa foi lavada cinco vezes e foi adicionado soro policlonal de
coelho anti-IFN-γ murino para o reconhecimento, com incubação por 1 hora a 25ºC.
Posteriormente, a placa foi lavada novamente por cinco vezes e, a seguir, foi adicionado
o anticorpo anti-IgG de coelho marcado com peroxidase como conjugado (ZYMED
LABORATORIES, Inc. - San Francisco, CA, USA). Após nova incubação por 1 hora a
25ºC, foi adicionado o cromóforo ácido 2,2’-bis-azino (3-etilbenzil-thiazol-6-sulfônico)
(ABTS) (SIGMA – St. Louis, MO, USA) juntamente com água oxigenada (H2O2) 30%
v/v em solução tampão citrato-fosfato, pH 4,0. A placa, então, foi incubada a 37ºC até
formação de cor. Para a interrupção da reação, foi adicionada uma solução contendo 1%
de lauril sulfato de sódio (SDS) (VETEC – Rio de Janeiro, RJ).
Para a dosagem de IL-4, foi utilizado o anticorpo 11B11, produzido em nosso
laboratório, na concentração de 5 µg/mL, para a cobertura da placa, que foi mantida em
estufa a 25ºC por 24 horas. Em seguida, foi adicionada a solução de bloqueio e a placa
foi incubada por 30 minutos a 25ºC. Após cinco lavagens sucessivas com solução salina
e 0,05% de tween-20, a suspensão de células contendo o sobrenadante de cultura foi
adicionada à placa, assim como o padrão de IL-4 recombinante (rIL-4) murina (R&D
SYSTEMS INC. - Mineapolis, MN, USA), na concentração inicial de 1000 pg/mL, e
incubados a 25ºC por 2 h. Após novas cinco lavagens, foi adicionado o anticorpo BVD6 biotinilado (1:1000), também produzido em nosso laboratório, para a detecção da
citocina. Após incubação por 1 h na mesma temperatura, a placa foi lavada cinco vezes
e a ela foi adicionado o conjugado contendo estreptoavidina-peroxidase (1:1000)
(ZYMED LABORATORIES, Inc. - San Francisco, CA, USA). A placa foi incubada
novamente a 25ºC por 1 h e lavada por dez vezes, para adição do substrato (ABTS e
48
H2O2 30% v/v em solução tampão citrato-fosfato, pH 4,0) e incubada a 37ºC até
obtenção de coloração. Por fim, a reação foi interrompida pela adição de SDS a 1%.
A leitura das placas em ambas as análises foi feita no leitor Emax Molecular
Devices (MOLECULAR DEVICES CORPORATION - Sunnyvale, CA, USA) sob o
comprimento de onda de 405 nm e os dados obtidos foram analisados pelo programa
SOFTmax® PRO 4.0 – Life Sciences Edition e a curva padrão submetida à regressão
linear.
Transformação e cultura de Escherichia coli
Os genes p36(LACK) foram obtidos por reação em cadeia da polimerase (PCR)
a partir de genes de L. chagasi e inseridos próximos a região promotora do CMV no
sítio EcoRI/XbaI do plasmídeo pCI-neo (sob colaboração da Profa. Dra. Ana Paula
Fernandes, Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da UFMG).
Este plasmídeo é um forte vetor de expressão em mamíferos e contém um gene que
codifica a neomicina transferase, sendo um marcador seletivo para células de
mamíferos, um íntron quimérico “downstream” que aumenta o nível de expressão
gênica, promotores de RNA polimerase T3 e T7 flanqueando o sítio múltiplo de
clonagem, que podem sintetizar RNA de maneira “sense” e “antisense” em relação ao
inserto, um sítio múltiplo de clonagem com sítios de enzimas de restrição “downstream”
ao promotor T7, um sinal de poliadenização SV40 que finaliza a transcrição pela RNA
polimerase II e leva à adição de 200 a 250 resíduos de adenosina ao final 3’ do
transcrito de RNA, aumentando a estabilidade e tradução deste. Possui, ainda, uma
origem de replicação do fago filamentoso f1 para geração de DNA de fita única
(ssDNA) encapsulado após infecção da bactéria transformada com um fago auxiliar
apropriado, um gene da neomicina fosfotransferase sob regulação de um promotor
SV40 que confere resistência pela inativação por fosforilação do antibiótico G418, um
aminoglicosídeo produzido por estreptomicetos capaz de induzir citotoxicidade pelo
bloqueio de tradução e um gene de resistência à ampicilina (Promega, 1996).
49
Figura 2. Plasmídeo pCI-neo. Estão representados, a partir do topo à direita: a região
promotora de CMV, o íntron quimérico, o sítio múltiplo de clonagem, o sinal de
poliadenização SV40, a origem de replicação do fago filamentoso f1, o promotor de
SV40, o gene da neomicina fosfotransferase e o gene da ampicilina.
A transformação de E. coli DH-5αΤΜ foi feita usando o plasmídeo pCI-neo
contendo o inserto do gene p36(LACK) e o plasmídeo sem inserto. Estas bactérias,
contendo os plasmídeos, gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Ana Paula Fernandes, do
Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da UFMG, foram
mantidas em meio Luria-Bertaine (LB) sólido, pH 7,0, constituído de 0,5% de cloreto
de sódio (NaCl) (SIGMA – St. Louis, MO, USA), 1% de triptona (ISOFAR – Rio de
Janeiro, RJ), 0,5% de extrato de levedura (BIOBRÁS – Montes Claros, MG) e 1,5% de
ágar bacteriológico (BIOBRÁS - Montes Claros, MG, BR) e, ainda, por D[-]-αaminobenzilpenicilina – sal dissódico (SIGMA - St. Louis, MO, USA) na concentração
final de 100 µg/mL. A placa de cultura foi estriada e incubada em estufa a 37ºC por 16
horas e, em seguida, armazenada a 4ºC até o máximo de 20 dias. Dentro deste tempo,
foi feita a retirada de seis colônias para expansão em meio LB líquido, pH 7,0,
constituído de NaCl a 0,5%, triptona a 1%, extrato de levedura a 0,5% (BIOBRÁS Montes Claros, MG, BR) e, ainda, por D[-]-α-aminobenzilpenicilina – sal dissódico
(SIGMA - St. Louis, MO, USA) na concentração final de 100 µg/mL (pré-inóculo). O
pré-inóculo foi incubado em agitador orbital a 160 rpm/37ºC/16 horas e expandido em
500 mL de meio LB líquido. Este inóculo foi também incubado nas mesmas condições
50
em agitador orbital a 160 rpm/37ºC/16 horas para a posterior extração e purificação do
DNA plasmidial.
Extração e purificação do DNA plasmidial
O processo de extração e purificação do DNA plasmidial foi feito conforme
protocolo modificado a partir do descrito no kit Wizard® Plus Maxipreps (PROMEGA
CORPORATION – Madison, WI, USA). Toda a cultura foi centrifugada a 5800
xg/23ºC/10 min e ao sedimento foi adicionado a uma solução de ressuspensão celular,
constituída de 50 mM de Tris-HCl (SYNTH – São Paulo, SP), pH 7,5, 10 mM de
EDTA (SYNTH – São Paulo, SP) e 100 µg/mL de RNase A (SIGMA – St. Louis, MO,
USA) e, em uma solução de lise, constituída de 0,2 M de NaOH (VETEC – Rio de
Janeiro, RJ) e SDS a 1%, sendo este material mantido sob agitação por inversão por 20
minutos. Em seguida, foi adicionada a solução de neutralização contendo acetato de
potássio 1,32 M, pH 4,8, mantendo-se o mesmo processo de agitação por 4 minutos. A
mistura foi centrifugada a 4000 xg/23ºC/20 min e o sobrenadante filtrado em papel de
filtro (Whatman qualitative 1). O volume obtido na filtração foi medido e, a ele, foi
adicionado metade do valor de isopropanol PA (SIGMA – St. Louis, MO, USA). Esta
mistura foi mantida sob agitação e o material deixado em repouso à temperatura
ambiente por 15 minutos. Após centrifugação a 4000 xg/23ºC/20 min, o sedimento
contendo o DNA extraído foi ressuspendido em 5 mL de etanol a 80% em água milli Q.
A suspensão foi centrifugada e ressuspendida em etanol a 80% uma segunda vez para
evitar a perda de DNA. Após a última centrifugação, o sobrenadante foi desprezado e o
tubo foi mantido invertido por aproximadamente 45 minutos, até a secagem do
sedimento. Este foi, então, ressuspendido em 2 mL de solução tampão TE 1X estéril,
contendo Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 e EDTA 1 mM.
A purificação do DNA plasmidial foi feita com filtro de seringa de 0,22 µm de
porosidade (TPP – Switzerland, Europe). Ao final, a solução purificada contendo o
DNA foi mantida a 4ºC pelo tempo máximo de seis meses.
51
Verificação da presença do gene p36(LACK) no DNA extraído
Depois de extraídas e purificadas, as amostras de DNA foram submetidas à
eletroforese em gel de agarose (Ultra PURE – Invitrogen Corporation – Carlsbad, CA,
USA) a 0,8% em tampão Tris Acetato EDTA (TAE) para a verificação da presença do
gene p36(LACK), do plasmídeo pCI-neo, além da certificação da ausência de RNA e de
bandas inespecíficas. Para isto, a 3 µg de DNA foram adicionados 0,2 µL de albumina
sérica bovina (BSA) 100X (PROMEGA CORPORATION – Madison, WI, USA), 1 µL
de cada uma das enzimas de restrição EcoR I e Xba I (PROMEGA CORPORATION –
Madison, WI, USA) e 2 µL de tampão “multi-core” 10X (PROMEGA
CORPORATION – Madison, WI, USA). O volume foi completado para 20 µL com
água milli Q e o material foi incubado em banho-maria a 37ºC/2 h. E, por fim, foram
adicionados à solução 4 µL de tampão de amostra Blue/Orange 6X Loading Dye
(PROMEGA CORPORATION – Madison, WI, USA). Para a amostra de DNA sem
digestão, foram adicionados 1,5 µg de DNA a 4,0 µL do tampão de amostra e o volume
foi completado para 24 µL com água milli Q. Para o padrão, foram utilizados 5 µL de 1
kb DNA Ladder (GIBCO BRL – Grand Island, NY, USA), juntamente com 2 µL do
tampão de amostra e água milli Q suficiente para completar 10 µL. O gel foi preparado
com agarose a 0,8% diluída em solução tampão TAE 1X, pH 7,2 (Tris base 4,84%,
acetato de sódio anidro 1,64% e EDTA dissódico dihidratado 0,39%). As amostras e o
padrão foram adicionados às canaletas do gel solidificado e a corrida foi feita a 50V/3 h
em solução tampão TAE 1X, pH 7,2 com 1 µL/mL de brometo de etídio (Ultra PURE –
GIBCO BRL – Grand Island, NY, USA) a 10 mg/mLh. Após a corrida, o gel foi
mantido sob agitação durante 10 minutos na solução de corrida e, então, visualizado em
luz ultravioleta (VILBER LOURMAT – Marine La Vallee, France, Europe).
Preparo do DNA para vacinação
As amostras de DNA purificadas (pCI-neo e pCI-neo-p36(LACK)) foram
submetidas à leitura de densidade ótica (D.O.) em espectrofotômetro (UV Visible
Spectrophotometer UV-1601 - Shimadzu) sob o comprimento de onda de 260 nm, o
qual detecta principalmente DNA e RNA, e de 280 nm, o qual detecta principalmente
52
proteínas (Sambrook e cols, 1989; Boyer, 1993). Foram consideradas satisfatórias para
utilização na vacina as relações de leituras 260/280 nm que fossem iguais ou superiores
a 1,70, equivalentes a baixa e aceitável contaminação com proteínas. Após a leitura, foi
feito o cálculo da concentração de DNA nas amostras, de acordo com a seguinte relação
(Boyer, 1993):
D.O. (260 nm) -------------------- 50 µg/mL = 0,05 µg/µL
D.O. amostra (260 nm) ---------- [DNA] µg/µL
Onde:
[DNA] µg/µL = concentração de DNA na amostra em µg/µL
D.O. amostra (260 nm) = densidade ótica da amostra a 260 nm
Foi traçada uma curva padrão para verificar a linearidade da reação, usando uma
solução com concentração de DNA previamente conhecida, 3000 µg/mL, a partir da
qual foram feitas várias diluições aquosas, as quais foram submetidas à leitura a 260 nm
em espectrofotômetro.
3,5
Absorbância (260 nm)
3
2,914
2,635
2,5
2
1,461
1,5
0,809
1
0,404
0,5
0,208
0,113
0,040
0,016
0,013
0
1/10
1/20
1/40
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
1/2560
1/5120
Concentração
Figura 3. Curva padrão para quantificação de DNA. Os pontos representam as
absorbâncias a 260 nm relativas a diferentes diluições de DNA a partir de uma solução
aquosa a 3000 µg/mL.
53
De acordo com a Lei de Lambert-Beer (Downes, 1972; Boyer, 1993) e com o
limite máximo confiável de leitura do aparelho, os valores aceitáveis de absorbância
ficaram entre 0,113 e 2,000, correspondentes à parte linear da curva. Desta forma, estes
valores foram considerados limites de leitura para os cálculos da concentração de DNA
nas amostras.
Depois da dosagem de cada amostra, o material foi concentrado (Speed Vac®
System Thermo Savant – ISS110) até a obtenção de uma amostra com concentração de
DNA superior a 3,0 µg/µL, equivalente ao limite mínimo aproximado para obtenção de
DNA na concentração desejada no protocolo de vacinas.
As soluções concentradas de ambos os plasmídeos foram utilizadas para o
preparo das vacinas com volumes correspondentes a 100 µg de DNA para cada dose de
vacina que foram completadas para 100 µL com PBS esterilizado, pH 7,2. Todo o
material utilizado durante o processo foi previamente esterilizado e as amostras e
vacinas foram mantidas em gelo.
Preparo do antígeno para vacinação
As alíquotas de antígeno particulado de L. chagasi M2682, L. braziliensis
M2903 e L. amazonensis PH8, com concentração final de 1 mg/mL, previamente
armazenadas a -70ºC, foram descongeladas à temperatura ambiente e utilizadas para o
preparo das vacinas de antígeno particulado. Para isso, a 100 µg de Ag. Part. foram
acrescentados 50 µg de saponina (saponin cat n. 8047-15-2, SIGMA – St. Louis, MO,
USA), sendo o volume completado para 200 µL com solução salina (Santos e cols.,
2002; Palatnik de Sousa e cols., 2004). O material utilizado durante o processo foi
previamente esterilizado e as amostras e vacinas foram mantidas em gelo.
Experimentos de imunização
Os experimentos de imunização com vacinas de antígeno particulado, associadas
ou não à vacina de DNA, foram realizados simultaneamente devido ao tempo necessário
para a finalização do ciclo de vacinas e à diminuição da margem de erros entre tempos
diferentes de experimentação.
54
Os animais que receberam somente a vacina de Ag. Part. foram vacinados com
três doses com intervalo de sete dias entre elas, por via subcutânea na região basal da
cauda (Santos e cols., 2002; Palatnik de Sousa e cols., 2004). Foram utilizados dois
grupos controles, o primeiro com administração de 200 µL de solução salina esterilizada
e, o segundo, de 100 µg de saponina diluída em um total de 200 µL de solução salina
esterilizada.
Quadro 1. Protocolo de vacinação da vacina de Ag. Part. de L. chagasi, L. braziliensis
ou L. amazonensis.
Grupo 1
3 doses de 200
µL de salina
(via sc)
Grupo 2
3 doses de 50 µg
de saponina em
200 µL de salina
(via sc)
Grupo 3
3 doses de 100
µg de Ag. Part.
de L. chagasi +
50 µg de
saponina em 200
µL de salina (via
sc)
Grupo 4
3 doses de 100
µg de Ag. Part.
de L. braziliensis
+ 50 µg de
saponina em 200
µL de salina (via
sc)
Grupo 5
3 doses de 100
µg de Ag. Part.
de L.
amazonensis +
50 µg de
saponina em 200
µL de salina
(via sc)
Os animais que receberam a associação das vacinas de DNA e de Ag. Part.
foram vacinados com duas doses da vacina de DNA pCI-neo-p36(LACK), por via
intramuscular, no músculo da coxa, com intervalo de quinze dias entre as mesmas.
Quinze dias após a última dose, os animais foram vacinados com uma das vacinas de
Ag. Part. (L. chagasi M2682, L. braziliensis M2903 ou L. amazonensis PH8) em três
doses com intervalos de sete dias entre as mesmas, por via subcutânea. Foi utilizado um
grupo controle de animais que recebeu 100 µL de PBS esterilizado, pH 7,2, via
intramuscular, durante a vacinação com DNA, e 200 µL de solução salina esterilizada,
via subcutânea, durante a vacinação com antígeno particulado. Um segundo grupo
controle de animais foi utilizado recebendo 100 µg de DNA pCI-neo diluídos em um
total de 100 µL de PBS esterilizado, pH 7,2, durante a primeira fase, e 100 µg de
saponina diluída em um total de 200 µL de solução salina esterilizada, na segunda fase
de vacinação.
55
Quadro 2. Protocolo de vacinação da associação da vacina de Ag. Part. de L. chagasi,
L. braziliensis ou L. amazonensis com a vacina de DNA pCI-neo-p36(LACK).
Grupo 1
Grupo 2
Grupo 3
Grupo 4
Grupo 5
2 doses de 100
µL de PBS
(via i.m.)
2 doses de 100
µg de
pCI-neo em 100
µL de PBS
(via i.m.)
3 doses de 50 µg
de saponina em
200 µL de salina
(via sc)
2 doses de 100
µg de pCI-neop36(LACK) em
100 µL de PBS
(via i.m.)
3 doses de 100
µg de Ag. Part.
de L. chagasi +
50 µg de
saponina em 200
µL de salina (via
sc)
2 doses de 100
µg de pCI-neop36(LACK) em
100 µL de PBS
(via i.m.)
3 doses de 100
µg de Ag. Part.
de L. braziliensis
+ 50 µg de
saponina em 200
µL de salina (via
sc)
2 doses de 100
µg de pCI-neop36(LACK) em
100 µL de PBS
(via i.m.)
3 doses de 100
µg de Ag. Part.
de L.
amazonensis +
50 µg de
saponina em 200
µL de salina
(via sc)
3 doses de 200
µL de salina
(via sc)
A via de administração da vacina de DNA foi escolhida baseado em Marquesda-Silva e cols,. (2005) que demonstraram que esta via era capaz de induzir a produção
de IFN-γ por esplenócitos de camundongos BALB/c em resposta a exposição ao
antígeno (Marques-da-Silva e cols., 2005). Desta forma, as injeções intramusculares
foram feitas perpendicularmente à região anterior mediana do músculo da coxa direita
(Sukumaran e cols., 2003) e as subcutâneas na região basal da cauda (Mayrink e cols.,
1979; Mayrink e cols., 2002; Santos e cols., 2002; Palatnik de Sousa e cols., 2004).
56
Subcutânea
Intramuscular
Figura 4. Sítios de vacinação subcutânea, na base da cauda, e intramuscular, na região
anterior mediana da coxa direita, em camundongo BALB/c.
Análise estatística
Os dados obtidos da quantificação de parasitos (logaritmados) e da dosagem de
citocinas foram submetidos à análise estatística. Os valores apresentaram distribuição
normal pelo teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov e distribuição homogênea
pelo teste de Levene, sendo assim submetidos ao Teste t de Student. Os dados de ambas
as análises foram apresentados como média, juntamente com o desvio padrão, e as
diferenças significativas foram aceitas para intervalo de 95% de confiança (P < 0,05)
(Sampaio, 1998).
57
5. RESULTADOS
58
5. RESULTADOS
Eletroforese das amostras de DNA extraídas e purificadas
As amostras de DNA extraídas e purificadas foram submetidas à análise em
eletroforese para verificação da presença do inserto p36(LACK), de possíveis bandas
inespecíficas ou de RNA (Figura 5 e 6). Para isto, estas amostras foram submetidas ou
não a corte com as enzimas de restrição EcoRI e XbaI e, em seguida, a eletroforese em
gel de agarose a 0,8%. A figura 5 demonstra, em A, o plasmídeo pCI-neo-p36(LACK)
fracionado pelas enzimas de restrição com o inserto de 939 pb relativo ao gene
p36(LACK) e, em B, o mesmo plasmídeo não digerido com as conformações espiralada
(banda inferior) e não espiralada (banda superior). A figura 6 mostra, em A, o
plasmídeo pCI-neo digerido pelas mesmas enzimas de restrição e, em B, o plasmídeo
pCI-neo íntegro com as conformações espiralada e não espiralada, banda inferior e
superior, respectivamente. Não foram observadas bandas inespecíficas ou a presença de
RNA e a presença do inserto do gene p36(LACK) foi confirmada no plasmídeo pCIneo-p36(LACK) digerido.
P
A A
A B
B B
500 pb
750 pb
939 pb
Figura 5. Eletroforese em gel de agarose a 0,8% do plasmídeo pCI-neo-p36(LACK).
(A) Plasmídeo pCI-neo-p36(LACK) digerido pelas enzima s de restrição EcoRI e XbaI,
(B) plasmídeo pCI-neo-p36(LACK) não digerido e (P) padrão de 1 kb DNA Ladder.
59
P A
B
A B
2000 pb
3000 pb
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 0,8% do plasmídeo pCI-neo. (A) Plasmídeo
pCI-neo digerido pelas enzimas de restrição EcoRI e XbaI, (B) plasmídeo pCI-neo não
digerido e (P) padrão de 1 kb DNA Ladder.
Curva de crescimento de L. chagasi em meio DMEM
A curva de crescimento de L. chagasi em meio de cultura DMEM foi
previamente estabelecida em nosso laboratório. Para isso, a cepa de Leishmania chagasi
M2682 foi cultivada em DMEM, pH 6,8 com 20% de SFB, 2 mM de L-glutamina, 0,05
mM de mercaptoetanol, 100 unidades/mL de penicilina G potássica, 25 mM de HEPES,
0,0625% de hemina e 5% de urina humana. Foi feita uma curva de crescimento do
parasito, sendo a cultura iniciada com a concentração de 1 x 105 promastigotas/mL
(Figura 7). A curva obtida demonstrou que com 112 horas foi atingido o final da fase
logarítmica de crescimento com aproximadamente 7,5 x 107 parasitos/mL.
60
1200
parasitos x 10
5
1000
800
600
400
200
0
0
50
100
150
200
Tempo (h)
Figura 7. Curva de crescimento de L. chagasi M2682 em DMEM 20% SFB, 0,0625%
hemina e 5% urina humana, pH 6,8. Cultura iniciada com 1 x 105 promastigotas/mL,
mantida em estufa a 25ºC.
Curva de crescimento de L. braziliensis e L. amazonensis em meio GRACE’s
As cepas M2903 de L. braziliensis e PH8 de L. amazonensis foram previamente
cultivadas em meio GRACE’s, pH 6,5 com 20% de SFB, 2 mM de L-glutamina e 100
unidades/mL de penicilina G potássica e as culturas foram iniciadas com a concentração
de 1 x 105 promastigotas/mL para a obtenção prévia das curvas de crescimento.
Padrão de infecção no baço e no fígado e produção de citocinas em camundongos
BALB/c inoculados com L. chagasi
A curva do padrão de infecção de camundongos BALB/c por L. chagasi foi
estabelecido previamente em nosso laboratório, de forma que os protocolos de
vacinação e desafio deste trabalho foram elaborados baseados neste padrão (Marquesda-Silva e cols., 2005e). Para a elaboração deste perfil de infecção, camundongos
BALB/c foram inoculados com 1 x 107 formas promastigotas de L. chagasi obtidas do
final de fase logarítmica de crescimento. A inoculação foi feita na veia da cauda e, após
2, 4 e 6 semanas, os animais foram sacrificados e a carga parasitária no baço e no fígado
e a produção de IFN-γ e de IL-4 pelos esplenócitos foram avaliadas.
61
O resultado obtido pela análise da carga parasitária demonstrou um pico no
fígado em 4 semanas após a infecção, com diminuição somente em 6 semanas. Já no
baço, houve aumento da carga parasitária 4 semanas de infecção quando comparado a 2
semanas, e ela se manteve em níveis mais baixos em relação ao fígado durante todo o
período de infecção analisado.
Avaliação da carga parasitária no baço e no fígado de camundongos após
vacinação com Ag. Part. de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis
Os protocolos de vacinação com Ag. Part. tiveram como objetivo a verificação
da capacidade protetora da vacina de L. chagasi e da duração da proteção e, ainda, a
capacidade de proteção cruzada das vacinas de L. braziliensis e L. amazonensis, pela
determinação da carga parasitária nos órgãos dos camundongos vacinados. Para a
verificação da carga parasitária no baço e no fígado, camundongos BALB/c foram
vacinados com Ag. Part. de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis e,
posteriormente, desafiados 4 ou 12 semanas após a última dose da vacina. Estes animais
foram sacrificados 5 semanas após o desafio para retirada do baço e do fígado, uma vez
que o pico de carga parasitária no fígado ocorre com 4 e 5 semanas de infecção
(Marques-da-Silva e cols., 2005d). Assim, a carga parasitária foi avaliada logo após o
pico observado no fígado.
Os resultados obtidos demonstraram que camundongos vacinados com Ag. Part.
de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis e desafiados 4 semanas após a
vacinação apresentaram uma diminuição da carga parasitária esplênica estatisticamente
significativa com 5 semanas de infecção em comparação com o grupo inoculado com
salina (Figura 8A). No entanto, somente as vacinas de Ag. Part. L. chagasi e L.
amazonensis induziram proteção esplênica significativa em comparação ao segundo
grupo controle (saponina). Por outro lado, camundongos desafiados 12 semanas após a
vacinação não apresentaram diminuição da carga parasitária esplênica estatisticamente
significativa em relação ao grupo salina (Figura 8A e 8B).
62
A
Salina
Saponina
a,b
Ag. Part. L. chagasi
a
Ag. Part. L. braziliensis
a,b
Ag. Part. L. amazonensis
B
Salina
Saponina
Ag. Part. L. chagasi
Ag. Part. L. braziliensis
Ag. Part. L. amazonensis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
- Log do título de parasitos/baço
Figura 8. Carga parasitária no baço de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania. Camundongos vacinados com três doses de antígeno
particulado de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis, (A) desafiados 4 ou (B) 12
semanas após a vacinação com 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, i.v. Após 5
semanas do desafio, os camundongos foram sacrificados e o baço e o fígado foram
retirados para a quantificação de parasitos pela técnica de diluição limitante. As letras
indicam diferença significativa na carga parasitária em relação a camundongos do
grupo: a: salina. b: saponina. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as
barras representam a média do logaritmo +/- desvio padrão dos dados de três
experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student
(p<0,05).
Os resultados demonstraram ainda que camundongos vacinados com Ag. Part. L.
chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis e desafiados em 4 semanas após a última
dose da vacina apresentaram uma menor carga parasitária hepática comparativamente
ao grupo salina e ao grupo saponina (Figura 9A). A análise dos dados do fígado dos
camundongos vacinados com Ag. Part. de L. chagasi ou de L. amazonensis e desafiados
em 12 semanas mostrou que houve uma diminuição da carga parasitária em comparação
com o grupo salina (Figura 9B).
63
A
Salina
Saponina
a, b
Ag. Part. L. chagasi
Ag. Part. L. braziliensis
a, b
Ag. Part. L. amazonensis
a, b
B
Salina
Saponina
a
Ag. Part. L. chagasi
Ag. Part. L. braziliensis
a
Ag. Part. L. amazonensis
0
1
2
3
4
5
- Log do título de parasitos/fígado
Figura 9. Carga parasitária no fígado de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania. Camundongos vacinados com três doses de antígeno
particulado de L. chagasi, L. braziliensis e L. amazonensis, (A) desafiados 4 ou (B) 12
semanas após a vacinação com 1 x 107 promastigotas de L. chagasi, i.v. Após 5
semanas do desafio, os camundongos foram sacrificados e o baço e o fígado foram
retirados para a quantificação de parasitos pela técnica de diluição limitante. As letras
indicam diferença significativa na carga parasitária em relação a camundongos do
grupo: a: salina. b: saponina. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as
barras representam a média do logaritmo +/- desvio padrão dos dados de três
experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student
(p<0,05).
Avaliação da produção das citocinas IFN-γγ e IL-4 por esplenócitos de
camundongos vacinados com Ag. Part. de L. chagasi, L. braziliensis ou L.
amazonensis e desafiados com L. chagasi em 4 ou 12 semanas
Com o objetivo de avaliar o padrão de citocinas induzido pela vacinação,
camundongos BALB/c desafiados 4 ou 12 semanas após a última dose da vacina de Ag.
Part. de Leishmania foram sacrificados com 5 semanas e os esplenócitos foram obtidos
para a determinação das citocinas IFN-γ e IL-4. Estas células foram estimuladas com 50
µg/mL de Ag. Part. de L. chagasi ou permaneceram sem estímulo.
Os resultados demonstraram que a produção de IFN-γ foi significativa pelas
células de camundongos vacinados com Ag. Part. L. chagasi e desafiados 4 semanas
64
após a última dose da vacina, quando os esplenócitos foram estimulados com Ag. Part.
L. chagasi, em comparação com as células sem estímulo, demonstrando a capacidade de
produção da citocina na infecção com L. chagasi. Além disso, este grupo apresentou
aumento significativo na produção em comparação com os grupos salina e saponina
estimulados, demonstrando a capacidade da vacina em estimular a produção de IFN-γ
(Figura 10). No grupo vacinado com Ag. Part. L. braziliensis, a produção foi
significativa somente em comparação com as células sem estímulo, de forma que a
vacina não foi capaz de estimular a produção da citocina. Já no grupo vacinado com Ag.
Part. L. amazonensis, a produção foi significativa em comparação com as células sem
estímulo e, ainda, em comparação com o grupo salina estimulado, demonstrando a
capacidade de aumentar a produção de IFN-γ.
Ao se comparar o grupo vacinado e estimulado com Ag. Part. L. chagasi com os
grupos vacinados com Ag. Part. L. braziliensis ou L. amazonensis foi detectada uma
produção significativamente maior pelas células do primeiro grupo, demonstrando a
capacidade da vacina de Ag. Part. de L. chagasi em induzir uma produção de IFN-γ
maior que as outras duas vacinas testadas em resposta ao antígeno de L. chagasi.
65
90
a,b,c,e,f
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
80
70
IFN-gama (ng/mL)
60
a,b
50
a
40
30
20
10
0
Salina
Saponina
Ag. part. L.
chagasi
Ag. part. L.
braziliensis
Ag. part. L.
amazonensis
Figura 10. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com
antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi,
desafiados 4 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do desafio, os camundongos
foram sacrificados e o baço foi retirado para verificação da produção de IFN-γ por
ELISA em sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras indicam diferença
significativa na produção de IFN-γ em relação a: a: células sem estímulo. b:
esplenócitos estimulados do grupo salina. c: esplenócitos estimulados do grupo
saponina. e: esplenócitos estimulados do grupo vacinado Ag. Part. L. braziliensis. f:
esplenócitos estimulados do grupo vacinado Ag. Part. L. amazonensis. Foram utilizados
quatro camundongos por grupo e as barras representam a média +/- desvio padrão dos
dados de três experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo
teste t de Student (p<0,05).
A produção de IL-4 seguiu um perfil de produção diferente do obtido pelo IFNγ. As células dos grupos salina, saponina e Ag. Part. L. chagasi, estimuladas com este
mesmo antígeno, apresentaram produção significativa de IL-4 em comparação com as
células sem estímulo. Entre os grupos vacinados, somente o grupo Ag. Part. L. chagasi
apresentou um nível detectável de IL-4, porém, esta produção ainda assim foi
significativamente menor em comparação ao grupo salina. Já os grupos Ag. Part. L.
braziliensis e L. amazonensis, apresentaram um nível muito baixo de produção,
significativamente menor que os grupos controles e que o vacinado com Ag. Part. L.
chagasi. Este resultado demonstrou que as vacinas de Ag. Part. L. chagasi, L.
braziliensis e de L. amazonensis suprimiram a produção de IL-4 (Figura 11).
66
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
1200
a
IL-4 (pg/m L)
1000
a,b
800
a,b,e,f
600
400
200
b,c,d
b,c,d
0
Salina
Saponina
Ag. part. L.
chagasi
Ag. part. L.
braziliensis
Ag. part. L.
amazonensis
Figura 11. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi, desafiados
4 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do desafio, os camundongos foram
sacrificados e o baço foi retirado para verificação da produção de IL-4 por ELISA em
sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras indicam diferença significativa na
produção de IL-4 em relação a: a: células sem estímulo. b: esplenócitos estimulados do
grupo salina. c: esplenócitos estimulados do grupo saponina. d: esplenócitos
estimulados do grupo vacinado com L. chagasi. e: esplenócitos estimulados do grupo
vacinado com L. braziliensis. f: esplenócitos estimulados do grupo vacinado com L.
amazonensis. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as barras representam
a média +/- desvio padrão dos dados de três experimentos independentes. As análises
estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
Além disso, no desafio 12 semanas após a vacinação, a produção de IFN-γ pelos
grupos salina e saponina e pelos três grupos vacinados e estimulados foi significativa
em comparação às células sem estímulo. No grupo vacinado com Ag. Part. L. chagasi
foi encontrada uma produção significativamente maior em comparação com os grupos
salina e saponina estimulados e, ainda, com os grupos Ag. Part. L. braziliensis ou L.
amazonensis, de forma que, mesmo quando os animais foram desafiados 12 semanas
após a vacinação, a vacina de Ag. Part. L. chagasi foi capaz de induzir a produção de
IFN-γ (Figura 12).
67
120
a,b,c,e,f
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
IFN-gama (ng/mL)
100
80
60
a
a
a
a
40
20
0
Salina
Saponina
Ag. part. L.
chagasi
Ag. part. L.
braziliensis
Ag. part. L.
amazonensis
Figura 12. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com
antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi,
desafiados 12 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do desafio, os camundongos
foram sacrificados e o baço foi retirado para verificação da produção de IFN-γ por
ELISA em sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras indicam diferença
significativa na produção de IFN-γ em relação a: a: células sem estímulo. b:
esplenócitos estimulados do grupo salina. c: esplenócitos estimulados do grupo
saponina. e: esplenócitos estimulados do grupo vacinado com L. braziliensis. f:
esplenócitos estimulados do grupo vacinado com L. amazonensis. Foram utilizados
quatro camundongos por grupo e as barras representam a média +/- desvio padrão dos
dados de três experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo
teste t de Student (p<0,05).
A produção de IL-4 pelas células dos camundongos desafiados após 12 semanas
da vacinação somente foi significativa no grupo vacinado com Ag. Part. L. chagasi em
comparação com o mesmo grupo sem estímulo. Além disso, observou-se que nenhuma
das vacinas provocou alteração na produção de IL-4 (Figura 13).
68
500
a
450
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
400
IL-4 (pg/m L)
350
300
250
200
150
100
50
0
Salina
Saponina
Ag. part. L. chagasi
Ag. part. L.
braziliensis
Ag. part. L.
amazonensis
Figura 13. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com antígeno
particulado de Leishmania e estimulados ou não com antígeno de L. chagasi, desafiados
12 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do desafio, os camundongos foram
sacrificados e o baço foi retirado para verificação da produção de IL-4 por ELISA em
sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras indicam diferença significativa na
produção de IL-4 em relação a: a: células sem estímulo. Foram utilizados quatro
camundongos por grupo e as barras representam a média +/- desvio padrão dos dados de
três experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de
Student (p<0,05).
Avaliação da carga parasitária no baço e no fígado de camundongos após
vacinação com pCI-neo-p36(LACK) e Ag. Part. de L. chagasi, L. braziliensis ou L.
amazonensis
Camundongos BALB/c foram vacinados com a associação de duas vacinas, a
vacina de DNA pCI-neo-p36(LACK) e a vacina de Ag. Part. de L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis para que se fosse possível avaliar a capacidade e a
duração da proteção. Com a utilização deste protocolo, foi possível se comparar a
capacidade protetora e imunogênica da associação das vacinas com a vacina de Ag.
Part. administrada isoladamente. Para a determinação da carga parasitária nos órgãos,
camundongos vacinados foram desafiados 4 ou 12 semanas após a última dose da
vacina e, 5 semanas após o desafio, foram sacrificados para a retirada do baço e do
fígado.
69
Dados previamente obtidos no laboratório mostraram que a vacina pCI-neop36(LACK), quando administrada isoladamente, foi capaz de induzir a produção de
IFN-γ (mas não provocou alteração na produção de IL-4) e não foi capaz de proteger
contra a infecção por L. chagasi.
Neste estudo, camundongos vacinados com pCI-neo-p36(LACK) associado a
Ag. Part. L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis (pCI-neo(LACK)/ Ag. Part. L.
chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis) que foram desafiados 4 semanas após a
vacinação apresentaram uma redução significativa da carga parasitária esplênica em
comparação com ao grupo controle PBS/salina, mostrando a capacidade de proteção da
associação das vacinas (Figura 14A). Por outro lado, camundongos desafiados após 12
semanas da vacinação não apresentaram diminuição da carga parasitária esplênica
estatisticamente significativa (Figura 14B).
70
A
Salina
Saponina
a,b
Ag. Part. L. chagasi
Ag. Part. L. braziliensis
a
Erro!
a,b
Ag. Part. L. amazonensis
PBS/Salina
pCI-neo/Saponina
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi
c
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis
c
c
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
- Log do título de parasitos/baço
B
B
A
Salina
Saponina
Ag. Part. L. chagasi
Ag. Part. L. braziliensis
Ag. Part. L. amazonensis
PBS/Salina
pCI-neo/Saponina
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
- Log do título de parasitos/baço
Figura 14. Carga parasitária no baço de camundongos vacinados com pCI-neop36(LACK) e Ag. Part. de Leishmania. Camundongos vacinados com duas doses de
100 µg pCI-neo-p36(LACK) e três doses de 100 µg antígeno particulado de L. chagasi,
L. braziliensis ou L. amazonensis, desafiados (A) 4 ou (B) 12 semanas após a
vacinação. Após 5 semanas do desafio, os camundongos foram sacrificados e o baço e o
fígado foram retirados para a quantificação de parasitos pela técnica de diluição
limitante. As letras indicam diferença significativa na carga parasitária em relação a
camundongos do grupo: a: salina. b: saponina. c: PBS/salina. d: pCI-neo/saponina.
Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as barras representam a média +/desvio padrão do logaritmo dos dados de três experimentos independentes. As análises
estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
71
3,5
A carga parasitária foi analisada, ainda, no fígado dos animais vacinados. Foi
demonstrado que camundongos vacinados com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi,
quando o desafio foi feito 4 semanas após a vacinação, apresentaram diminuição
importante da carga parasitária hepática (Figura 15A). Esta diminuição foi
estatisticamente significativa quando comparada à carga parasitária do grupo PBS/salina
e do grupo pCI-neo/saponina, sendo, ainda, significativa em relação aos grupos
vacinados com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis ou L. amazonensis. Observouse, ainda, que o grupo pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi foi capaz de promover uma
redução estatisticamente significativa da carga parasitária hepática quando comparado
ao grupo vacinado com Ag. Part. L. chagasi isoladamente.
Além destes dados, observou-se que a carga parasitária foi menor nos grupos
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis ou L amazonensis em comparação com os
grupos controles PBS/salina e pCI-neo/saponina.
Por outro lado, a análise da carga parasitária no fígado dos camundongos
desafiados 12 semanas após a vacinação demonstrou que somente o grupo vacinado
com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi obteve uma redução significativa do número
de parasitos em comparação com o grupo controle PBS/salina (Figura 15B).
72
A
Salina
Saponina
a,b
Ag. Part. L. chagasi
a,b
Ag. Part. L. braziliensis
a,b
Ag. Part. L. amazonensis
PBS/Salina
pCI-neo/Saponina
c,d,e,f,g
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi
c,d
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis
c,d
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis
0
1
2
3
4
5
- Log do título de parasitos/fígado
B
Salina
Saponina
B
a
Ag. Part. L. chagasi
Ag. Part. L. braziliensis
Ag. Part. L. amazonensis
aa
PBS/Salina
a
pCI-neo/Saponina
c
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis
c
pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis
0
1
2
3
4
- Log do título de parasitos/fígado
Figura 15. Carga parasitária no fígado de camundongos vacinados com pCI-neop36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania. Camundongos vacinados com duas
doses de 100 µg pCI-neo-p36(LACK) e três doses de 100 µg de antígeno particulado de
L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis, desafiados (A) 4 ou (B) 12 semanas após
a vacinação. Após 5 semanas do desafio, os camundongos foram sacrificados e o baço e
o fígado foram retirados para a quantificação de parasitos pela técnica de diluição
limitante. As letras indicam diferença significativa na carga parasitária em relação a
camundongos do grupo: a: salina. b saponina. c: PBS/salina. d: pCI-neo/saponina. e:
pCI-neo(LACK)/Ag Part L. braziliensis. f: pCI-neo(LACK)/Ag Part L. amazonensis. g:
Ag Part L. chagasi. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as barras
representam a média +/- desvio padrão do logaritmo dos dados de três experimentos
independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
73
5
Camundongos vacinados com a vacina pCI-neo-p36(LACK) desenvolveram
uma lesão no sítio de aplicação da vacina (Figura 16). Esta lesão apresentou-se seca e
não ulcerada, permanecendo durante todo o tempo de infecção analisado, porém, com
redução gradativa de tamanho.
Figura 16. Lesão desenvolvida no sítio de vacinação intramuscular de pCI-neop36(LACK).
Avaliação da produção de citocinas IFN-γγ e IL-4 por esplenócitos de camundongos
vacinados com a associação de pCI-neo-p36(LACK) e Ag. Part. de L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis, desafiados com L. chagasi em 4 ou 12 semanas
Conforme descrito, esplenócitos de camundongos desafiados 4 ou 12 semanas
após a última dose do protocolo de vacinas foram obtidos para a determinação das
citocinas IFN-γ e IL-4. Estas células foram estimuladas com 50 µg/mL de Ag. Part. de
L. chagasi ou permaneceram sem estímulo.
A análise da produção de IFN-γ pelos esplenócitos obtidos de animais
desafiados 4 semanas após a vacinação demonstrou que nos três grupos vacinados
houve uma produção significativa de IFN-γ quando as células foram estimuladas com
antígeno de L. chagasi em relação as células sem estímulo (Figura 17). Além disso, foi
verificado que a vacinação com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi apresentou
capacidade indutora da produção de IFN-γ por ter apresentado nível significativo em
comparação com os grupos controle PBS/salina e pCI-neo/saponina. Além disso, esse
74
grupo apresentou uma produção mais alta que os grupos pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L.
braziliensis ou L. amazonensis estimulados. Já o grupo vacinado com pCIneo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis apresentou uma produção significativa quando
comparado ao grupo PBS/salina estimulado, demonstrando ter também uma capacidade
indutora da produção de IFN-γ, o que não foi demonstrado nos animais vacinados com
Ag. Part. L. braziliensis.
100
a,b,c,e,f
90
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
IF N -gam a (ng/m L)
80
70
a,b
60
a
50
40
30
20
10
0
PBS/Salina
pCI-neo/saponina
pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/Ag
part. L. chagasi part. L. braziliensis part L. amazonensis
Figura 17. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 4 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do
desafio, os camundongos foram sacrificados e o baço foi retirado para verificação da
produção de IFN-γ por ELISA em sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras
indicam diferença significativa na produção de IFN-γ em relação a: a: células sem
estímulo. b: esplenócitos estimulados do grupo PBS/Salina. c: esplenócitos estimulados
do grupo pCI-neo/saponina. e: esplenócitos estimulados do grupo vacinado com pCIneo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis. f: esplenócitos estimulados do grupo vacinado
com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis. Foram utilizados quatro camundongos
por grupo e as barras representam a média +/- desvio padrão dos dados de três
experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student
(p<0,05).
A análise da produção de IL-4 demonstrou haver uma produção significativa da
citocina pelas células dos animais dos grupos PBS/Salina, pCI-neo/saponina e pCIneo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi quando estas foram estimuladas com antígeno de L.
chagasi, em comparação com as células sem estímulo. Além disso, os grupos vacinados
75
com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis ou L. amazonensis apresentaram níveis
significativamente mais baixos da citocina em comparação com os dois grupos
controles, demonstrando a capacidade de supressão da produção de IL-4 (Figura 18).
700
600
a,e,f
a
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
a
IL-4 (pg/mL)
500
400
300
200
100
b,c,d
b,c,d
0
PBS/Salina
pCI-neo/saponina
pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/Ag.
part. L. chagasi
part. L. braziliensis
part. L.
amazonensis
Figura 18. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 4 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do
desfaio, os camundongos foram sacrificados e produção de IL-4 foi avaliada por ELISA
em sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras indicam diferença significativa na
produção de IL-4 em relação a: a: células sem estímulo. b: esplenócitos estimulados do
grupo PBS/salina. c: esplenócitos estimulados do grupo pCI-neo/saponina. d:
esplenócitos estimulados do grupo vacinado com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi.
e: esplenócitos estimulados do grupo vacinado com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L.
braziliensis. f: esplenócitos estimulados do grupo vacinado com pCI-neo(LACK)/Ag.
Part. L. amazonensis. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as barras
representam a média +/- desvio padrão dos dados de três experimentos independentes.
As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
A análise da produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos desafiados 12
semanas após a vacinação, por outro lado, demonstrou que os esplenócitos dos animais
dos grupos pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi ou L. amazonensis estimulados com
antígeno de L. chagasi apresentaram produção significativa em comparação com as
células sem estímulo (Figura 19). Já o grupo pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi
apresentou nível significativo de produção da citocina quando comparado aos dois
grupos controles e, ainda, aos dois grupos vacinados, que não foram capazes de induzir
76
esta produção, demonstrando uma maior capacidade indutora desta vacina da produção
de IFN-γ, mesmo quando o desafio foi feito 12 semanas após a última dose da vacina.
140
a,b,c,e,f
IFN-gama (ng/mL)
120
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
100
80
a
60
40
20
0
PBS/Salina
pCI-neo/saponina
pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/Ag.
part. L. chagasi
part. L. braziliensis
part. L.
amazonensis
Figura 19. Produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com
antígeno de L. chagasi, desafiados 12 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do
desafio, os camundongos foram sacrificados e a produção de IFN-γ foi verificada por
ELISA em sobrenadante de cultura de esplenócitos. As letras indicam diferença
significativa na produção de IFN-γ em relação a: a: células sem estímulo. b:
esplenócitos estimulados do grupo PBS/Salina. c: esplenócitos estimulados do grupo
pCI-neo/saponina. e: esplenócitos estimulados do grupo vacinado com pCIneo(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis. f: esplenócitos estimulados do grupo vacinado
com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis. Foram utilizados quatro camundongos
por grupo e as barras representam a média +/- desvio padrão dos dados de três
experimentos independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student
(p<0,05).
Já a análise da produção de IL-4, no desafio 12 semanas após a vacinação,
demonstrou que somente o grupo pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi estimulado com
antígeno de L. chagasi apresentou produção significativa em comparação com o mesmo
grupo sem estímulo (Figura 20). Além disso, nenhuma das vacinas testadas levou a uma
alteração no nível de IL-4.
77
600
a
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
500
IL-4 (pg/mL)
400
300
200
100
0
PBS/Salina
pCI-neo/saponina
pCI-neo(LACK)/Ag. pCI-neo(LACK)/ Ag pCI-neo(LACK)/Ag
part. L. chagasi
Part L. braziliensis Part L. amazonensis
Figura 20. Produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos vacinados com pCIneo-p36(LACK) e antígeno particulado de Leishmania e estimulados ou não com L.
chagasi, desafiados 12 semanas após a vacinação. Após 5 semanas do desafio, os
camundongos foram sacrificados e a produção de IL-4 foi verificada por ELISA em
sobrenadante de cultura. A letra indica diferença significativa na produção de IL-4 em
relação a: a: células sem estímulo. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as
barras representam a média +/- desvio padrão dos dados de três experimentos
independentes. As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
Após a análise da produção de IFN-γ e de IL-4 pelos espelenócitos dos animais
vacinados ou não com antígeno particulado isoladamente ou associado à pCI-neop36(LACK), foi possível se comparar os níveis produzidos de cada citocina, para
desafios realizados 4 ou 12 semanas após a vacinação.
A análise de IFN-γ demonstrou que as células estimuladas com antígeno de L.
chagasi dos animais vacinados com pCI-neo(LACK)/Ag. Part. L. chagasi e desafiados
12 semanas após a vacinação apresentaram nível maior de produção em comparação
com as células estimuladas dos animais igualmente vacinados, desafiados 4 semanas
após a vacinação. Esse grupo apresentou, ainda, produção significativa da citocina em
relação às células dos animais vacinados com Ag. Part. L. chagasi e desafiados 4
semanas após a vacina (Figura 21).
Estas comparações demonstraram que houve uma maior produção de IFN-γ
quando os animais foram desafiados 12 semanas após a vacinação e que a associação
78
das vacinas apresentou uma maior capacidade estimulatória de IFN-γ em comparação
com a vacina de antígeno particulado isoladamente.
140
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
a,g,h
IFN-gama (ng/mL)
120
100
a
a
a
80
60
40
20
0
4 semanas: Ag. part. 12 semanas: Ag. part.
4 semanas: pCIL. chagasi
L. chagasi
neo(LACK)/Ag. part.
L. chagasi
12 semanas: pCIneo(LACK)/Ag. part.
L. chagasi
Figura 21. Comparação da produção de IFN-γ por esplenócitos de camundongos após
vacinação com antígeno particulado de L. chagasi isoladamente ou associado ao pCIneo-p36(LACK). As letras indicam diferença significativa na produção de IFN-γ em
relação a: a: células sem estímulo. g: células do mesmo grupo de vacina desafiado em 4
semanas. h: células de grupo vacinado com Ag. Part. L. chagasi isoladamente e
desafiados em 4 semanas. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as barras
representam a média +/- desvio padrão dos dados de três experimentos independentes.
As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
A mesma comparação para IL-4 demonstrou que não houve diferença
estatisticamente significativa para nenhum dos grupos vacinados com Ag. Part. de L.
chagasi e pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi (Figura 22).
79
800
700
a
Sem estímulo
Estimulado com L. chagasi
a
IL-4 (pg/mL)
600
500
a
a
400
300
200
100
0
4 semanas: Ag. part. 12 semanas: Ag. part.
4 semanas: pCIL. chagasi
L. chagasi
neo(LACK)/Ag. part.
L. chagasi
12 semanas: pCIneo(LACK)/Ag. part.
L. chagasi
Figura 22. Comparação da produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos após
vacinação com antígeno particulado de L. chagasi isoladamente ou associado ao pCIneo-p36(LACK). A letra indica diferença significativa na produção de IFN-γ em relação
a: a: células sem estímulo. Foram utilizados quatro camundongos por grupo e as barras
representam a média +/- desvio padrão dos dados de três experimentos independentes.
As análises estatísticas foram feitas pelo teste t de Student (p<0,05).
80
6. SUMÁRIO
81
6. SUMÁRIO
•
Houve redução significativa da carga parasitária esplênica de camundongos
vacinados com Ag. Part. L. chagasi e L. amazonensis e desafiados 4 semanas
após a vacina em comparação com os grupos salina e saponina e de Ag. Part. L.
braziliensis em relação ao grupo salina.
•
Não houve redução significativa da carga parasitária esplênica de camundongos
desafiados 12 semanas após a vacinação com Ag. Part. L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis.
•
Houve redução significativa da carga parasitária hepática de camundongos
vacinados com Ag. Part. L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis e
desafiados em 4 semanas em comparação com os grupos salina e saponina.
•
Houve diminuição significativa da carga parasitária hepática de camundongos
vacinados com Ag. Part. L. chagasi ou L. amazonensis e desafiados em 12
semanas em comparação com o grupo salina.
•
Houve produção significativa de IFN-γ, após desafio em 4 ou 12 semanas, pelas
células de camundongos vacinados estimuladas com antígeno de L. chagasi em
comparação aos dois grupos controles.
•
Não houve produção significativa de IFN-γ nos animais vacinados com Ag. Part.
L. braziliensis, após desafio em 4 ou 12 semanas.
•
Houve produção significativa de IFN-γ nos animais vacinados com Ag. Part. L.
amazonensis em comparação com o grupo salina, após desafio em 4 semanas,
mas não houve produção no desafio em 12 semanas.
•
Houve supressão da produção de IL-4 por esplenócitos de camundongos
vacinados com Ag. Part. L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis, após
desafio em 4 semanas.
•
Não houve produção significativa de IL-4, no desafio em 12 semanas, em
nennhum dos grupos vacinados.
•
Houve redução significativa da carga parasitária do baço de camundongos
vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi, L. braziliensis ou L.
82
amazonensis, desafiados em 4 semanas, em comparação com o grupo
PBS/salina.
•
Não houve diminuição significativa da carga parasitária esplênica de
camundongos desafiados em 12 semanas com as associações das vacinas.
•
Houve redução significativa da carga parasitária, após desafio em 4 semanas, no
fígado de camundongos vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L.
chagasi quando comparada aos grupos PBS/salina e pCI-neo/saponina e, ainda,
ao grupo vacinado com Ag. Part. L. chagasi.
•
Houve redução da carga parasitária hepática, após desafio em 4 semanas, de
camundongos vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis ou
L. amazonensis quando comparado aos grupos PBS/salina e pCI-neo/saponina.
•
Houve diminuição da carga parasitária no fígado dos camundongos desafiados
após 12 semanas da vacinação somente com o grupo pCI-neo-p36(LACK)/Ag.
Part. L. chagasi em comparação com o grupo PBS/salina.
•
Houve produção significativa de IFN-γ, nos desafios 4 e 12 semanas após a
vcainação, no grupo pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi em comparação
com os dois grupos controles.
•
Não houve produção significativa de IFN-γ nos animais vacinados com pCI-neop36(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis.
•
Houve produção significativa de IFN-γ nos animais vacinados com pCI-neop36(LACK)/Ag. Part. L. amazonensis em comparação com o grupo PBS/salina,
no desafio em 4 semanas.
•
Não houve produção significativa de IL-4 pelos esplenócitos dos camundongos
vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi e desafiados em 4 ou
12 semanas.
•
Houve supressão da produção de IL-4 pelos esplenócitos dos animais vacinados
com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. braziliensis ou L. amazonensis, após
desafio em 4 semanas.
•
Camundongos vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi e
desafiados em 12 semanas apresentaram produção significativa de IFN-γ em
83
comparação com o mesmo grupo desafiado em 4 semanas e em comparação,
ainda, com o grupo Ag. Part. L. chagasi, desafiado em 4 semanas.
Quadro 3. Sumário dos resultados obtidos pelos protocolos de vacinações com Ag.
Part. de L. chagasi, L. braziliensis ou L. amazonensis associado ou não com vacina de
DNA pCI-neo-p36(LACK).
Valores estatísticos
significativos
(p < 0,05)
Proteção no fígado
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Proteção no baço
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Produção IFN-γ
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Supressão IL-4
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Proteção no fígado
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Proteção no baço
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Produção IFN-γ
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Supressão IL-4
Desafio em 4 sem
Desafio em 12 sem
Vacina de Ag. Part.
L. chagasi
Vacina de Ag.
Part. L. braziliensis
Vacina de Ag.
Part. L.
amazonensis
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Vacinas pCIneo(LACK)/Ag.
Part. L. chagasi
Vacinas pCIneo(LACK)/Ag.
Part. L. braziliensis
Vacinas pCIneo(LACK)/Ag.
Part. L.
amazonensis
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
84
X
7. DISCUSSÃO
85
7. DISCUSSÃO
Diante da importância da leishmaniose visceral humana como problema de
saúde pública é fundamental o desenvolvimento de estratégias de prevenção e
terapêuticas que reduzam a prevalência da doença no âmbito mundial. O
desenvolvimento de vacinas que tenham uma forte eficácia contra a leishmaniose
visceral tem sido feito por agências e universidades nacionais e internacionais,
envolvendo vários candidatos promissores (Khamesipour e cols., 2006). No entanto,
estes estudos têm demonstrado resultados de proteção parcial nos órgãos, ao invés de
completamente efetivos.
Muitos tipos de vacina estão em teste atualmente e cada um deles apresenta
características próprias na indução da resposta imunológica. Porém, o ramo da
vacinologia na leishmaniose tem abrangido tipos isolados de vacinas ineficazes na
prevenção da infecção, de forma que uma alternativa importante a ser considerada seria
a associação de dois ou mais tipos de vacinas para este propósito (Weiner & Kennedy,
1999).
Este trabalho teve como objetivo a avaliação do efeito da associação de duas
vacinas de tipos distintos, uma genética que codifica a proteína p36(LACK), proteína
presente em todas as espécies e formas evolutivas do ciclo de vida da Leishmania, e
uma tradicional composta por Ag. Part. do parasito. Esta associação foi comparada
ainda à vacina tradicional de Ag. Part. isoladamente quanto à intensidade e a duração da
resposta protetora na infecção por L. chagasi.
O uso do Ag. Part. de Leishmania ssp demonstrou, em estudos prévios, a
redução significativa da carga parasitária, com produção significativa de IFN-γ
(Mayrink e cols., 1979; Mayrink e cols., 1999; Mayrink e cols., 2002). Já a vacina de
DNA p36(LACK) apresenta uma imunogenicidade e capacidade de proteção também
importantes conforme já demonstrado por vários protocolos em modelo murino, na
grande maioria com L. major (Gurunathan e cols., 1997; Gonzalo e cols., 2001;
Marques-da-Silva e cols., 2005). Alguns estudos com modelo murino demonstraram
que a vacina foi imunogênica, mas não protegeu camundongos BALB/c contra infecção
por L. donovani (Melby e cols., 2001b) ou por L. chagasi (Marques-da-Silva e cols.,
86
2005). Um outro estudo, por outro lado, demonstrou a eficácia desta vacina de DNA
associada ao vírus Vaccinia na redução da carga parasitária no linfonodo de
camundongos BALB/c infectados por via intradérmica com L. infantum, com altos
níveis de IFN-γ e TNF-α (Dondji e cols., 2005). Esta vacina de DNA com capacidade
de induzir a síntese da proteína p36(LACK) também apresentou proteção contra L.
chagasi em cães (Ramiro e cols., 2003). Estes dados demonstram que a vacina de DNA
p36(LACK) possui capacidade protetora na leishmaniose, mas que o protocolo de
vacinação usado pode influenciar o resultado final.
Por isto, foram escolhidos protocolos que permitissem a análise comparativa de
vacinas de Ag. Part. isoladamente e associados à vacina de DNA, a fim de se estudar a
capacidade protetora e o perfil de produção de citocinas na infecção por L. chagasi.
Estes protocolos foram elaborados para permitir, ainda, a verificação de proteção
cruzada por duas diferentes espécies de Leishmania (L. braziliensis e L. amazonensis)
na infecção por L. chagasi.
A análise do efeito protetor da vacina de antígeno particulado mostrou que a
carga parasitária esplênica foi reduzida nos animais vacinados com Ag. Part. L. chagasi,
L. braziliensis ou L. amazonensis, quando o desafio foi feito 4 semanas após a
vacinação, porém não quando o desafio foi feito com 12 semanas. A carga parasitária
hepática foi também reduzida nos animais vacinados com Ag. Part. L. chagasi, L.
braziliensis ou L. amazonensis após desafio em 4 semanas e, nos vacinados com Ag.
Part. L. chagasi ou L. amazonensis quando o desafio foi feito em 12 semanas. Os dados
encontrados na proteção de curta duração vão de encontro aos achados nos estudos
realizados previamente que demonstram a capacidade protetora do antígeno particulado
em camundongos desafiados com diferentes espécies de Leishmania (Mayrink e cols.,
1979; Mayrink e cols., 1999; Mayrink e cols., 2002; Rhee e cols., 2002; Armijos e cols.,
2004).
Não é bem definido como a resposta celular pode persistir após a vacinação, mas
parece ter relação com a persistência de IL-12 como ativadora de um número
importante de células Th1 efetoras de memória em camundongos desafiados 12
semanas após a vacinação (Stobie e cols., 2000). Estudos que avaliaram IL-12 após a
vacinação com Ag. Part. atribuem a falta de proteção a uma possível quantidade
insuficiente da citocina, principalmente porque a proteção aumenta quando a citocina é
87
administrada como adjuvante e diminui em camundongos IL-12(-/-) (Kenney e cols.,
1999; Nylen e cols., 2001; Hernandez e cols., 2006).
O uso da vacina Ag. Part. L. chagasi foi capaz de induzir a produção
significativa de IFN-γ, no desafio 4 e 12 semanas após a vacinação, quando os
esplenócitos foram estimulados em cultura com L. chagasi. A produção desta citocina,
nestes casos, está diretamente associada à redução da carga parasitária obtida em ambos
os órgãos, quando o desafio foi feito em 4 semanas, e no fígado, quando o desafio foi
feito em 12 semanas. A produção de IL-4, por outro lado, no desafio 4 semanas após a
vacinação, se manteve em níveis baixos em comparação ao grupo controle salina,
demonstrando a capacidade de supressão desta citocina pela vacina, mas, no desafio
realizado 12 semanas após a vacinação, ela permaneceu em níveis baixos de produção
apesar de não ter sido suprimida.
A análise da capacidade de proteção cruzada demonstrou que o Ag. Part. L.
amazonensis foi capaz de gerar a redução significativa da carga parasitária no baço,
quando o desafio foi feito em 4 semanas, e, no fígado, quando o desafio foi feito em 4 e
12 semanas, seguindo um perfil parecido com o obtido pela vacina com antígeno de L.
chagasi. Além desta proteção, a vacina ainda induziu a produção significativa de IFN-γ
e a supressão de IL-4, no desafio feito em 4 semanas.
Este resultado foi difererente do encontrado com o uso da vacina de Ag. Part. L.
braziliensis. Neste caso, somente houve proteção de curta duração em ambos os órgãos,
com supressão da produção de IL-4, no desafio 4 semanas após a vacinação, mas sem a
produção significativa de IFN-γ.
Em um estudo de infecção de macacos Rhesus com várias espécies de
Leishmania foi demonstrado que quando estes macacos foram inoculados com
Leishmania do subgênero Viannia, esta infecção conferia proteção cruzada contra uma
re-infecção com espécies do subgênero Leishmania, sendo que o contrário não era
observado (Porrozzi e cols., 2004), demonstrando que a infecção por determinadas
espécies de Leishmania é capaz de proteger o hospedeiro de re-infecções por outras
espécies.
A diferença nos resultados encontrados na proteção cruzada por diferentes
espécies de Leishmania pode ser explicada pela classificação proposta por Lainson e
88
Chaw. Em 1972 e 1973, estes autores dividiram as várias espécies de Leishmania em
dois complexos, mexicana e braziliensis, de acordo com o desenvolvimento do parasito
em insetos vetores, em animais de laboratório (hamster) e em meio de cultura, estando a
L. amazonensis no complexo mexicana e, a L. braziliensis, no complexo braziliensis
(Lainson & Shaw, 1972; Lainson & Shaw, 1973). Esta classificação, no entanto, foi
revisada, em 1987, por não conter as espécies causadoras da forma visceral da doença.
Esta nova classificação, desde então amplamente adotada, se baseia nos caracteres
intrínsecos do parasito, através da divisão das espécies em dois subgêneros, o
Leishmania e o Viannia. Neste caso, a L. amazonensis pertence ao mesmo subgênero
Leishmania que a L. chagasi e, a L. braziliensis, ao subgênero Viannia. Esta
classificação identifica o subgênero Leishmania com um desenvolvimento limitado ao
estômago nas regiões anterior e posterior do inseto e o subgênero Viannia com o
desenvolvimento nas regiões posterior e anterior do estômago (Lainson e cols., 1987). A
grande similaridade na redução da carga parasitária gerada pela L. amazonensis em
comparação com a L. chagasi pode ser explicada por essa classificação, já que ambas as
espécies pertencem ao mesmo subgênero.
Apesar de alguns estudos demonstrarem que a IL-4 tem importância na resposta
a vacinas na leishmaniose visceral, fortalecendo a existência de um padrão misto
Th1/Th2 no modelo visceral (Ghosh e cols., 2001; Ramiro e cols., 2003; Stager e cols.,
2003), parece ser possível que níveis altos de IFN-γ (Rhee e cols., 2002c) ou a
supressão de citocinas Th2 reguladoras, como a IL-10 ou a própria IL-4 (Coelho e cols.,
2006) sejam capazes de induzir um nível significativo de redução da carga parasitária,
principalmente porque a IL-4 pode agir como reguladora da expressão de genes proinflamatórios nos macrófagos, suprimindo inclusive a síntese de IFN-γ (Hamilton e
cols., 1999).
Nosso estudo demonstrou que os níveis elevados de IFN-γ, obtidos após a
vacinação com Ag. Part. de L. chagasi e L. amazonensis, associados ou não ao pCI-neop36(LACK), foram capazes de induzir uma proteção significativa no baço e no fígado,
especialmente no desafio 4 semanas após a vacinação. Ao contrário, quando os
camundongos foram vacinados com Ag. Part. de L. braziliensis, associado ou não a
vacina de DNA, a proteção de curta duração no baço e no fígado foi obtida apesar do
89
nível baixo de IFN-γ. Neste caso, a supressão de IL-4 favoreceu a redução da carga
parasitária uma vez que sua ação imunosupressora foi bloqueada.
A IL-4 apresenta essa dicotomia com relação ao tipo de resposta gerada após sua
produção em resposta à infecção por Leishmania major. Como mencionado, a IL-4
pode ter a capacidade de estimular a diferenciação de células dendríticas imaturas em
células produtoras de IL-12, favorecendo a montagem de uma resposta Th1 e a
resistência à infecção por L. major de camundongos BALB/c (Launois e cols., 1997).
Por outro lado, neste mesmo modelo, sua produção por células T CD4+ Vβ4 Vα8 está
relacionada com o forte fenótipo de susceptibilidade, onde ela pode direcionar a
resposta para Th2 (Launois e cols., 1997). Desta forma, é possível que uma forte
resposta Th1, independente de Th2, esteja relacionada com a proteção na leishmaniose
visceral, conforme demonstrado por trabalhos com cães (Saldarriaga e cols., 2006) e
camundongos (Sukumaran e cols., 2003).
O estudo da associação das duas vacinas descritas, por sua vez, demonstrou que
houve uma redução significativamente importante da carga parasitária esplênica nos
animais vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi, L. braziliensis ou L.
amazonensis e desafiados 4 semanas após a vacinação. Porém, esta redução não foi
observada na análise da proteção de longa duração.
No entanto, a carga parasitária hepática ficou reduzida de forma importante nos
animais desafiados 4 ou 12 semanas após a vacinação com pCI-neo-p36(LACK)/Ag.
Part. L. chagasi. No desafio em 4 semanas, a proteção foi significativa em comparação
com os dois grupos controles, com os dois grupos vacinados e, ainda, com o grupo
vacinado com Ag. Part. L. chagasi isoladamente, demonstrando que, no fígado, a
proteção induzida pela associação das vacinas superou a proteção da vacina de antígeno
particulado testada isoladamente.
A proteção hepática encontrada, após desafio em 12 semanas, demonstra que há
a existência de uma memória imunológica devido a presença de células que exibem uma
resposta aumentada e mais rápida frente a uma repetida exposição a um antígeno (Gray,
2002). A vacinação com DNA permite esta síntese constante e prolongada da proteína,
permitindo a exposição da mesma por longos períodos (Hanke, 2006). Apesar da vacina
de DNA apresentar esta característica, uma proteção prolongada foi também observada
90
no fígado de animais vacinados com Ag. Part. L. chagasi ou L. amazonensis,
demonstrando que os resultados encontrados parecem não estar relacionados com a
vacina de DNA. A proteção prolongada foi observada anteriormente em camundongos
C57BL/10 vacinados separadamente com parasito morto de quatro espécies de
Leishmania (L. amazonensis, L. mexicana, L. guyanensis, L. major), com
Corynebacterium parvum como adjuvante, mesmo seis meses após o desafio
subcutâneo com L. amazonensis (Mayrink e cols., 2002).
Anteriormente, acreditava-se que as células de memória teriam a capacidade
intrínseca de sobreviverem por longo tempo, sem nenhum ou bem pouco estímulo
externo. Porém, hoje, estudos indicam a importância da persistência do antígeno para a
sobrevivência destas células. Substâncias antigênicas são mantidas nos tecidos linfóides
por muitos meses e, possivelmente, anos na forma de imunocomplexos na superfície de
células dendríticas foliculares (Fu e cols., 2000; Gollob e cols., 2005).
Os linfócitos T CD8+ parecem ter um papel importante na manutenção de uma
resposta prolongada após imunização com uma vacina de DNA, além de se mostrarem
importantes na imunidade primária em infecções de camundongos BALB/c com L.
major (Gurunathan e cols., 2000a). Um protocolo de vacinação utilizando DNA
p36(LACK) foi capaz de induzir a produção de IFN-γ por células T CD8+ e a proteção
prolongada em camundongos BALB/c. Foi observado, ainda, que a falta de células T
CD8+ eliminou a capacidade protetora da vacina, sugerindo o papel importante destas
células na resposta induzida pela vacina de DNA em infecção com L. major
(Gurunathan e cols., 1997). Este resultado foi confirmado, alguns anos depois, com o
uso da vacina LACK DNA no mesmo modelo de infecção murina. Nesse trabalho, a
vacina conferiu uma imunidade prolongada por ativar células T CD8+ e T CD4+,
mantendo uma alta concentração de células CD8+ e alta produção de IFN-γ (Mendez e
cols., 2001).
Três mecanismos parecem estar envolvidos na apresentação de antígeno pelas
vacinas de DNA. O primeiro ocorre pela transfecção direta da célula muscular onde a
proteína LACK será sintetizada, liberada no citosol, degradada pelo proteassoma, após
marcação com ubiquitina, para a apresentação de peptídeos via moléculas de MHC de
classe I para células T CD8+. Neste caso, sabe-se que o miócito não possui moléculas
91
co-estimulatórias, mas, apesar disto, ele é capaz de processar e apresentar peptídeos da
proteína LACK para células T CD8+ (Ulmer e cols., 1993; Gurunathan e cols., 2000b).
Este complexo peptídeo-MHC I pode se ligar ao receptor de células T (TCR) de
linfócitos citotóxicos que, sob o estímulo de citocinas Th1 produzidas por linfócitos T
auxiliares e/ou citotóxicos, previamente estimulados pela vacinação, podem se
proliferar e se diferenciar em linfócitos T CD8+ efetores ou de memória (Weiner &
Kennedy, 1999). O segundo mecanismo se baseia na transfecção de células dendríticas
que se tornam aptas a apresentarem peptídeos da proteína LACK via moléculas de
MHC de classe I para células T CD8+ e de ativá-las diretamente, já que estas células
expressam co-estimuladores (Gurunathan e cols., 2000). Em terceiro, o mecanismo de
apresentação cruzada ou “cross-priming”. Este terceiro processo consiste na fagocitose
de miócitos transfectados ou de proteínas ou peptídeos secretados por estes miócitos,
por células dendríticas locais, que apresentam os peptídeos da proteína LACK da célula
fagocitada para células T CD8+ (Schoenberger e cols., 1998; Gurunathan e cols., 2000)
garantindo, assim, tanto a manutenção de uma resposta por linfócitos T citotóxicos
quanto o prolongamento dessa resposta mesmo quando a célula muscular pára de
expressar o antígeno ou morre (Ulmer e cols., 1996; Donnelly e cols., 2000).
Além da proteção duradoura, a associação das vacinas pCI-neo-p36(LACK)/Ag.
Part. L. chagasi induziu a produção significativa de IFN-γ pelos esplenócitos
estimulados em cultura com L. chagasi. Estes dados se equiparam com a redução da
carga parasitária obtida no baço, após desafio em 4 semanas, e, no fígado, após desafio
em 4 e 12 semanas. A produção de IL-4, no entanto, não foi suprimida, mas se manteve
baixa após os desafios em 4 e 12 semanas.
No entanto, animais vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L.
braziliensis não apresentaram produção significativa de IFN-γ, sendo que a produção de
IL-4 foi suprimida no desafio 4 semanas após a vacinação. Estes animais apresentaram
proteção hepática e esplênica de curta duração.
Ao contrário, animais vacinados com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L.
amazonensis apresentaram uma produção significativa de IFN-γ, depois de serem
desafiados 4 semanas após a vacinação, enquanto a produção de IL-4 foi também
suprimida neste grupo, no desafio em 4 semanas.
92
A produção de IFN-γ, nos três grupos vacinados com a associação, se apresentou
de forma distinta nas avaliações feitas após desafio em 4 ou 12 semanas. Esta diferença
se mostrou igual ao encontrado por Marques-da-Silva e cols., 2005, onde a produção de
IFN-γ obteve índices menores após o desafio em 4 semanas em relação ao desafio em
12 semanas (Marques-da-Silva e cols., 2005).
De acordo com a diferença encontrada na produção de IFN-γ nos diferentes
tempos de infecção analisados, é possível que a diferença de idade dos camundongos,
mesmo não sendo tão grande, influencie na polarização da resposta imunológica frente à
infecção com L. chagasi, onde pode haver alteração da expressão de genes de citocinas
pelas células T CD4+, na medida em que os camundongos ficam mais velhos (Hobbs e
cols., 1993; Aoki e cols., 1995).
O aparecimento de lesão no local da aplicação da vacina de DNA pode estar
relacionado com uma possível ação citotóxica da proteína LACK que pode ter gerado a
morte celular de algumas células locais provocando lesão, apesar de não se ter registro
de tal possibilidade.
Após a análise individual das vacinas testadas se faz necessário o
estabelecimento de uma relação entre o grau de proteção nos órgãos e o nível de
produção das citocinas IFN-γ e IL-4. Esta comparação permitiu a verificação de que a
redução da carga parasitária obtida no desafio feito 4 semanas após a última dose da
vacina, no baço e, nos desafios em 4 e 12 semanas, no fígado se co-relacionou com a
produção de IFN-γ induzida pela vacinação com pCI-neo-p36(LACK)/Ag. Part. L.
chagasi ou com Ag. Part. L. chagasi administrada isoladamente, quando em ambos os
períodos foi obtida uma produção significativa desta citocina. A produção de IL-4, por
outro lado, seguiu um perfil diferente entre estas duas vacinas, sendo baixa durante todo
o período analisado, mas somente sendo suprimida pela vacina de Ag. Part. L. chagasi.
Nesta comparação, os dados finais demonstraram uma redução da carga parasitária no
fígado mais significativa no grupo vacinado com a associação das vacinas que no grupo
vacinado com Ag. Part., quando ambos os grupos foram desafiados em 4 semanas após
as vacinas. Assim, neste caso, o nível de proteção alcançado nos órgãos esteve mais
diretamente relacionado com a alta produção de IFN-γ do que com a redução da
produção de IL-4.
93
Portanto, o fato da vacina de Ag. Part. e da sua associação com a vacina de DNA
terem se mostrado indutoras de resposta do tipo 1 é suficiente para mostrar que o
direcionamento da resposta imunológica para Th1 e níveis significativos de proteção
esplênica e hepática foram alcançados.
Através
dessa
avaliação,
esta
vacina
multicomponente
(pCI-neo-
p36(LACK)/Ag. Part. L. chagasi) foi considerada satisfatória em comparação com a de
antígeno particulado administrada isoladamente. Apesar dos bons resultados obtidos
com a vacina de Ag. Part. que demonstraram estar relacionados à ação eficiente desta
vacina quando em uso isolado, conforme já demonstrado na prevenção da leishmaniose
cutânea (Mayrink e cols., 1979), a vacina de DNA demonstrou ser capaz de aumentar
ainda mais essa proteção. No entanto, a vacina de DNA ainda apresenta a possibilidade
de mecanismos, como a integração com o genoma do hospedeiro, que precisam ser
rigorosamente verificados antes de sua análise numa infecção humana.
Diante disso, algumas possibilidades devem ser consideradas quanto à falta de
proteção completamente efetiva das vacinas. Há a possibilidade de ter havido a indução
da produção de citocinas imunoregulatórias pelas vacinas testadas, como a IL-10. A IL10 age inibindo macrófagos e a expressão de moléculas de MHC de classe II,
impedindo a apresentação de antígenos para o linfócito T e a ativação das vias de
eliminação pelo próprio macrófago. Além disso, é capaz de inibir IL-12 e IFN-γ, de
forma que parece favorecer a infecção intracelular na leishmaniose visceral através da
supressão da resposta celular Th1 (Kopitar-Jerala, 2006; Steinke & Borish, 2006).
Em um estudo que utilizou camundongos BALB/c IL-10(-/-) inoculados com L.
donovani, observou-se que houve uma redução significativa do parasito sem inflamação
tecidual e que a produção de IL-12 e IFN-γ e, ainda, a resposta à quimioterapia com o
antimonial ficaram aumentadas em comparação com camundongos BALB/c selvagens
com o mesmo modelo de infecção (Murray e cols., 2002). Um outro estudo feito com
camundongos BALB/c vacinados com pCI-neo-p36(LACK) demonstrou ter havido a
produção significativa de IL-10 e a falta de uma redução da carga parasitária no baço e
no fígado após desafio com L. chagasi, apesar da alta produção de IFN-γ. Esta falta de
proteção gerada por esta vacina de DNA foi atribuída a IL-10 porque a proteína LACK
possui um epítopo para IL-10 (Marques-da-Silva e cols., 2005). Portanto, a atividade
94
imunoregulatória da IL-10 merece atenção especial na LV, de forma que Murray e cols.
sugerem o bloqueio desta citocina com anticorpos anti-IL-10 como uma alternativa
imunológica potencial ou, até mesmo, imunoquimioterápica (Murray e cols., 2002).
Além disso, algumas possíveis modificações podem influenciar na intensidade
da proteção final. Uma delas seria o uso de adjuvantes adicionais ou até mesmo de
associações de adjuvantes que possam ser capazes de levar a uma maior resposta
protetora. Há, ainda, um outro fator que deve ser considerado, a via de infecção
utilizada. Conforme demonstrado, a via de infecção pode alterar alguns parâmetros
associados à patogenia em modelo murino com BALB/c, como o nível de anticorpos
anti-Leishmania, o equilíbrio entre IFN-γ e IL-10 e desenvolvimento de granulomas
hepáticos (Carrion e cols., 2006). A via intravenosa, utilizada neste trabalho, necessita
de um número maior de parasitos para que a visceralização seja alcançada, o que é
diferente da infecção humana, que se caracteriza pela inoculação de aproximadamente
100 formas promastigotas metacíclicas do parasito (Mendez e cols., 2001b). Além
disso, o emprego da via intradérmica faz com que os parasitos sofram a ação de células
do sistema imunológico presentes no local da picada, antes de atingirem as vísceras, o
que não acontece quando se utilizada a via intravenosa. Neste trabalho, foi avaliada a
inoculação de parasitos pela via intradérmica numa concentração de 1 x 107
parasitos/mL, porém a visceralização não foi alcançada. Com o uso do modelo
intradérmico, é possível que a carga parasitária nos órgãos se altere, devido à passagem
do parasito por barreiras do sistema imunológico, e a proteção por vacinas seja ainda
mais significativa.
Após a tentativa de padronização da infecção intradérmica feita neste trabalho,
foi realizada um experimento com três diferentes quantidades de parasitos (1 x 105, 1 x
106 e 1 x 107 parasitos totais/mL). A visceralização no baço e no fígado foi alcançada
pela inoculação de 1 x 107 parasitos/mL na orelha, permitindo, assim, a padronização de
um novo modelo de infecção (Serafim e cols, 2006).
A busca por vários tipos de vacinas que sejam eficazes, seguras e de efeitos
duradouros contra a leishmaniose visceral deve ser mantida. Este estudo muito
acrescentou ao ramo da vacinologia de parasitoses por ter demonstrado a capacidade
imunogênica e parcialmente protetora da associação da vacina de DNA p36(LACK)
com vacinas de Ag. Part. do parasito em modelo murino. Os resultados permitem ainda
95
uma percepção de proteção cruzada com o uso de outros antígenos particulados
diferentes da espécie causadora da infecção, abrindo um espectro mais amplo nesse
ramo. Portanto, com o maior entendimento dos mecanismos imunológicos envolvidos
na resposta protetora da leishmaniose visceral, a adequação de um protocolo eficiente
para a visceralização da L. chagasi a partir de uma inoculação intradérmica e o uso de
associações de vacinas de várias gerações, assim como de adjuvantes, pode ser possível,
num futuro breve, a elaboração de vacinas realmente efetivas que permitam a
erradicação da doença.
96
8. CONCLUSÕES
97
8. CONCLUSÕES
A vacina de DNA pCI-neo-p36(LACK) associada a de Ag. Part. de L. chagasi
foi capaz de promover uma proteção significativa no fígado, quando os animais foram
desafiados 4 ou 12 semanas após a vacinação, e no baço, quando em desafio 4 semanas
após a vacinação, além de promover estímulo de células produtoras de IFN-γ, mas não
de IL-4, em camundongos BALB/c desafiados com altas doses do parasito (1 x 107
promastigotas L. chagasi) pela via endovenosa.
Camundongos vacinados com a vacina de DNA pCI-neo-p36(LACK) associada
as vacinas de Ag. Part. de L. braziliensis ou de L. amazonensis apresentaram perfis de
produção de IFN-γ e IL-4 diferentes, mas apresentaram o mesmo perfil de proteção dos
órgãos quando o desafio foi feito 4 semanas após a vacinação, através de um
mecanismo de proteção cruzado. No entanto, o nível de proteção induzido por essas
vacinas (proteção cruzada) foram menores que a proteção gerada pela associação da
vacina de DNA com antígeno de L. chagasi.
As vacinas de Ag. Part. isoladas foram também capazes de gerar proteção
significativa, especialmente a de L. chagasi que foi capaz de gerar uma proteção de
curta duração no baço e uma proteção de longa duração no fígado, com produção
significativa de IFN-γ, no desafio feito em 4 e 12 semanas após a vacinação, e supressão
de IL-4, quando o desafio foi feito em 4 semanas. Esta proteção, no entanto, foi menor
do que a proteção obtida pela associação das duas vacinas.
Apesar desses resultados encontrados com o uso da vacina de Ag. Part., o uso da
associação da vacina tradicional com a vacina de DNA apresentou-se satisfatório pela
ação estimulatória desta vacina multicomponente, apesar da necessidade por um melhor
entendimento sobre a ação de vacinas de DNA frente a uma infecção humana.
98
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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9 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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