UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Veterinária
Dissertação
Identificação de Marcadores Bioquímicos e
Proteínas de Fase Aguda no Líquido Amniótico de
Éguas no Momento do Parto
Ilusca Sampaio Finger
Pelotas, 2014
ILUSCA SAMPAIO FINGER
Identificação de Marcadores Bioquímicos e Proteínas de Fase Aguda no
Líquido Amniótico de Éguas no Momento do Parto
Dissertação apresentada a o P rograma d e
Pós-Graduação e m V eterinária da
Universidade F ederal de P elotas, co mo
requisito par cial à obt enção do t ítulo d e
Mestre em Ciências veterinárias.
Orientador: Dr. Carlos Eduardo Wayne Nogueira
Co-Orientadora: Dra. Bruna da Rosa Curcio
Pelotas, 2014
Universidade Federal de Pelotas / Sistema de Bibliotecas
Catalogação na Publicação
F498i Finger, Ilusca Sampaio
FinIdentificação de marcadores biquímicos e proteínas de
fase aguda no líquido amniótico de éguas no momento do
parto / Ilusca Sampaio Finger ; Carlos Eduardo Wayne
Nogueira, orientador ; Bruna da Rosa Curcio, coorientador.
— Pelotas, 2014.
Fin32 f. : il.
FinDissertação (Mestrado) — Programa de Pós-Graduação
em Medicina Veterinária, Faculdade de Veterinária,
Universidade Federal de Pelotas, 2014.
Fin1. Gestação. 2. Eletrólitos. 3. Proteinograma. 4.
Albumina. 5. Transferrina. I. Nogueira, Carlos Eduardo
Wayne, orient. II. Curcio, Bruna da Rosa, coorient. III. Título.
CDD : 636.1
Elaborada por Gabriela Machado Lopes CRB: 10/1842
Banca examinadora:
Profª. Dra. Bruna da Rosa Curcio
Prof. Dr. Augusto Schneider
Prof. Dr. Charles Ferreira Martins
Agradecimentos
À Deus, por me levar aonde a Sua graça esta para me proteger.
À minha família, por demonstrar que entre nós deve reinar a confiança, a fidelidade,
o respeito mútuo, para que o amor se fortifique e nos una cada vez mais. Sem vocês
eu não saberia o significado de permanecer em perfeita união, um para o outro e
todos para Deus e que nossas conquistas devem ser edificadas em cima de valores
humanos e cristãos.
Aos amigos de Itaqui, apesar da distância estão sempre juntos a mim, em meu
coração.
Às amigas do meu grupo do EMAÚS Pelotas – FIAT, que unidas em Cristo, são
meus exemplos de que um amigo ama em todos os momentos.
Aos colegas da clínica Albeitar e Millie Marchiori, pela amizade, apoio e
oportunidades de aprendizado.
As famílias Bálsamo Espinosa e Cremonti, sempre me recebendo de braços abertos
em suas casas neste período em Pelotas, como duas verdadeiras famílias.
Ao meu orientador, Carlos Eduardo Wayne Nogueira, pela paciência e ensinamentos
desde o período de graduação, um verdadeiro mestre.
À minha co-orientadora, Bruna da Rosa Curcio, pelo empenho, dedicação e
incentivo em meu caminho acadêmico.
À todo o grupo de trabalho ClinEq, ao Prof. Charles e todos as outras pessoas que
juntas se esforçaram para que esse trabalho fosse realizado.
Ao Carlos meu namorado, pela cumplicidade e companheirismo.
Resumo
FINGER, I lusca Sampaio. Identificação de marcadores bioquímicos e proteínas
de fase aguda no líquido amniótico de éguas no m omento do parto. 2014. 32f.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade
Federal de Pelotas, Pelotas.
A an álise d o l íquido a mniótico é útil p ara co mpreender o processo bi oquímico q ue
envolve a uni dade feto-placentária. O objetivo do pr esente es tudo foi i dentificar
marcadores bioquímicos e pr oteínas da fase ag uda no l íquido a mniótico de ég uas
saudáveis no m omento do p arto. A co leta do l íquido am niótico foi r ealizada pel o
método de amniocentese, assim que exposta a bol sa amniótica na primeira fase do
parto, através de punção direta. Foram utilizadas quarenta éguas gestantes, entre 5
e 21 an os de i dade, da r aça P uro S angue I nglês, na r egião S ul d o B rasil. A
composição bioquímica f oi avaliada e mpregando-se kits co merciais e o
proteinograma pela técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE).
Os resultados obtidos de m édia e erro pa drão da média p ara os componentes
bioquímicos foram: p H 7, 70+0,02, g licose 1, 22+0,08 ( mg/dL), fosfatase al calina
30,45+2,67 ( UI/L), g amma – GT 4 ,66+0,62 ( UI/L), uréia 3 3,59+2,34 ( mg/dL),
creatinina 5,10+0,59(mg/dL), sódio 54,35+2,51 (mEq/L), potássio 1,71+0,12 (mEq/L),
cloretos 72,09+5,94 (mEq/L), cálcio 3,86+0,23 (mg/dL), osmolaridade 277,32+17,76
(mOsml/L) e pr oteína t otal 2 6,04+4,39 ( mg/dL). A osm olaridade apr esentou
correlação com os íons sódio (R=0,60), potássio (R=0,55) e cá lcio (R=0,53). Foram
detectadas vinte e duas proteínas d e fase ag uda, s endo q ue as pr oteínas
inflamatórias albumina e transferrina foram identificadas em mais de 97% das éguas
avaliadas. F oi p ossível a i dentificação de m arcadores bioquímicos e pr oteínas
inflamatórias no l iquido amniótico de ég uas saudáveis a t ermo. S omente a
transferrina apr esentou-se di ferente entre o s grupos de i dade, c om c oncentrações
inferiores no grupo de éguas mais velhas.
Palavras-chave: Gestação. Eletrólitos. Proteinograma. Albumina. Transferrina.
Abstract
FINGER, Ilusca Sampaio. Identificação de marcadores bioquímicos e proteínas
de fase aguda no líquido amniótico de éguas no m omento do pa rto. 2014. 32f.
Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade
Federal de Pelotas, Pelotas.
The anal ysis of a mniotic fluid i s useful f or und erstanding t he bi ochemical pr ocess
involving the fetal-placental unit. The aim of this study was to evaluate biochemical
profile and acute phase proteins in the amniotic fluid of healthy mares during labor.
The co llection o f a mniotic fluid w as performed by am niocentesis method, onc e
exposed to the amniotic sac in the first stage of labor, by direct puncture. It has been
observed forty T horoughbred pr egnant mares in S outhern B razil. T he biochemical
composition was evaluated using commercially kits and proteinogram was measured
by el etrophoresis in p oliacrylamide g el ( SDS – PAGE). T he results of m ean and
standard error were: pH 7.70+0.02; glucose 1.22+0.08; alkaline phosphatase 30.45+
2.67 ( IU/L); g amma – GT 4 .6+0.62 ( IU/L), ur ea 3 3.59+2.34 ( mg/dL), cr eatinine
5.10+0.59(mg/dL), so dium 5 4.35+2.51 ( mEq/L); pot assium 1. 71+0.12 ( mEq/L),
chloride 72.09+5.94 ( mEq/L); ca lcium 3.86+0.23 ( mg/dL); os molarity 277. 32+17.76
(mOsml/L) and total protein 26.04+4.39 (mg/dL). The osmolarity was correlated with
ions sodium (R=0.60), potassium (R=0.55) and calcium (R=0.53). Twenty-two acute
phase protein were detected and that inflammatory proteins albumin and t ransferrin
have been i dentified i n m ore t han 97% o f t he ev aluated m ares. I t w as possi ble t o
identify bi ochemical markers and i nflammatory pr oteins in t he am niotic fluid o f
healthy f ull term mares. Only the transferrin presented among different age groups,
with lower concentrations in the older group of mares.
Keywords: Gestation. Electrolytes. Proteinogram. Albumin. Transferrin.
Lista de Tabelas
ARTIGO 1 Perfil Bioquímico e Proteínas de Fase Aguda no L íquido Amniótico
de Éguas Saudáveis
Tabela 1 M édia, Erro P adrão ( S.E), V alores Mínimo e M áximo das variáveis
analisadas no líquido amniótico no momento do parto (N=31)................. 22
Tabela 2 M édia, Erro P adrão das Concentrações, V alores Mínimo e M áximo do
Peso M olecular d as pr oteínas identificadas no l íquido am niótico no
momento do parto (N= 36). ......................................................................23
Lista de Abreviaturas
Da - Dálton
Gama – GT - Gama Glutamil Transferase
IgA - Imunoglobulina A
IgG - Imunoglobulina G
kDa - Kilo Dálton
Mcal - Mega Calorias
mEq/L - Mili Equivalente por litro
mg/dL - Miligramas por decilitro
MHz - Megahertz
mL - Mililitro
mm - Milimetro
mOsml/L - Miliosmol por litro
pH - Potencial hidrogeniônico
UI/L - Unidade internacional por litro
Sumário
1 Introdução .............................................................................................................. 10
2 Objetivos ................................................................................................................ 13
3 Artigo ...................................................................................................................... 14
4 Conclusão geral ..................................................................................................... 30
5 Referências ............................................................................................................ 31
1 INTRODUÇÃO
A região sul do Brasil concentra grande parte da criação de equinos da raça
Puro S angue I nglês do país, d esta forma, é i mportante o r econhecimento d os
principais
problemas q ue co mprometem es ta cr iação.
Assim c omo o
desenvolvimento de ferramentas que aumentem a produtividade da atividade. Sendo
que q ualquer di stúrbio oco rrido dur ante a g estação, n o per i-parto ou no per íodo
neonatal pode r esultar no co mprometimento d a sa úde do po tro, oca sionando
prejuízos aos criadores.
As condições que contribuem para perdas em gestações avançadas incluem
agentes infecciosos, anormalidades fetais ou placentárias, anormalidades estruturais
e do enças sistêmicas da g estante ( MACPHERSON, 20 07). A uni dade ú teroplacentária pode ser comprometida por processos de hipoxemia ou infecção, o que
interfere n a di fusão e ntre as circulações materna e fetal, r eduzindo o a porte d e
nutrientes e oxigênio para o feto e placenta. Em resposta a este processo, ocorre um
estresse fetal que pode dar origem a um retardo no crescimento intra-uterino – IUGR
(ROSSDALE, 2004). O IUGR é definido como o nascimento de um indivíduo com o
peso at é 10% abaixo do co nsiderado n ormal para a po pulação de aco rdo co m o
tempo de g estação ( KITCHEN, 1968), e r esulta de dan o celular e alterações
endócrinas, m etabólicas e da função ca rdiovascular. D e aco rdo c om a se veridade
destas alterações podem ocorrer morte fetal, aborto ou prematuridade (ROSSDALE,
2004). A ca usa m ais frequente d e per da d e g estação est á ass ociada a pl acentite
que, em ég uas, é no rmalmente ca usada p or i nfecção asce ndente v ia ce rvical. A
Placentite ascendente é a principal causa de parto prematuro em éguas, representa
mais de 30% dos partos prematuros e mortes neonatais dentro das primeiras 24h de
vida (MCKINNON, 2009).
11
Com a av aliação obs tétrica da égua dur ante a g estação e no p ós-parto,
torna-se possível r econhecer fatores que comprometem a g estação e a viabilidade
do f eto e do ne onato. Desta f orma, é possível intervir na ég ua ou no p otro
precocemente ao aparecimento de condição clínica.
O em brião eq uino se t orna um bl astocisto logo após migrar par a o co rno
uterino. Neste momento o em brião encontra-se no estádio de m órula ou blastocisto
inicial. As células do embrião compactado se dividem para formar uma mórula de 32
células, a q ual se c aracteriza por apr esentar um pequeno g rupo de cé lulas no
interior da estrutura rodeada externamente por outro grupo de células. Estas células,
localizadas externamente formarão o t rofoblasto. O qual posteriormente originará o
córion, q ue per manece co mo o co ntato d a pl acenta co m o end ométrio dur ante a
gestação ( GUINTER, 199 8). O âm nio é formado a p artir de dobras do t rofoblasto,
sendo co nstituído por doi s folhetos, e ntre e les há o es paço amniótico, co ntendo o
líquido amniótico (ASBURY; LeBLANC. 1993).
O l íquido am niótico r eflete o est ado materno f etal t anto p or su a composição
como pelo seu volume, tendo importância na boa evolução da gestação (DERTKIGIL
et al ., 20 05). A a nálise dest e fluido fetal é utilizada par a co mpreender o pr ocesso
bioquímico q ue env olve a uni dade feto-placentária, se ndo p ossível av aliar a
viabilidade fetal.
Em eq uinos existem pouco s trabalhos sobre o t ema, co ntudo j á foi
demonstrado q ue a v ariação n a co ncentração dos componentes bioquímicos do
fluido amniótico p ode t er uma r elação si gnificativa co m a sa úde fetal, podendo
indicar ce rtas enfermidades (KOCHHAR et al., 199 7).Em éguas da r aça P uro
Sangue Inglês, a osmolaridade apresentou uma correlação positiva com a i dade da
parturiente, e nzimas e el etrólitos do l íquido am niótico ( CURCIO et al ., 2012). E m
estudo realizado por Zanella et al. (2013) os autores identificaram que em éguas, de
acordo com o período gestacional, há uma variação na composição bioquímica tanto
do líquido amniótico quanto do líquido alantóide. A concentração de lactato no fluido
amniótico f oi avaliada no m omento do p arto em ég uas, podendo ser út il na
identificação dos n eonatos q ue necessitam de i ntervenção precoce, l ogo a pós o
nascimento ( PIRRONE et al ., 201 2). M ais estudos devem se r d esenvolvidos para
que o l íquido am niótico poss a se r u ma e ficiente ferramenta n a rotina cl ínica de
equinos.
12
Um g rande desa fio n a m edicina env olve a det ecção e m onitoramento da
inflamação, a qual resulta de diversas enfermidades (CRISMAN, 2008). Na busca de
marcadores precoces da inflamação e processos infecciosos em equinos, pesquisas
com proteínas da fase aguda da i nflamação estão sendo desenvolvidas também na
espécie equina (GARRY et al., 1996, HULTÉN et al.,1999). Com o estabelecimento
de pesquisas nessa área, as proteínas de fase aguda são cada vez mais utilizadas
no diagnóstico e prognóstico nas doenças dos animais domésticos (CANISSO et al.,
2014).Em resposta a infecção ou injúria, essas proteínas são rapidamente liberadas
na c orrente sa nguínea e s uas co ncentrações são di retamente r elacionadas com a
severidade da condição inflamatória do animal (CRISMAN, 2008).
A av aliação do l íquido am niótico n o m omento do parto é um método p ouco
invasivo e ág il capaz de demonstrar processos de comprometimento da pl acenta e
feto. Poucos são os estudos clínicos desenvolvidos em líquido amniótico de equino e
não há relatos na literatura da realização de proteinograma em fluidos fetais. Desta
forma, se faz necessária a i dentificação de marcadores bioquímicos e proteínas de
fase ag uda no líquido amniótico de ég uas saudáveis no m omento do par to, sendo
este o objetivo explorado nesta dissertação.
2 OBJETIVOS
Objetivo Geral
O objetivo deste estudo é identificar marcadores bioquímicos e proteínas de
fase aguda no líquido amniótico em éguas saudáveis no momento do parto.
Objetivo Específico
- Realizar pr oteinograma d o l íquido am niótico no momento d o parto e m
éguas saudáveis.
- Determinar as concentrações de eletrólitos e enzimas presentes no líquido
amniótico de éguas saudáveis no momento do parto.
3 ARTIGO
PERFIL BIOQUÍMICO E PROTEÍNAS DE FASE AGUDA NO LÍQUIDO
AMNIÓTICO DE ÉGUAS SAUDÁVEIS
I.S. Finger; B. R. Curcio; C. Haetinger; L.S. Feijó; F.M. Pazinato; N.C. Prestes;
C.E.W. Nogueira.
Submetido à revista Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
15
1
Artigo
2
3
4
PERFIL BIOQUÍMICO E PROTEÍNAS DE FASE AGUDA NO LÍQUIDO
5
AMNIÓTICO DE ÉGUAS SAUDÁVEIS
6
7
BIOCHEMICAL PROFILE AND ACUTE PHASE PROTEIN OF AMNIOTIC FLUID
8
IN HEALTHY MARES
9
10
I.S. FingerI*; B. R. CurcioIII; C. HaetingerI; L.S. FeijóI; F.M. PazinatoI; N.C. PrestesII;
11
C.E.W. NogueiraIII.
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19
20
21
22
23
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25
I
Pós – Graduanda, Faculdade de Veterinária, UFPel, Pelotas, RS
II
Universidade Estadual de São Paulo, UNESP, Botucatu, SP
III
Universidade Federal de Pelotas, Faculdade de Veterinária, UFPel, Pelotas, RS
*[email protected]
16
26
RESUMO
27
A análise do líquido amniótico é útil para compreender o processo bioquímico que
28
envolve a unidade feto-placentária. O objetivo do presente estudo foi identificar
29
marcadores bioquímicos e proteínas da fase aguda no líquido amniótico de éguas
30
saudáveis no momento do parto. A coleta do líquido amniótico foi realizada pelo
31
método de amniocentese, assim que exposta a bolsa amniótica na primeira fase do parto,
32
através de punção direta. Foram utilizadas quarenta éguas gestantes, entre 5 e 21 anos
33
de idade, da raça Puro Sangue Inglês, na região Sul do Brasil. A composição bioquímica
34
foi avaliada empregando-se kits comerciais e o proteinograma pela técnica de
35
eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS – PAGE). Os resultados obtidos de média e
36
erro padrão da média para os componentes bioquímicos foram: pH 7,70+0,02, glicose
37
1,22+0,08 (mg/dL), fosfatase alcalina 30,45+2,67 (UI/L), gamma – GT 4,66+0,62
38
(UI/L), uréia 33,59+2,34 (mg/dL), creatinina 5,10+0,59(mg/dL), sódio 54,35+2,51
39
(mEq/L), potássio 1,71+0,12 (mEq/L), cloretos 72,09+5,94 (mEq/L), cálcio 3,86+0,23
40
(mg/dL), osmolaridade 277,32+17,76 (mOsml/L) e proteína total 26,04+4,39 (mg/dL).
41
A osmolaridade apresentou correlação com os íons sódio (R=0,60), potássio (R=0,55) e
42
cálcio (R=0,53). Foram detectadas vinte e duas proteínas de fase aguda, sendo que as
43
proteínas inflamatórias albumina e transferrina foram identificadas em mais de 97% das
44
éguas avaliadas. Foi possível a identificação de marcadores bioquímicos e proteínas
45
inflamatórias no liquido amniótico de éguas saudáveis a termo. Somente a transferrina
46
apresentou-se diferente entre os grupos de idade, com concentrações inferiores no grupo
47
de éguas mais velhas.
48
49
50
51
52
53
54
55
56
Palavras–chave: Gestação, Eletrólitos, Proteinograma, Albumina, Tranferrina.
17
57
ABSTRATC
58
The analysis of amniotic fluid is useful for understanding the biochemical process
59
involving the fetal-placental unit. The aim of this study was to evaluate biochemical
60
profile and acute phase proteins in the amniotic fluid of healthy mares during labor. The
61
collection of amniotic fluid was performed by amniocentesis method, once exposed to
62
the amniotic sac in the first stage of labor, by direct puncture. It has been observed forty
63
Thoroughbred pregnant mares in Southern Brazil. The biochemical composition was
64
evaluated using commercially kits and proteinogram was measured by eletrophoresis in
65
poliacrylamide gel (SDS – PAGE). The results of mean and standard error were: pH
66
7.70+0.02; glucose 1.22+0.08; alkaline phosphatase 30.45+ 2.67 (IU/L); gamma – GT
67
4.6+0.62 (IU/L), urea 33.59+2.34 (mg/dL), creatinine 5.10+0.59(mg/dL), sodium
68
54.35+2.51 (mEq/L); potassium 1.71+0.12 (mEq/L), chloride 72.09+5.94 (mEq/L);
69
calcium 3.86+0.23 (mg/dL); osmolarity 277.32+17.76 (mOsml/L) and total protein
70
26.04+4.39 (mg/dL). The osmolarity was correlated with ions sodium (R=0.60),
71
potassium (R=0.55) and calcium (R=0.53). Twenty-two acute phase protein were
72
detected and that inflammatory proteins albumin and transferrin have been identified in
73
more than 97% of the evaluated mares. It was possible to identify biochemical markers
74
and inflammatory proteins in the amniotic fluid of healthy full term mares. Only the
75
transferrin presented among different age groups, with lower concentrations in the older
76
group of mares.
77
78
79
80
81
82
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86
87
88
Keywords: Gestation, Electrolytes, Proteinogram, Albumin, Transferrin.
18
89
INTRODUÇÃO
90
91
O líquido amniótico no início da gestação é produzido a partir de secreções do
92
epitélio amniótico e da urina fetal. Posteriormente, com o desenvolvimento da gestação,
93
o esfíncter vesical impede a liberação da urina fetal para a cavidade amniótica e a saliva
94
e as secreções nasais fetais passam a fazer parte da composição do líquido amniótico
95
(Baetz et al., 1976).As funções vitais para o desenvolvimento e a manutenção da vida
96
fetal como a oxigenação, nutrição e a remoção das excretas nitrogenadas são realizadas
97
pela circulação placentária (Guinter, 1998; Prestes, 2006). Neste contexto, o líquido
98
amniótico desempenha papel fundamental na gestação como no parto das éguas
99
(Zanella et al., 2013).
100
A unidade útero-placentária pode ser comprometida por processos de
101
hipoxemia ou infecção, o que interfere na difusão entre as circulações materna e fetal,
102
reduzindo o aporte de nutrientes e oxigênio para o feto e a placenta (Rossdale, 2004). O
103
líquido amniótico reflete o estado materno fetal tanto por sua composição como pelo
104
seu volume, tendo importância na boa evolução da gestação (Dertkigil et al., 2005). Em
105
equinos existem poucos trabalhos sobre o tema, contudo já foi demonstrado que a
106
variação na concentração dos componentes bioquímicos do fluido amniótico pode ter
107
uma relação significativa com a saúde fetal, podendo indicar certas enfermidades
108
(Kochhar et al., 1997).Em éguas da raça Puro Sangue Inglês, a osmolaridade apresentou
109
uma correlação positiva com a idade da parturiente, enzimas e eletrólitos do líquido
110
amniótico (Curcio et al., 2012). Em estudo realizado por Zanella et al. (2013) os autores
111
identificaram que em éguas, de acordo com o período gestacional, há uma variação na
112
composição bioquímica tanto do líquido amniótico quanto do líquido alantóide. A
113
concentração de lactato no fluido amniótico foi avaliada no momento do parto em
114
éguas, podendo ser útil na identificação dos neonatos que necessitam de intervenção
115
precoce, logo após o nascimento (Pirrone et al., 2012). Mais estudos devem ser
116
desenvolvidos para que o líquido amniótico possa ser uma eficiente ferramenta na rotina
117
clínica de equinos.
118
Um grande desafio na medicina envolve a detecção e monitoramento da
119
inflamação, a qual resulta de diversas enfermidades (Crisman, 2008). Com o
120
estabelecimento de pesquisas nessa área, as proteínas de fase aguda são cada vez mais
19
121
utilizadas no diagnóstico e prognóstico nas doenças dos animais domésticos (Canisso et
122
al., 2014).Em resposta a infecção ou injúria, essas proteínas são rapidamente liberadas
123
na corrente sanguínea e suas concentrações são diretamente relacionadas com a
124
severidade da condição inflamatória do animal (Crisman, 2008).
125
A avaliação do líquido amniótico no momento do parto é um método pouco
126
invasivo e ágil capaz de demonstrar processos de comprometimento da placenta e feto.
127
Poucos são os estudos clínicos desenvolvidos em líquido amniótico de equino e não há
128
relatos na literatura da realização de proteinograma em fluidos fetais. Desta forma, o
129
objetivo deste estudo é identificar marcadores bioquímicos e proteínas da fase aguda no
130
líquido amniótico de éguas saudáveis no momento do parto.
131
132
MATERIAL E MÉTODOS
133
Animais
134
Este estudo foi realizado em um criatório de cavalos da Raça Puro Sangue
135
Inglês, localizado no município de Bagé, sul do Brasil, latitude 31°34’48.54” e
136
longitude 54°11’06.38”. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de
137
Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Federal de Pelotas, sob o
138
número de protocolo 23110.005008/2013-43.
139
As éguas eram mantidas durante o verão em campo nativo e durante o inverno
140
a consorciação de azevém (Lolium multiflorum), trevo branco (Trifolium repens) e
141
cornichão (Lotus corniculatus) como pastagem cultivada. A suplementação era
142
realizada através de ração balanceada com garantia de 12% de proteína e 27,5% Mcal
143
de energia digerível. A água estava disponível ad libitum.
144
Foram utilizadas quarenta éguas gestantes, saudáveis, entre 5 e 21 anos de idade,
145
apresentando o mesmo padrão de escore corporal. As éguas foram divididas em dois
146
grupos de acordo com Madill (2002): o grupo 1 (n= 19), éguas jovens, com idades entre
147
cinco e oito anos (6,8 + 0,32) e o grupo 2 (n= 21), éguas com idade superior a nove
148
anos(13,1 + 0,85).
149
As éguas foram monitoradas durante todo o período gestacional por médico
150
veterinário. Mensalmente eram submetidas a exames de palpação retal e
151
ultrassonográficos para avaliação do feto e da placenta. A partir do 5o mês de gestação
20
152
realizava-se a medição da espessura da junção útero-placentária via transretal utilizando
153
transdutor linear de 5 MHz, conforme descrito Renaudin et al. (1997).
154
Trinta dias antes da data de previsão do parto as éguas eram direcionadas para
155
o lote de parição e mantidas soltas a campo sob vigilância contínua até iniciar o parto. O
156
tempo médio de gestação foi de 345,8 + 1,9 dias. Após o rompimento da bolsa
157
alantoideana e exposição da membrana amniótica eram conduzidas às cocheiras
158
maternidade para que todos os partos fossem assistidos. Todos os partos foram
159
eutócicos com o nascimento de potros viáveis.
160
As placentas foram inspecionadas e pesadas imediatamente após a expulsão. O
161
peso médio das placentas foi de 6,7 + 0,2 Kg. Para avaliação macroscópica, as placentas
162
foram dispostas em formato de “F”, conforme descrito por Schlafer (2004). Foram
163
coletados fragmentos de sete pontos para avaliação histopatológica, sendo estes
164
correspondentes a estrela cervical, corpo uterino, corno gravídico e não gravídico,
165
bifurcação, âmnio e cordão umbilical, estes foram armazenados em tubos Falcon® de
166
50mL acrescidos de solução de formalina tamponada a 10% para fixação e posterior
167
avaliação microscópica. Todas as éguas utilizadas neste estudo apresentaram padrão
168
histopatológicas das placentas sem alteração, de acordo com a avaliação descrita por
169
Lins et al. (2012).
170
171
Coleta de material
172
A coleta do líquido amniótico foi realizada através de punção direta da vesícula
173
amniótica, com seringa de 20mL e agulha (40x12 mm) estéril (método de
174
amniocentese), assim que exposta a bolsa amniótica na primeira fase do parto.
175
176
O material foi imediatamente transferido para tubos falcon® de 15 mL e
estocado em freezer sob temperatura de - 20°C para posterior avaliação.
177
178
Análise Bioquímica do Líquido Amniótico
179
As análises bioquímicas foram realizadas no laboratório de patologia clínica da
180
Faculdade de Veterinária e Zootecnia da UNESP/Botucatu, similar ao descrito por
181
Zanella et al. (2013). Foram avaliados pH, glicose, fosfatase alcalina, gamma – GT,
182
uréia, creatinina, sódio, potássio, cloretos, cálcio, osmolaridade e proteína total A
183
quantificação foi realizada com espectrofotômetro, SB – 190 Celm (Companhia
21
184
Equipadora de Laboratórios Modernos, Barueri, São Paulo, SP, Brasil), para todos os
185
elementos, exceto sódio e potássio através do equipamento CELM FC – 280 fotômetro
186
de chama (Companhia Equipadora de Laboratórios Modernos). Para quantificar os
187
níveis de creatinina, uréia e cloretos foi utilizado kit CELM (Companhia Equipadora de
188
Laboratórios Modernos) de acordo com as instruções do fabricante.
189
190
Proteinograma
191
O proteinograma do líquido amniótico foi obtido pela técnica de eletroforese
192
em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS – PAGE),
193
noLaboratório de Pesquisa do Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária - FCAV -
194
UNESP, Jaboticabal, conforme método descrito por Laemmli (1970) e as
195
recomendações de Fagliari e Silva (2002). Após o fracionamento, o gel foi corado
196
durante duas horas em solução de azul de coomassie; em seguida, foi descorado em
197
solução de metanol e ácido acético. Os pesos moleculares e as concentrações das
198
proteínas foram determinadas mediante leitura em densitômetro computarizado
199
(Densitometer CS9301- PC - Shimadzu, Tokyo-Japan). Para a identificação das
200
proteínas no gel, foi utilizada solução marcadora (Sigma Marker, Wide Range – Saint
201
Louis, USA) com diversos pesos moleculares, variando de 20.000 a 200.000 dáltons.
202
203
Análise Estatística
204
A análise estatística foi realizadacom auxílio do software Statistix8.0®
205
(Analytical Software, Tallahassee, FL, USA). Todos os valores bioquímicos e proteínas
206
de fase aguda foram expressos em média + erro padrão. Os dados foram submetidos a
207
teste de normalidade Shapiro Wilk. Foi realizado para todas as variáveis respostas o
208
teste de correlação de Pearson. As comparações entre as médias das proteínas de fase
209
aguda entre os grupos foram realizadas pelo teste Two Sample T Test. O teste exato de
210
Fisher foi utilizado para comparar os índices de éguas que apresentaram proteínas
211
inflamatórias entre os grupos de idade.
212
213
214
215
22
216
RESULTADOS
217
218
Não foi observada correlação entre as proteínas inflamatórias identificadas no
219
líquido amniótico. No entanto, nas análises bioquímicas foi possível observar que a
220
osmolaridade apresentou correlação positiva com sódio (R = 0.60, p = 0,0001), potássio
221
(R = 0.55, P =0,0004) e cálcio (R = 0.53, P = 0,0007).
222
223
Os resultados das análises bioquímicas realizadas no líquido amniótico das
éguas no momento do parto estão apresentados na Tab. 1.
224
225
Tabela 1. Média, Erro Padrão (S.E), Valores Mínimo – Máximo das variáveis
226
analisadas no líquido amniótico no momento do parto (N=31).
227
Variável
228
Média+S.E
Valores Mínimo –
Máximo
229
pH
7,70+0,02
7,42 – 7,97
230
Glicose (mg/dL)
1,22+0,08
1,0 – 3,0
231
Fosfatase Alcalina (UI/L)
30,45+2,67
8,0 – 95
232
Gamma – GT (UI/L)
4,66+0,62
1,80 – 16,4
233
Uréia (mg/dL)
33,59+2,34
6,80 – 61,8
234
Creatinina (mg/dL)
5,10+0,59
2,0 – 17,3
235
Sódio (mEq/L)
54,35+2,51
31 – 89
236
Potássio (mEq/L)
1,71+0,12
0,9 – 3,5
237
Cloretos (mEq/L)
72,09+5,94
47 – 239
238
Cálcio (mg/dL)
3,86+0,23
1,8 – 6,47
239
Osmolaridade (mOsml/L)
277,32+17,76
143 – 633
240
Proteína Total (mg/dL)
26,04+4,39
9,23 – 139,07
241
242
243
No traçado densitométrico foram detectadas no líquido amniótico vinte e duas
244
proteínas com pesos moleculares variando 19.439 a 272.284 dáltons (Da). Destas, dez
245
proteínas foram consideradas para o estudo, por serem imunoglobulinas e proteínas de
246
fase aguda. Assim nas 36 éguas utilizadas para essa análise, destacaram-se com
247
respectiva percentagem no fluido amniótico a albumina (n=36; 100%), transferrina
23
248
(n=35; 97,22%), IgG cadeia leve (n=33; 91,7%), IgG cadeia pesada (n=30; 83,33%),
249
IgA (n=30; 83,3%), haptoglobina (n=22; 61,11%), ceruloplasmina (n=21; 58,3%), α1 -
250
antitripsina (n=13; 36,11%), α1 - glicoproteína ácida (n=7; 20%) e 23 kDa (n=2; 5,6%).
251
As concentrações destas dez proteínas, apresentadas pela média, juntamente com seus
252
respectivos erros padrões, valores mínimos e máximos dos pesos moleculares,
253
encontram-se na Tab. 2. Na comparação entre os grupos de idade, não foi observada
254
diferença na porcentagem de éguas em que foram identificadas as proteínas
255
inflamatórias. Na avaliação da concentração das proteínas entre os grupos, somente a
256
transferrina apresentou diferença (p=0.01), sendo detectadas médias superiores no grupo
257
de éguas jovens (47,8 + 14,2) em relação às éguas mais velhas (10,3 + 3,7).
258
259
Tabela 2. Média, Erro Padrão das Concentrações, Valores Mínimo e Máximo do Peso
260
Molecular das proteínas identificadas no líquido amniótico no momento do parto
261
(N=36).
262
Proteínas de Fase
263
Aguda
264
N
Média+S.E
(mg/dL)
265
Valores
Mínimo-Máximo (Da)
266
Albumina
36
177,01+30,58
63,74 – 69,76
267
Transferrina
35
37,98+9,47
80,53 – 89,32
IgG Cadeia Leve
33
148,99+39,90
23,80 – 40,60
270
IgG Cadeia Pesada
30
10,43+2,63
23,88 – 61,72
271
IgA
30
1,10+0,51
151,54 – 194,12
272
Haptoglobina
22
17,47+12,88
40,70 – 56,97
273
Ceruloplasmina
21
0,39+0,10
93,40 – 120,40
274
α1 – Antitripsina
13
15,21+9,10
59,41 – 64,30
276
α1 – glicoproteína ácida
7
0,24+0,08
33,86 – 41,40
277
23 kDa
2
7,50+3,35
23,30 – 23,42
268
269
275
278
279
280
281
282
24
283
DISCUSSÃO
284
285
Este estudo determinou componentes bioquímicos em todas as amostras de
286
líquido amniótico obtidas no momento do parto. A unidade feto-placentária é um
287
sistema dinâmico, o qual realiza trocas constantes entre a circulação materna e os
288
fluidos fetais, sendo que a variação nas concentrações desses componentes pode ter uma
289
relação significativa com a saúde fetal (Kochhar et al., 1997).
290
O valor médio encontrado para o pH foi de 7,70. A discreta alcalinidade
291
demonstrada para o valor do pH pode estar relacionada a presença dos eletrólitos,
292
contudo não foi encontrada correlação entre eles. Em equinos não existem valores
293
identificados de pH do líquido amniótico no momento do parto. Em estudo realizado
294
por Martins (2004) o pH identificado no líquido amniótico de cadelas variou de 7,50 a
295
8,50.Em estudo realizado em ovelhas por Prestes et al.(2001), os autores observaram
296
uma diminuição do pH ao longo da gestação, os autores sugerem que esta diminuição
297
ocorra devido ao aumento de secreções e eliminação de proteínas oromucóides.
298
A composição eletrolítica do líquido amniótico varia muito e essas trocas
299
refletem a atividade dos rins, pulmões e trato digestório (Gulbis et al.,1998). No
300
presente estudo os níveis de sódio identificados foram inferiores aos valores obtidos nas
301
três fases da gestação por Zanella et al. (2013).
302
De acordo com o estudo realizado por Kochhar et al.(1997) há uma elevação
303
na concentração de íons potássio e cálcio no fluido alantóide, sugerindo um aumento da
304
urina e atividade metabólica fetal. Estes eletrólitos demonstraram uma diminuição no
305
líquido amniótico no momento do parto ao comparar com os dados obtidos para o terço
306
final da gestação por Zanella et al.(2013).
307
Em estudo realizado em ovelhas por Prestes et al. (2001), os cloretos
308
demonstraram a mesma tendência que o sódio. Em que houve uma diminuição dos
309
níveis ao longo dos terços gestacionais. Zanella et al. (2013) observaram um aumento
310
no terço médio e uma redução no terço final da gestação. Em nosso estudo, os níveis
311
dos íons cloretos foram superiores aos valores obtidos por Zanella et al. (2013). Através
312
do estudo dos eletrólitos como sódio, potássio e cálcio foi possível demonstrar que estes
313
componentes e suas respectivas variações influenciaram na osmolaridade do líquido
314
amniótico.
25
315
O valor médio de 1,22 mg/dL para os níveis de glicose no líquido amniótico no
316
momento do parto foi inferior ao valor de 4.0 mg/dL observado por Zanella et al. (2013)
317
no terço final da gestação. Isto demonstra que há uma redução na concentração de
318
glicose de acordo com a evolução da gestação em éguas saudáveis. Em mulheres, a
319
glicose do fluido amniótico é utilizada como um indicador sensível e específico de
320
infecção intra-amniótica (Kirshon et al., 1991). Em estudos com ovelhas (Burd et al.,
321
1975; Carter et al., 1993) os autores demonstraram que a placenta metaboliza
322
rapidamente a glicose, produzindo grande quantidade de lactato como subproduto. A
323
concentração de lactato no líquido amniótico de equinos esta relacionada positivamente
324
com o pH do potro imediatamente após o nascimento, uma vez que um pH baixo pode
325
indicar hipóxia neonatal (Pirrone et al.,2012).
326
A fosfatase alcalina está correlacionada com maturidade, formação óssea e
327
principalmente, com a função renal fetal (Hahnemann, 1974). Pode ocorrer um aumento
328
da atividade da enzima devido a maturação avançada do intestino, fígado, ossos e rins
329
fetais, a entrada direta de células descamadas da mucosa intestinal no líquido amniótico
330
ou eventual passagem de matéria fecal durante o processo de nascimento (Williams et
331
al., 1993). Os níveis obtidos para esta enzima em nosso trabalho no momento do parto,
332
foram inferiores ao valor obtido por Zanella et al. (2013) no terço final da gestação.
333
Sugerindo que com a proximidade do parto, em éguas saudáveis, há uma redução na
334
atividade da fosfatase alcalina.
335
Em estudo realizado por Prestes et al. (2001) foi possível determinar grande
336
concentração da enzima gama – GT nos rins, pâncreas e fígado, participando do
337
metabolismo de vários mediadores de funções fisiológicas. Assim, os valores obtidos
338
para esta enzima no líquido amniótico no momento do parto demonstram a atividade
339
destes órgãos em potros oriundos de éguas gestantes saudáveis.
340
A concentração média de uréia foi de 33.59, valor este inferior ao valor obtido
341
por Zanella et al. (2013), no terço final da gestação. Através destes valores é possível
342
observar uma redução nos níveis de uréia no liquido amniótico no momento do parto.
343
O aumento na concentração de creatinina no líquido amniótico reflete a
344
maturação do sistema urinário no neonato equino (Williams et al., 1993), uma vez que a
345
creatinina representa um bom marcador de maturação e função renal em humanos
346
(Begneaud et al., 1969). O rim fetal é afuncional durante o seu período de formação,
26
347
porém sua contribuição no final do processo de maturação fetal é importante para a
348
sobrevida do concepto (Lumbers et al., 1985). O estudo realizado em ovelhas sem
349
alterações gestacionais por Prestes et al. (2001), comprovou que os valores de creatinina
350
no líquido amniótico aumentaram conforme a evolução da gestação. Para Vaala (1999),
351
o nível de creatinina sérica não é um marcador confiável da função renal dos potros
352
neonatos, porque a placenta é a principal responsável pela eliminação de metabólitos do
353
feto e a elevação da creatinina é geralmente uma consequência de disfunção placentária.
354
Desta forma, o nível obtido de creatinina no líquido amniótico de éguas sadias reflete
355
uma adequada função feto-placentária, e um potencial marcador dessa condição.
356
Em estudos realizados por Canisso et al. (2014) e Coutinho et al. (2013), os
357
autores demonstraram um aumento nos níveis séricos das proteínas inflamatórias
358
haptoglobina e Amilóide A sérica, em éguas com alterações inflamatórias na placenta.
359
No líquido amniótico de equinos, não há relato da avaliação de proteínas de fase aguda.
360
A albumina demonstrou estar presente em todas (100%) as amostras (177.01+30.58
361
mg/dL). A proteína identificada com peso molecular de23 kDa (7.50+3.35 mg/dL)
362
apresentou o menor percentual e foi identificada em apenas duas amostras (5,6%).
363
A transferrina, proteína de fase aguda negativa, apresentou um valor
364
significativamente inferior no grupo de éguas mais velhas. Apresentando um padrão
365
similar ao descrito sobre as concentrações de albumina, em vacas multíparas, o que
366
pode representar um marcador de processos inflamatórios associados a processos
367
reprodutivos no pós-parto (Krause et al., 2013).
368
369
CONCLUSÃO
370
371
Foi possível identificar marcadores bioquímicos e proteínas inflamatórias no
372
líquido amniótico de éguas saudáveis no momento do parto. Somente a transferrina
373
apresentou-se diferente entre os grupos de idade, com concentrações menores no grupo
374
de éguas mais velhas.
375
376
377
378
27
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4 CONCLUSÃO GERAL
Poucos são os estudos desenvolvidos em l íquido am niótico n a esp écie
equina. D esta forma, a
partir dos
resultados bioquímicos e o pr oteinograma
apresentados foi possível determinar valores de referência para a análise do líquido
amniótico d e ég uas saudáveis no m omento d o par to. Somente a t ransferrina
apresentou-se diferente entre os grupos de idade, com concentrações inferiores no
grupo de éguas mais velhas.
Mais estudos devem ser desenvolvidos para que o l íquido amniótico possa
ser uma eficiente ferramenta na rotina clínica de equinos.
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