UNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC
CENTRO DE CIÊNCIAS AGROVETERINÁRIAS – CAV
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
JULIO CESAR MORAES
DIAGNÓSTICO DE Eimeria spp EM FRANGOS DE CORTE NA
MESORREGIÃO SUL DO ESTADO DE SANTA CATARINA,
POR MEIO DA MULTIPLEX PCR
LAGES, SC
2013
JULIO CESAR MORAES
DIAGNÓSTICO DE Eimeria spp EM FRANGOS DE CORTE NA
MESORREGIÃO SUL DO ESTADO DE SANTA CATARINA,
POR MEIO DA MULTIPLEX PCR
Dissertação
apresentada
no
programa de Pós-graduação em
Ciência Animal do Centro de
Ciências Agroveterinárias, da
Universidade do Estado de Santa
Catarina, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre
em Ciência Animal.
Orientador: Prof. PhD. Antonio
Pereira de Souza
LAGES, SC
2013
M827d
Moraes, Julio Cesar
Diagnóstico de Eimeria spp em frangos de corte
na mesorregião sul do estado de Santa Catarina,
por meio da Multiplex PCR / Julio Cesar Moraes. –
2013.
110 p. : il. ; 21 cm
Orientador: Antonio Pereira de Souza
Bibliografia: p. 85-101
Dissertação
(mestrado)
–
Universidade
do
Estado de
Santa
Catarina,
Centro
de
Ciências
Agroveterinárias, Programa de Pós-Graduação em
Ciência Animal, Lages, 2013.
1. Eimeria spp. 2. Ocorrência. 3. Oocisto.
4. Frangos de corte. 5. Multiplex PCR. I. Moraes,
Julio Cesar. II. Souza, Antonio Pereira de. III.
Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa
de Pós-Graduação em Ciência Animal. IV. Título
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Setorial do
CDD: 636.5 – 20.ed.
CAV/UDESC
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer, em primeiro lugar, a Deus, pela força e
coragem durante toda esta caminhada.
A minha mãe Idi, ao meu irmão Rafael que, com muito carinho
e apoio, não mediram esforços para que eu concluísse mais esta etapa.
A minha namorada Gisele, pelo carinho, incentivo e
compreensão que vem me prestando nesses últimos anos.
Ao Prof. Dr. Antonio Pereira de Souza, pelos ensinamentos e
tempo dedicado em orientação.
Ao Prof. Dr. Luiz Claudio Miletti e Prof. Dra. Maria de Lourdes
Borba Magalhães pela oportunidade, aprendizado e dedicação durante o
período experimental.
Ao Prof. Dr. Valdomiro Bellato e Prof. Dr. Anderson Barbosa
de Moura pela confiança e apoio nesta jornada.
A Prof. Dra. Amélia Aparecida Sartor pela amizade
demonstrada ao longo destes anos de convívio.
A Dra. Sandra Fernandez e a Dra. Jane Fraga pelo fornecimento
das amostras.
Ao amigo e bolsista, Marciel França pela boa vontade e apoio
durante todo processamento do material e, pela amizade.
A Universidade do Estado de Santa Catarina, pela oportunidade
de realização do Mestrado junto ao curso de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias.
A CAPES, pela concessão da bolsa.
Aos meus colegas de laboratório pelo companheirismo e
amizade.
E a todos aqueles que de uma forma ou outra me ajudaram a
vencer mais esta etapa, meu muito obrigado!
“Tente ser uma pessoa de valor,
não de sucesso.”
Albert Einstein
“O mérito vale mais que a
fama.”
Francis Bacon
RESUMO
MORAES, Julio Cesar. Diagnóstico de Eimeria spp em frangos de
corte na mesorregião sul do estado de Santa Catarina, por meio da
Multiplex PCR. 2013. 111 f. Dissertação (Mestrado em Ciência
Animal). Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pósgraduação em Ciência Animal, Lages, 2013.
As espécies do gênero Eimeria são responsáveis pelo maior impacto
econômico dentre as doenças parasitárias que acometem frangos de
corte. O controle da coccidiose é realizado principalmente com
anticoccidianos, porém, o desenvolvimento da resistência a esses
fármacos, aliada à opinião pública contra o uso de drogas na ração,
tendem a fomentar a utilização de vacinas, aumentando a importância da
identificação das espécies de Eimeria circulantes. Com os objetivos de
identificar as espécies de Eimeria e estudar a ocorrência destas em
instalações avícolas da mesorregião Sul do estado de Santa Catarina,
foram coletadas amostras (pool de fezes) em 21 municípios,
provenientes de 251 lotes de frangos de corte com idade entre 28 a 48
dias. Os oocistos foram recuperados por meio de técnicas de filtragem,
centrifugação e centrífugo-flutuação utilizando solução hipersaturada de
NaCl e quantificados utilizando câmara de Neubauer. As amostras
foram estratificadas, por idade das aves em três intervalos (28 a 34; 35 a
41 e 42 a 48). As espécies foram identificadas por meio da técnica de
Multiplex PCR. Amplicons das sete espécies de Eimeria originados da
PCR de amostras positivas foram clonados e sequenciados. A ocorrência
do gênero Eimeria foi de 96,02%. Verificou-se que em frangos com
idade entre 42 a 48 dias a média do número de oocistos foi
significativamente menor quando comparada com os intervalos de idade
de 28 a 34 e 35 a 41 dias (P<0,05). Foram encontradas Eimeria
acervulina (63,3%), Eimeria maxima (63,7%), Eimeria tenella (54,6%),
Eimeria praecox (25,1%), Eimeria mitis (38,6%), Eimeria necatrix
(24,3%) e Eimeria brunetti (13,1%). O número médio de espécies
detectadas por propriedade foi de 2,96 e a associação mais frequente foi
de E. acervulina, E. maxima e E. tenella (9,16%). Por meio do
sequenciamento dos clones confirmou-se a especificidade e eficácia da
técnica de Multiplex PCR para a identificação das espécies de Eimeria.
Concluí-se que na mesorregião Sul do Estado, a adoção de medidas
profiláticas deve considerar o controle das sete espécies de Eimeria que
parasitam frangos.
Palavras-chave: Eimeria spp. Ocorrência. Oocisto. Frangos de corte.
Multiplex PCR.
ABSTRACT
MORAES, Julio Cesar. Diagnosis of Eimeria spp in broilers in the
southern state of Santa Catarina, by Multiplex PCR. 2013. 111 f.
Dissertation (MSc in Animal Science). Universidade do Estado de Santa
Catarina. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Lages, 2013.
The species of the genus Eimeria are responsible for the greatest
economic impact among the parasitic diseases that affect broilers. The
control of coccidiosis is mainly performed with anticoccidial, however,
the development of resistance to these drugs, together with the public
opinion against the use of drugs in food, they tend to promote the use of
vaccines, increasing the importance of the identification of species of
Eimeria circulating. Aiming to identify the species of Eimeria and study
the occurrence of these species in poultry farms in the southern state of
Santa Catarina, samples were collected (pool of feces) in 21
municipalities, from 251 flocks of broilers aged 28 to 48 days. The
oocysts were recovered by techniques of filtration, centrifugation and
flotation using supersaturated solution of NaCl and quantified using a
Neubauer chamber. The samples were stratified by age of the birds in
three intervals (28 to 34, 35 to 41 and 42 to 48). The species were
identified by Multiplex PCR technique. Amplicons of the seven species
of Eimeria originating from the PCR positive samples have been cloned
and sequenced. The occurrence of the genus Eimeria was 96.02%. It
was found that in chickens aged 42 to 48 days the average number of
oocytes was significantly reduced when compared to the intervals age of
28 to 34, and 35 to 41 days (p<0.05). Were found Eimeria acervulina
(63.3%), Eimeria maxima (63,7%), Eimeria tenella (54.6%), Eimeria
praecox (25.1%), Eimeria mitis (38.6%), Eimeria necatrix (24.3%) and
Eimeria brunetti (13.1%). The average number of species detected by
property was 2.96 and was the most frequent combination of E.
acervulina, E. maxima and E. tenella (9.16%). The sequencing of the
clones confirmed the specificity and effectiveness of the Multiplex PCR
technique for identification of species of Eimeria. It can be concluded
that in the South of the State, prophylactic measures should consider the
control of the seven Eimeria species that parasitize chickens.
Keywords: Eimeria spp. Occurrence. Oocyst. Broilers. Multiplex PCR.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura-1
Ciclo biológico do gênero Eimeria..................................... 22
Figura-2
Período pré-patente (PPP) e tempo mínimo para esporulação
(TME) a 30°C, em horas e, medidas dos oocistos por espécie
de Eimeria em micrometros ............................................... 23
Figura-3
Oocistos de E. maxima (a), E. brunetti (b), E. tenella (c), E.
necatrix (d), E. praecox (e), E. acervulina (f) e E. mitis (g)
............................................................................................ 40
Figura-4
Mapa de Santa Catarina com a divisão das cinco
mesorregiões do Estado ...................................................... 56
Figura-5
Locais de coleta de amostras de fezes de frangos de corte na
mesorregião Sul do Estado ................................................. 57
Figura-6
“Primers Forward (F) e Reverse (R)”, utilizados na técnica
de Multiplex PCR para a detecção das sete espécies de
Eimeria de frangos de corte e o tamanho dos amplicons
gerados................................................................................ 61
Figura-7
Oocistos não esporulado e esporulado, observados durante a
contagem em câmara de Neubaeuer (seta vermelha indica
oocisto não esporulado e seta azul, esporulado) ................. 65
Figura-8
Oocistos com tamanhos e morfologias diferentes,
observados durante a contagem em câmara de Neubaeuer
(seta vermelha indica oocisto de menor tamanho e seta azul,
de maior)............................................................................. 66
Figura-9
Número médio de oocistos por mL (+ Intervalo de confiança
a 95%) em amostras de fezes de frangos de corte da
mesorregião Sul de Santa Catarina, em três faixas etárias.
Relacionado com o número de propriedades por faixa etária
............................................................................................ 66
Figura-10 Número de propriedades positivas para E. acervulina (ac);
E. maxima (mx); E. tenella (tn); E. praecox (pr); E. mitis
(mt); E. necatrix (nc) e E. brunetti (br), das 251 granjas de
frangos de corte na mesorregião Sul de Santa Catarina ......67
Figura-11 Eletroforese em gel de agarose dos produtos da Multiplex
PCR de Eimeria spp., de amostras da mesorregião Sul do
estado de Santa Catarina: 1(marcador de 100pb); 2 (amostra
163: controle interno positivo com ac, tn, mt, pr, mx e nc); 3
(ac e mx); 4 (pr); 5 (ac, tn e mx); 6 (ac, tn, mt, mx e nc), 7
(ac, tn, mt e mx) e 8 controle negativo ................................69
Figura-12 Eletroforese em gel de agarose dos produtos da Multiplex
PCR de Eimeria spp., de amostras da mesorregião Sul do
estado de Santa Catarina: 1(marcador de 100pb); 2 ( controle
positivo - clones: ac, br, tn, mt, pr, mx e nc); 3 a 10 amostras
negativas, 11 (br), 12 (ac, mt, pr e mx), 13 (tn, pr e mx) e 14
controle negativo .................................................................70
Figura-13 Eletroforese em gel de agarose dos produtos da Multiplex
PCR de Eimeria spp.: 1 (marcador de 100 pb); 2 e 3 (clones
dos SCAR de ac, br, tn, mt, pr, mx e nc) .............................71
Figura-14 Similaridade dos produtos do sequenciamento com as
sequências dos marcadores SCAR das sete espécies de
Eimeria depositados no “National Center for Biotechnology
Information” ........................................................................75
LISTA DE TABELAS
Tabela-1
Comparação das médias de oocistos de Eimeria spp. por mL
recuperados de fezes de frangos de corte em três intervalos
de idades ............................................................................. 67
Tabela-2
Espécies de Eimeria identificadas e numero de granjas
amostradas, por município na mesorregião Sul do Estado ..... 68
Tabela-3
Diferentes combinações de espécies de Eimeria encontradas
nas 251 propriedades de frangos de corte ........................... 72
LISTA DE ABREVIATURAS
AFLP
APGA
BLAST
°C
Ca++
Cm
DH10 B
DNA
dNTP
DGGE
DHFR-TS
EAMZ250
EASZ240
EDTA
FIGE
g
GPI
G6PD
ITS
IFNγ
IL-2
IPTG
K+
Kg
LB
LDH
Μ
mM
Mm
mL
m2
Mg++
MgCl2
PCR
PFGE
PAGE
PB
PABA
Amplified fragment length polymorphism.
Antígeno purificado de gametócito.
Basic Local Alignment Search Tool.
Graus centígrados.
Íon cálcio.
Centímetros.
Células de Escherichia coli cálcio-competentes.
Ácido desoxirribonucleico.
Deoxinucleotídeos trifosfatos.
Denaturing gradient-gel electrophoresis.
Diidrofolato redutase timidilato sintetase.
Antígeno de merozoítos de E. acervulina 250.
Antígenos de esporozoítos E. acervulina 240.
Ácido etilenodiamino tetra-acético.
Field inversion gel electrophoresis.
Força da gravidade.
Glucose phosphate isomerase.
Glucose-6-phosphate dehydrogenase
Internal transcribed spacer.
Interferon gama.
Interleucina – 2.
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside.
Íon potássio.
Quilograma.
Meio de crescimento “Luria-Bertani”.
Lactato de dehidrogenase.
Molar ou molaridade (mol/l).
Milimolar
Milímetros.
Mililitro.
Métro quadrado
Íon magnésio.
Cloreto de magnésio.
Polymerase chain reaction.
Pulsed-field gel electrophoresis.
Polyacrylamide gel electrophoresis.
Pares de base.
Ácido p-aminobenzóico.
Pg
NaCl
ng
Na+
NH4
SDS
SCAR
RAPD
rDNA
RFLP
RNA
RPM
SOC
Taq
TBE
T3SS
T2SS
U
V
µm
µg
µL
6PGD
X-GAL
Picograma
Cloreto de sódio.
Nanograma.
Íon sódio.
Amônia.
Dodecil sulfato de sódio.
Sequence-characterized amplified region.
Random amplification of polymorphic DNA.
DNA ribossômico.
Restriction fragment length polymorphism.
Ácido ribonucleico.
Rotações por minuto.
Super optimal broth catabolic repressuion.
Thermus aquaticus.
Tris-borato-EDTA.
Type 3 secretion system.
Type 2 secretion system.
Unidades.
Volts.
Micrômetros
Micrograma
Microlitro.
Glucose-6-fosfato dehidrogenase.
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO....................................................................17
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................20
2.1
2.1.1
GÊNERO Eimeria .................................................................20
Ciclo evolutivo ......................................................................21
2.2
2.2.1
2.2.2
2.2.3
2.2.4
2.2.5
2.2.6
2.2.7
CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS, MORFOLÓGICAS E
ALTERAÇÕES CAUSADAS NO HOSPEDEIRO PELAS
ESPÉCIES DE EIMERIAS QUE PARASITAM AVES DA
ESPÉCIE Gallus gallus domesticus.......................................21
Eimeria acervulina ................................................................21
Eimeria maxima ....................................................................23
Eimeria tenella ......................................................................23
Eimeria praecox ....................................................................24
Eimeria mitis .........................................................................24
Eimeria necatrix....................................................................25
Eimeria brunetti ....................................................................25
2.3
2.3.1
2.3.1.1
2.3.2
CONTROLE DA COCCIDIOSE AVIÁRIA .........................25
Anticoccidianos ....................................................................26
Resistência aos anticoccidianos ...........................................27
Vacinação ..............................................................................33
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.2.1
2.4.2.2
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES .....................................38
Método de diagnóstico morfo-clínico .................................38
Diagnósticos bioquímicos e moleculares ............................41
Eletroforese de isoenzimas ..................................................41
Detecção de “Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP” por hibridização “Southern Blot” .........................42
2.4.2.3 “Random Amplification of Polymorphic DNA – RAPD”.43
2.4.2.4 Amplified Fragment Length Polymorphysm (AFLP).......44
2.4.2.5 Polymerase Chain Reaction (PCR) ....................................45
2.4.2.5.1 PCR utilizando o primeiro ou segundo “Internal
Transcribed Spacer – ITS” do DNA ribossômico .............46
2.4.2.6 Real-time PCR......................................................................49
2.4.2.7 Pirosequenciamento .............................................................51
2.4.2.8 Multiplex PCR ......................................................................51
3
OBJETIVOS ........................................................................ 55
3.1
OBJETIVO GERAL ............................................................. 55
3.2
OBJETIVO ESPECÍFICO .................................................... 55
4
MATERIAL E MÉTODOS ................................................ 56
4.1
CARACTERÍSTICAS DA REGIÃO .................................... 56
4.2
COLETA DAS AMOSTRAS DE FEZES DE FRANGOS DE
CORTE.................................................................................. 57
4.3
4.3.7
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DE FEZES DE
FRANGOS DE CORTE ........................................................ 58
Purificação e quantificação dos oocistos de Eimeria spp. 58
Análise estatística das médias de oocistos recuperados das
fezes de frangos de corte por intervalos de faixa etária ... 59
Limpeza dos oocistos ........................................................... 59
Purificação do DNA de oocistos de Eimeria spp. .............. 59
Ruptura dos oocistos ........................................................... 60
Digestão com RNAse e Proteinase K ................................. 60
Extração com fenol-clorofórmio ........................................ 60
Precipitação e lavagem do DNA ......................................... 60
Multiplex PCR ..................................................................... 61
Eletroforese .......................................................................... 62
Clonagem dos marcadores de “Sequence-characterized
Amplified Region – SCAR” de Eimeria spp. ..................... 62
Sequenciamento dos clones de Eimeria spp....................... 64
5
RESULTADOS.................................................................... 65
5.1
CONTAGEM DOS OOCISTOS DE Eimeria spp. OBTIDOS
DAS AMOSTRAS DE FEZES DE FRANGOS DE CORTE 65
5.2
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Eimeria PELA PCR
MULTIPLEX ........................................................................ 67
5.3
CONFIRMAÇÃO DA CLONAGEM DOS MARCADORES
DE
“SEQUENCE-CHARACTERIZED
AMPLIFIED
REGION – SCAR” DAS AMOSTRAS ................................ 70
4.3.1
4.3.1.2
4.3.2
4.3.3
4.3.3.1
4.3.3.2
4.3.3.3
4.3.3.4
4.3.4
4.3.5
4.3.6
6
DISCUSSÃO.........................................................................76
8
CONCLUSÕES ....................................................................83
9
CONSIDERAÇÕES FINAIS ..............................................84
REFERÊNCIAS ...................................................................................85
APÊNDICES E ANEXOS .................................................................102
1
INTRODUÇÃO
O Brasil produziu em 2012 aproximadamente 12.645.000
toneladas de carne de frango e exportou 3.508.000t. (UNITED STATES
DEPARTMENT OF AGRICULTURE, 2013). Com esse quadro figura
no cenário mundial como o primeiro País em exportação e terceiro em
produção e consumo.
Santa Catarina é o segundo maior produtor, ficando atrás apenas
do Paraná e primeiro em exportação no cenário Nacional (EMPRESA
DE PESQUISA AGROPECUÁRIA E EXTENSÃO RURAL DE
SANTA CATARINA/CENTRO
DE
SOCIOECONOMIA E
PLANEJAMENTO AGRÍCOLA, 2012). Segundo a Associação de
produtores de pintos de corte (APINCO) o alojamento brasileiro de
frangos de corte, acumulado no período de janeiro a julho de 2012, foi
de 3.516.529.964 cabeças, desses, 16,76% em Santa Catarina
(AVICULTURA INDUSTRIAL, 2012). A mesorregião Sul do estado
de Santa Catarina é a segunda maior mesorregião produtora de frangos
de corte do Estado, ficando atrás apenas da mesorregião Oeste
(INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA,
2013).
A coccidiose aviária é reconhecidamente a doença parasitária
que causa o maior impacto econômico na produção de frangos em todo
o mundo (ALLEN; FETTERER, 2002). Os custos globais com a
eimeriose aviária chegam a U$ 3 bilhões (SHIRLEY et al., 2004). No
Brasil, no ano de 1993 a perda foi estimada em 30 milhões de dólares
(KAWAZOE, 2000) e dez anos depois essas perdas dobraram (BRITO,
2003).
Os protozoários do gênero Eimeria multiplicam-se nas células
intestinais, destruindo o tecido, o que resulta em uma redução nos
processos digestivos e absortivos, levando a uma perda produtiva
(MCDOUGALD, 2003). O parasito possui um ciclo de vida homoxeno
e curto, associado a um grande potencial reprodutivo (MORRIS;
GASSER, 2006). A transmissão é facilitada pelo modelo industrial de
criação de frangos de corte, realizado sob alta densidade
(MCDOUGALD, 2003; SHIRLEY et al., 2007).
Atualmente é consenso a existência de sete espécies do gênero
Eimeria (E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E.
praecox e E. tenella) capazes de parasitar aves da espécie Gallus gallus
domesticus (MCDOUGALD, 2003; SCHNITZLER; SHIRLEY, 1999;
WILLIAMS et al., 1996).
18
A forma mais difundida de controle dessa enfermidade é a
utilização dos anticoccidianos, porém, o uso profilático dessas drogas
tem propiciado o aparecimento de cepas de Eimeria spp. resistentes ao
longo dos anos (ALLEN; FETTERER, 2002; CHAPMAN, 1997;
MARTIN et al., 1997; MCDOUGALD, 2003; MCDOUGALD et al.,
1986, 1987). Recentemente a proibição das drogas de uso contínuo na
produção animal tem sido debatida, sob a alegação de que possam estar
envolvidas no desenvolvimento da resistência em micro-organismos de
importância para a saúde pública (JORNAL OFICIAL DA UNIÃO
EUROPEIA, 2003; SHIRLEY et al., 2007).
Atualmente o controle com vacinas com oocistos vivos parece
ser a melhor alternativa dentre as possibilidades de substituição dos
anticoccidianos (CHAPMAN et al., 2002) e tem se tornado uma opção
crescente (ALLEN; FETTERER, 2002; CHAPMAN et al., 2002;
SHIRLEY et al., 2007). São compostas de oocistos vivos de Eimeria
spp. do tipo selvagem ou atenuadas, e possuem formulações variadas
com uma ou mais espécies (SHIRLEY; BEDRNÍK, 1997). As espécies
do gênero Eimeria são altamente imunogênicas, sendo que a partir de
uma infecção primária pode ser construída uma sólida imunidade para
desafios homólogos, porém, não ocorre imunidade cruzada entre as sete
espécies que acometem aves da espécie G. gallus domesticus (ALLEN;
FETTERER, 2002; MCDOUGALD, 2003). Assim, a correta
identificação das espécies e os estudos de ocorrência são importantes
para uma adequada compreensão da epidemiologia e, para o controle,
porque as espécies causam doenças diferentes, são imunologicamente
distintas e podem responder de forma desigual a algumas das drogas
anticoccidianas (JOYNER; LONG, 1974). A identificação das espécies
circulantes e qual sua relevância, possibilita que autoridades
governamentais, veterinários e produtores possam tomar decisões com
relação à composição e o uso de vacinas vivas para o controle da
coccidiose (MCDOUGALD et al., 1997), fundamentar a tomada de
decisão de organismos responsáveis pelo registro de vacinas
(CHAPMAN et al., 2005), diminuir o risco de introdução de espécies de
Eimeria não desejáveis em um determinado local (ALLEN;
FETTERER, 2002) e, alcançar a máxima eficácia da vacina (MORRIS
et al., 2007).
Segundo Joyner e Long (1974), as seguintes características
podem ser utilizadas na identificação: dimensões, morfologia e tempo
de esporulação dos oocistos; hospedeiro e local de desenvolvimento;
morfologia dos estágios endógenos, efeitos patogênicos; testes de
especificidade imunológica e a duração dos períodos pré-patente e
19
patente em infecções experimentais. Para isto, depende de pessoal
altamente treinado para que se evitem os erros de diagnóstico (LONG;
JOYNER, 1984), consomem bastante tempo e exigem o uso de animais
para experimentação (CONWAY; MCKENZIE, 2007; LONG; REID,
1982). Segundo Macpherson e Gajadhar (1993), a identificação das
espécies do gênero Eimeria que parasitam galinhas não pode ser feita de
forma segura utilizando-se apenas critérios de morfometria e as
características estruturais dos oocistos. Segundo Joyner e Long (1974),
na maioria das vezes, é necessária a análise de uma combinação de
características.
As técnicas moleculares têm se destacado na identificação de
Eimeira spp. (ALLEN; FETTERER, 2002; MORGAN et al, 2009). A
primeira técnica utilizada foi a eletroforese de isoenzimas (SHIRLEY,
1975). Em seguida outras técnicas foram utilizadas, como por exemplo:
Restriction fragment length polymorphism – RFLP (análise de
polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição), Southern
Blot (transferência de Southern), Pulsed-field gel electrophoresis –
PFGE (eletroforese em gel de campo pulsado), Field inversion gel
electrophoresis – FIGE (eletroforese em gel de campo de inversão),
Amplified fragment length polymorphism – AFLP (polimorfismo do
comprimento do fragmento amplificado), Random amplification of
polymorphic DNA – RAPD (amplificação aleatória do DNA
polimórfico), Sequence-characterized amplified region – SCAR
(amplificação de regiões de sequência caracterizada) e Polymerase
chain reaction – PCR (reação em cadeia da polimerase) (MORRIS;
GASSER, 2006).
Fernandez et. al., (2003a), desenvolveram uma Multiplex PCR,
baseado em SCAR’s, obtidos a partir da técnica de RAPD e
padronizaram a utilização desses “primers” de modo a permitir a
execução de um diagnóstico simultâneo das sete espécies de Eimeria em
uma reação.
A realização do presente trabalho teve como objetivo estudar a
ocorrência das espécies de Eimeria na mesorregião Sul do estado de
Santa Catarina, utilizando a técnica de Multiplex PCR.
2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1
GÊNERO Eimeria
O gênero Eimeria pertence ao filo Apicomplexa; classe
Sporozoea; subclasse Coccidia; ordem Eucoccidiorida; subordem
Eimeriorina; família Eimeriidae (KAWAZOE, 2000).
A primeira descrição desse protozoário ocorreu na Itália em
1873 por Rivolta e Silvestrini que relataram a presença de um parasito
no ceco de aves, o denominaram de Gregarina avium intestinalis e
afirmaram que os oocistos deste parasito, após liberados com as fezes,
passavam por um processo (esporulação) que alterava suas
características morfológicas (CHAPMAN, 2003). Em 1875, Schneider
descreveu o gênero Eimeria com o propósito de abrigar um parasito
encontrado no intestino de camundongos (COSTA; PAIVA, 2009).
Raillet e Lucet, em 1891 descreveram uma nova espécie denominada
por eles de Coccidium tenellum, a identificação foi baseada nas medidas
dos oocistos recuperados do ceco de galinhas (CHAPMAN, 2003;
COSTA; PAIVA, 2009). Em 1909, o Coccidium tenellum foi
redenominado E. tenella por Fantham (KAWAZOE, 2000), que em
1910 descreveu detalhadamente o ciclo de vida de um parasito de aves
do gênero Eimeria (CHAPMAN, 2003). Apesar de renomeada a
espécie, a denominação Coccidium tenellum foi amplamente utilizada,
visto que termos como “coccidia” e “coccidiose” permanecem
amplamente empregados (COSTA; PAIVA, 2009). Em 1926, Tyzzer
relatou que a coccidiose cecal era causada por uma espécie de Eimeria
(E. tenella) diferente das espécies encontradas no intestino delgado e,
em 1929, descreve pela primeira vez três dessas espécies (E. mitis, E.
maxima e E. acervulina). Johnson, em 1928 descreveu duas novas
espécies de Eimeria de galinhas, E. praecox e E. necatrix (CHAPMAN,
2003). Levine relatou outras duas espécies, E. brunetti (1942) e E.
hagani (1938). Esta última teve apenas uma breve e, portanto,
insuficiente descrição para que pudesse ser considerada válida como
espécie (KAWAZOE, 2000). Em 1964, Edgar e Siebold descreveram
uma nova espécie, E. mivati, que foi comparada com todas as outras
espécies do gênero Eimeria que acometem galinhas e os autores
relataram que essa espécie poderia ser confundida com E. acervulina e
E. mitis (COSTA; PAIVA, 2009). Shirley, em 1975, utilizando os
métodos de eletroforese de isoenzimas (zimodemas) e de imunidade
cruzada para a identificação das espécies, não encontrou validade na
21
E. mivati, pois, segundo esse autor, as técnicas demonstraram tratar-se
de uma amostra mista, composta de E. mitis e E. acervulina
(KAWAZOE, 2000).
2.1.1
Ciclo evolutivo
O ciclo evolutivo das espécies do gênero Eimeria que parasitam
galinhas é complexo, passando por várias etapas (Figura 1). Inicia com a
ingestão do oocisto esporulado, forma infecciosa do parasito que contém
quatro esporocistos, cada um com dois esporozoítos. O oocisito e
esporocistos são rompidos, liberando no trato intestinal os esporozoítos,
que penetram nos enterócitos, sendo que cada espécie tem predileção
por um determinado local no intestino das aves. O esporozoíto, depois
de penetrar na célula intestinal, inicia a fase de reprodução assexuada ou
merogonia dando origem a um grande número de novas formas
conhecidas por merozoítos (CONWAY; MCKENZIE, 2007). Segundo
McDonald e Shirley (2009), dependendo da espécie e/ou cepa ocorrem
de três a quatro merogonias. A última geração de merozoítos diferenciase em macrogamontes e microgamontes que originam os gametas
femininos e masculinos, respectivamente, e esses se unem para formar o
zigoto e em seguida o oocisto, que é excretado junto com as fezes
(KAWAZOE, 2000). “Cada evento de fertilização pode envolver
gametas da mesma população parental (autofertilização) ou gametas de
populações geneticamente diferentes (fecundação cruzada).”
(SHIRLEY; HARVEY, 2000). No ambiente ocorre a esporogonia, que é
uma forma de reprodução assexuada, e inicia-se com uma meiose
seguida de duas mitoses, gerando um oocisto esporulado (FORTES,
2004).
2.2
CARACTERÍSTICAS BIOLÓGICAS, MORFOLÓGICAS E
ALTERAÇÕES CAUSADAS NO HOSPEDEIRO PELAS ESPÉCIES
DE Eimerias QUE PARASITAM AVES DA ESPÉCIE Gallus gallus
domesticus.
2.2.1
Eimeria acervulina
Desenvolve-se na porção anterior do intestino delgado ao longo
da alça duodenal, sendo que em infecções severas pode ser encontrada
avançando para o jejuno e íleo. Essa espécie causa alterações visíveis da
mucosa e serosa do intestino que vão desde pontos brancos a listras
brancas transversais que podem estar coalescentes. As lesões são
22
compostas de esquizontes, gametócitos e oocistos (MCDOUGALD,
2003). Segundo Conway e McKenzie (2007), em esfregaços do local
das lesões são visualizados gametócitos e oocistos não esporulados.
Bordin (1999) citou que essa espécie localiza-se superficialmente no
epitélio da mucosa intestinal, sobre as vilosidades. Kawazoe (2000)
citou que essa espécie geralmente não causa mortalidade, porém, causa
uma profunda depressão no ganho de peso e aumento na taxa de
conversão alimentar das aves acometidas. Os oocistos dessa espécie são
ovóides. Segundo Long e Reid (1982) o período pré-patente, o tempo
mínimo de esporulação, a forma e as medidas dos oocistos variam entre
as espécies de Eimeria (Figura 2).
Figura 1 – Ciclo biológico do gênero Eimeria
Fonte: adaptado de Conway e McKenzie (2007).
23
2.2.2
Eimeria maxima
Localiza-se na região média do intestino delgado (jejuno e íleo),
próximo ao divertículo do saco da gema, mas em infecções severas pode
ser ascendente, alcançando o duodeno e/ou descendente até a junção
ileocecal (CONWAY; MCKENZIE, 2007). Causa lesões hemorrágicas
associadas a um espessamento da mucosa intestinal, petéquias podem
ser vistas na serosa e o intestino pode apresentar uma dilatação na região
afetada, chamada de “balonamento”, estando repleto de conteúdo
mucoso de coloração amarela ou laranja, podendo conter sangue. É
responsável pela perda de peso, aumento na taxa de conversão alimentar
e despigmentação das aves acometidas (CONWAY; MCKENZIE, 2007;
MCDOUGALD, 2003). Nessa espécie o maior dano tecidual ocorre na
fase de reprodução sexual, pois, possui grandes macrogametócitos de
localização subepitelial (MCDOUGALD, 2003). Pode causar
mortalidade de até 20% (SCHNITZLER; SHIRLEY, 1999). Os oocistos
de E. maxima são ovóides de coloração característica, marrom dourada
e, com superfície irregular, são os maiores oocistos dentre as espécies de
Eimeria que parasitam aves da espécie G. gallus domesticus (LONG;
REID, 1982).
Figura 2 – Período pré-patente (PPP) e tempo mínimo para esporulação
(TME) a 30°C, em horas e, medidas dos oocistos por espécie
de Eimeria em micrometros.
ESPÉCIE
PPP (h) TME (h)
MEDIDAS (μm)
E. acervulina
97
17
17,7 a 20,2 X 13,7 a 16,3
E. maxima
121
30
21,5 a 42,5 X 16,5 a 29,8
E. tenella
115
18
19,5 a 26,0 X 16,5 a 22,8
E. mitis
93
15
11,7 a 18,7 X 11,0 a 18,0
E. praecox
83
12
19,8 a 24,7 X 15,7 a 19,8
E. necatrix
138
18
13,2 a 22,7 X 11,3 a 18,3
E. brunetti
120
18
20,7 a 30,3 X 18,1 a 24,2
Fonte: adaptado de Long e Reid (1982).
2.2.3
Eimeria tenella
Espécie do gênero Eimeria altamente patogênica, responsável
por surtos com alta morbidade e mortalidade, causando também queda
no ganho de peso e aumento na taxa de conversão alimentar. Todo o
24
ciclo (assexuado e sexuado) ocorre nos cecos causando uma tiflíte. Os
esquizontes desenvolvem-se na lâmina própria do intestino e os maiores
danos são causados durante a reprodução assexuada, pela segunda
geração de grandes esquizontes contendo centenas de merozoítos
(BORDIN, 1999; MCDOUGALD, 2003). O mecanismo que causa a
morte das aves não está completamente elucidado. Segundo Kawazoe
(2000), acredita-se que o parasito interfere no mecanismo de coagulação
sanguínea devido a falhas no metabolismo da vitamina K, agravando o
quadro hemorrágico. Porém, a hemorragia por si só não é responsável
pela morte, provavelmente ocorre interação de fatores tóxicos e
bacterianos durante a infecção (MCDOUGALD, 2003). Os oocistos de
E. tenella são ovóides (LONG; REID, 1982).
2.2.4
Eimeria praecox
Desenvolve-se no terço superior do intestino delgado,
principalmente na alça duodenal, possui localização epitelial. O
conteúdo intestinal pode apresentar-se aquoso, com presença de muco, e
algumas vezes, petéquias podem ser visualizadas na mucosa. Essa
espécie pode causar uma diminuição no ganho de peso e aumento na
taxa de conversão alimentar nas aves (MCDOUGALD, 2003). Os
oocistos são ovóides (LONG; REID, 1982).
2.2.5
Eimeria mitis
Seu desenvolvimento ocorre no intestino delgado desde o
divertículo do saco da gema até a junção ileocecal, não formam colônias
e localizam-se superficialmente no epitélio da mucosa do intestino
delgado. Desta forma causam poucas alterações visíveis como, intestino
pálido e flácido (MCDOUGALD, 2003) e com espesso exsudato
(LONG; REID, 1982). Pode causar queda de peso, palidez das aves e
piora na conversão alimentar (LONG; REID, 1982; MCDOUGALD,
2003). Essa espécie apresenta oocistos subesféricos que são menores
entre as Eimerias spp. que parasitam frangos (LONG; REID, 1982).
Tem-se demonstrado que, mesmo espécies como E. praecox e
E. mitis, consideradas muitas vezes inócuas, podem causar uma
significativa queda no ganho de peso (JORGENSEN et al., 1997;
MCDOUGALD et al., 1997). Segundo Willians (1998), o fornecimento
de 500.000 oocistos esporulados de E. mitis e E. praecox, foi
responsável por uma queda no ganho de peso médio de 20% e 25%,
respectivamente, durante sete dias pós-infecção.
25
2.2.6
Eimeria necatrix
Essa espécie desenvolve-se inicialmente no intestino delgado
(jejuno e íleo, próximo ao divertículo do saco da gema), onde ocorrem
as merogonias (reprodução assexuada), e em seguida, a terceira geração
de esquizontes migra para o ceco onde acontece a reprodução sexuada e
a formação dos oocistos. As lesões que ocorrem no intestino delgado
são causadas principalmente pela segunda geração de esquizontes, de
localização subepitelial, que alcançam a camada muscular e os vasos
sanguíneos, causando um dano extenso no tecido. Podem ser
visualizadas alterações como uma acentuada dilatação ou
“balonamento”, com um aumento de até duas vezes o tamanho normal
do intestino na região afetada. Na serosa se observam placas brancas
formadas pela aglomeração de esquizontes e petéquias, o interior do
intestino pode estar repleto de sangue, fluídos e muco. É altamente
patogênica e causa alta morbidade e mortalidade, queda no ganho de
peso e aumento na taxa de conversão alimentar. Porém, é pouco
prolífera e, devido à competição com outras espécies, é responsável por
surtos tardios, acometendo principalmente, aves de vida longa ao redor
de 9 a 14 semanas de idade, como por exemplo, reprodutoras, sendo rara
a ocorrência de quadros clínicos em frangos devido ao curto ciclo dessas
aves (MCDOUGALD, 2003). Os oocistos de E. necatrix são ovóides
oblongos (LONG; REID, 1982).
2.2.7
Eimeria brunetti
Essa espécie geralmente desenvolve-se na porção inferior do
intestino delgado, entre o divertículo do saco da gema e a junção
ileocecal, podendo se estender por todo o intestino delgado e grosso em
infecções massivas, a localização da segunda geração de esquizontes é
subepitelial. É considerada uma espécie altamente patogênica, causa
lesões que variam desde um engrossamento da mucosa com a presença
de petéquias, em infecções leves, até uma necrose e descamação do
epitélio com a formação de uma membrana diftérica cobrindo a
superfície intestinal (BORDIN, 1999; MCDOUGALD, 2003). Pode
causar mortalidade, diminuição no ganho de peso e aumento na taxa de
conversão alimentar (MCDOUGALD, 2003). E. brunetti possui oocistos
ovoides (LONG; REID, 1982).
2.3
CONTROLE DA COCCIDIOSE AVIÁRIA
26
2.3.1
Anticoccidianos
No passado a quimioterapia com a finalidade de controlar a
coccidiose nas produções avícolas era feita apenas de forma curativa.
Atualmente, quase que a totalidade dos lotes de frangos recebe uma
medicação preventiva, enquanto que os tratamentos ficaram relegados a
um último recurso (MCDOUGALD, 2003).
Segundo Ferreira e Revolledo (2005) há relatos de que a
primeira substância empregada para o tratamento da coccidiose, por
volta de 1935, foi o enxofre. Na década seguinte foram introduzidas as
sulfonamidas e a nicarbazina, e na década de 1970 a monensina. A
nicarbazina e a monensina continuam sendo muito utilizadas.
Os anticoccidianos são classificados em dois grupos: os
sintéticos e os ionóforos de poliéter. Esses últimos são produzidos a
partir da fermentação de micélios, principalmente do gênero
Streptomyces (BUTAYE et al., 2003) e são considerados drogas mais
eficientes no controle da eimeriose, pois, devido ao seu intrincado modo
de ação, são menos susceptíveis ao desenvolvimento da resistência pelas
espécies de Eimeria (CHAPMAN, 1997; KAWAZOE, 2000). Formam
complexos com íons, facilitando a entrada de Na + e a grande quantidade
desse íon no meio intracelular provoca um aumento de líquido no
interior da célula do parasito, causando a parada da função mitocondrial
e posteriormente a ruptura da membrana celular (CHAPMAN, 1997;
CHAPMAM et al., 2010; DANFORTH; RUFF, 1999; FERREIRA;
REVOLLEDO, 2005; MCDOUGALD, 2003). Segundo Danforth e Ruff
(1999), o grupo dos ionóforos permanece sendo o esteio principal no
controle da coccidiose.
Os anticoccidianos sintéticos possuem um mecanismo de ação
mais simples, que os tornam mais susceptíveis ao desenvolvimento de
resistência pelos parasitos (KAWAZOE, 2000). As sulfonamidas são
análogas e competidoras do ácido p-aminobenzóico (PABA) que é
essencial para o metabolismo do ácido fólico, rota importante para a
síntese de RNA e DNA do parasito (CHAPMAM, 1997; FERREIRA;
REVOLLEDO, 2005; MCDOUGALD, 2003). Agem impedindo a
redução do diidrofolato para tetraidrofolato pela enzima diidrofolato
redutase timidilato sintetase (DHFR-TS) (CHAPMAM, 1997).
O amprólio é um antagonista da tiamina, impede a absorção
desse aminoácido inibindo, com isso, a síntese do ácido fólico
(FERREIRA; REVOLLEDO, 2005; MCDOUGALD, 2003).
Outras drogas sintéticas interferem na geração de energia ou no
metabolismo mitocondrial do parasito, como por exemplo, o
27
decoquinato, clopidol, robenidina e, apesar do mecanismo de ação da
nicarbazina não estar completamente elucidado acredita-se que, esta
também atue na mitocôndria (DANFORTH; RUFF, 1999; CHAPMAM,
1997). Supõe-se que a robenidina impeça a fosforilação oxidativa
(CHAPMAM, 1997; FERREIRA; REVOLLEDO, 2005). O decoquinato
atua bloqueando o transporte de elétrons próximo ao citocromo b na
mitocôndria do parasito, e o clopidol possui o mesmo mecanismo, mas
em um local diferente da mitocôndria, impossibilitando a resistência
cruzada entre estas drogas (CHAPMAM, 1997). Anticoccidianos mais
recentes como o diclazuril e o toltrazuril atuam na cadeia respiratória do
parasito (FERREIRA; REVOLLEDO, 2005).
2.3.1.1
Resistência aos anticoccidianos
O desenvolvimento da resistência pelo parasito pode ser
definido como um decréscimo da sensibilidade a uma droga ao longo do
tempo e pode ser parcial ou completa (CHAPMAN, 1997). A ampla
utilização dos anticoccidanos para o controle da eimeriose aviária
permite a exposição frequente de populações de Eimeria spp. a uma
determinada classe de drogas, podendo induzir à resistência
(CHAPMAN, 1997; DANFORTH; RUFF, 1999; MCDOUGALD, 2003;
ZHANG et al., 2013). McDougald (2003) citou que a resistência às
drogas é um fenômeno genético, e quando estabelecido em uma
população de Eimeria spp., pode permanecer por muitos anos. Porém,
segundo Champan (1997) há relatos de reversão da resistência em
populações de parasitos para uma determinada droga, após um período
administrando uma droga não relacionada.
Os mecanismos que levam ao desenvolvimento de cepas
resistentes aos anticoccidianos não são totalmente conhecidos, Chapman
(1997) citou que, para o amprólio, acredita-se que ocorrem mudanças a
nível molecular, que alteram o receptor alvo, impedindo a ligação da
droga em cepas resistentes; para as sulfonamidas, sugere-se que a
resistência seja devido à duplicação do cromossomo ou mutação em um
gene, resultando na amplificação da diidrofolato redutase timidilato
sintetase (DHFR-TS) e; para os ionóforos, acredita-se que envolva
mudanças bioquímicas na composição da membrana do parasito ou na
expressão de genes que produzem uma proteína, chamada de Pglicoproteína, responsável por aumentar a atividade da bomba de
Na+/K+, sendo que a expressão da resistência está relacionada com
diferenças na acumulação de ionóforo pelos parasitos. Zhang et al.
(2013), em um trabalho para investigar a resistência aos ionóforos,
28
relatou que a resistência severa a maduramicina estava associada a uma
maior dose fornecida da droga. O complexo modo de ação dos ionóforos
torna o processo de resistência mais difícil e, portanto, mais demorado
para acontecer, mesmo assim, essa classe de anticoccidianos tem-se
demonstrado vulnerável (CHAPMAN, 1997; CHAPMAM et al., 2010;
KAWAZOE, 2000).
O processo de disseminação da resistência em populações de
Eimeria spp. se da por meio de seleções, as populações que sobrevivem
a utilização de um determinado anticoccidiano, sofrem uma pressão de
seleção e podem desenvolver resistência a droga, que é uma
característica estável, podendo ser transmitida para as próximas
gerações e permanecendo por vários anos em uma população de Eimeria
spp., mesmo que a população siga sem a pressão daquela droga
(CHAPMAN, 1997; MCDOUGALD, 2003). A maioria das drogas atua
na fase de reprodução assexuada, quando o parasito é haploide
(esporozoítos, esquizontes e merozoítos). Estes compostos podem
eliminar facilmente da população os indivíduos sensíveis à droga, e em
consequência permitir a multiplicação de indivíduos mais resistentes,
durante a reprodução assexuada. A difusão dessa característica ocorre na
fase de reprodução sexuada, com os cruzamentos das características de
resistência a uma ou múltiplas drogas, gerando novas populações com
fenótipos de resistência para um ou vários anticoccidianos (CHAPMAN,
1997; DANFORTH; RUFF, 1999). A resistência também pode ocorrer
de forma cruzada, acontece quando uma cepa portadora de um fenótipo
de resistência a uma droga pode ser totalmente ou parcialmente
resistente a outro anticoccidiano que possua o mesmo ou semelhante
mecanismo de ação. Acredita-se que a resistência cruzada possa ocorrer
entre o grupo dos ionóforos, mas isso não foi devidamente comprovado
e, entre diclazuril e toltrazuril, indicando que exibem o mesmo modo de
ação (CHAPMAN, 1997). A velocidade com que ocorre o
estabelecimento da resistência a um anticoccidiano está relacionada com
o modo de ação da droga, quanto mais simples, mais rápida é a
instauração da resistência (MCDOUGALD, 2003). Segundo Ferreira e
Revolledo (2005) de acordo a velocidade de aparecimento da
resistência, os anticoccidianos podem ser classificados como: muito
rápido (glicosaminas); rápido (buquinolato, decoquinato e diclazuril);
menos rápido (clopidol); moderado (sulfonamida e robenidina); lento
(amprolium, zoalene e nitrobenzamidas) e muito lento (nicarbazina e
ionóforos).
Com o objetivo de evitar ou atrasar o desenvolvimento da
resistência às drogas, são utilizados alguns tipos de manejo dessas
29
substâncias, como por exemplo, a rotação de drogas, que consiste em se
utilizar um anticoccidiano por alguns ciclos de criação e posteriormente
substituí-lo. Outra forma de uso dos anticoccidianos são os programas
duais, onde se utiliza um determinado anticoccidiano na fase inicial e de
crescimento do frango (01-21 dias), que é substituído por outro na fase
de terminação (22-42 dias) (KAWAZOE, 2000).
A utilização de vacinas com oocistos vivos tem demonstrado
ser uma ferramenta interessante para restabelecer a sensibilidade às
drogas. Mathis e Broussard (2006) avaliaram a resistência de cepas de
Eimeria spp. ao diclazuril, em isolados provenientes de complexos
aviários antes e após a utilização desta droga. Após a coleta inicial de
oocistos (isolado 1), um programa anticoccidiano sem diclazuril na
ração foi utilizado em quatro complexos (A, B, C, D) e, vacinação em
três complexos (E, F, G). O isolado 2 foi coletado dois ciclos após a
mudança dos programas e, a partir de testes de desafio em aves
medicadas com diclazuril, evidenciou-se que a redução média do ganho
de peso causada pelos oocistos provenientes dos complexos vacinados e
medicados foi significativamente diferente. Os oocistos obtidos dos
complexos E, F, G provocaram uma redução média no ganho de peso de
4,4% em frangos desafiados e medicados com diclazuril na ração,
quando comparados com frangos controle não desafiados, oocistos
provenientes dos complexos A, B, C, e D causaram uma redução de
9,9% do ganho de peso em frangos desafiados e, nos controles não
medicados desafiados a redução do ganho de peso foi de 22,1%. Da
mesma forma, o escore médio de lesão provocado pelos diferentes
isolados foi significativamente diferente, oocistos provenientes dos
complexos E, F e G provocaram um escore médio 0,7 menor que dos
complexos de A, B, C e D. Quanto ao isolado 1, não houve diferença
significativa na redução do ganho de peso e no escore de lesão causados
pelos oocistos, quando comparados as cepas obtidas de ambos os
complexos. Portanto, concluiu-se que o nível de sensibilidade ao
diclazuril aumentou nos complexos que usaram a vacinação. Peek e
Landman (2006) avaliaram a resistência ao diclazuril e a monensina em
20 isolados de campo. Para isso, grupos controle não medicados e não
desafiados e, não medicados e desafiados, foram comparados com
grupos tratados com diclazuril e monensina e, desafiados. Foram
mensurados o escore de lesão e o número de oocistos por grama de fezes
(Oopg) e, a avaliação foi executada pelo Teste de Sensibilidade
Anticoccidiana (TSA). Como resultado, encontraram que 68% e 53%
das cepas de E. acervulina eram total ou parcialmente resistentes ao
diclazuril e monensina, respectivamente. A resistência foi menos
30
frequente entre as cepas de E. maxima, 38% e 50% de resistência total
ou parcial ao diclazuril e monensina, respectivamente e, cepas de E.
tenella, 23% e 38% de resistência total ou parcial ao diclazuril e
monensina, respectivamente. Na comparação estatística dos resultados
obtidos com cepas provenientes de granjas que utilizavam um programa
de controle baseado em anticoccidianos com aquelas de granjas que
utilizavam a vacinação houve diferença significativa. Foram
encontrados os seguintes percentuais de cepas que apresentavam
sensibilidade total ao diclazuril em lotes que utilizavam vacinas (VAC),
comparado com lotes que utilizavam anticoccidianos (ANT): E.
acervulina (50% VAC e 9% ANT), E. maxima (89% VAC e 14%
ANT), E. tenella (100% VAC e 20% ANT) e, sensíveis a monensina: E.
acervulina (50% VAC e 0% ANT), E. maxima (55% VAC e 14%
ANT), E. tenella (50% VAC e 20% ANT). Jenkins et al. (2010), a partir
de testes de sensibilidade a drogas, comparando o ganho de peso e a
conversão alimentar, concluíram que os oocistos de Eimeria spp.
obtidos de operações que utilizavam vacinas exibiram maior
sensibilidade a salinomicina em comparação com oocistos de granjas
que utilizavam anticoccidianos. O ganho de peso em frangos medicados
com salinomicina e infectados com oocistos provenientes de granjas que
utilizavam anticoccidianos foi 3% maior em relação ao controle
desafiado não medicado, enquanto que nos frangos desafiados com
oocistos provenientes de granjas que utilizavam Coccivac B ou
Inovocox, o controle com a salinomicina promoveu um maior ganho de
peso, 25% e 33%, respectivamente, em relação ao controle desafiado
não medicado. Também foi observada uma melhoria, estatisticamente
significativa, na taxa de conversão alimentar de frangos de corte
utilizando salinomicina e desafiados com oocistos obtidos durante o uso
de Coccivac B ou Inovocox, que não ocorreu em frangos utilizando
salinomicina e infectados com oocistos obtidos de operações durante o
uso de anticoccidianos. Long et al. (1976) tem sugerido que as cepas de
parasitas sensíveis as drogas tendem a dominar na ausência de
medicação, as cepas resistentes, possivelmente devido a uma vantagem
reprodutiva.
A resistência aos anticoccidianos está disseminada e tem sido
relatada em várias partes do mundo (MCDOUGALD, 2003). Em um
estudo em 15 regiões de produção de frangos de corte no Brasil e na
Argentina, foram encontradas populações de Eimeria resistentes a
monensina, narasina, salinomicina, maduramicina, clopidol, amprólio e
nicarbazina (MCDOUGALD et al., 1987). McDougald et al. (1986)
fizeram um estudo nos 12 maiores estados produtores de frangos dos
31
EUA e encontraram resistência para monensina, salinomicina,
nicarbasina, amprólio/etopabato. Stephan et al. (1997) estudaram dez
amostras de campo de Eimeria spp., utilizando o Índice Global (IG),
dessas, nove apresentaram resistência e, a maioria com resistência a
vários anticoccidianos. Uma amostra contendo E. maxima, E. acervulina
e E. mitis apresentou resistência total contra seis drogas diferentes
(maduramicina, monensina, nicarbazina, halofuginona, robenidina e
diclazuril), resistência parcial a salinomicina, e somente o toltrazuril foi
eficaz. As amostras de campo foram propagadas em aves para a
obtenção de isolados puros de Eimeria spp., dessas, 55% herdaram a
resistência das amostras originais, coletadas no campo. Chapman (1997)
citou que a longo prazo, pode ser adquirida uma multi resistência parcial
ou total ao conjunto das drogas que foram empregadas durante um
determinado período em uma exploração avícola. Li et al. (2004)
estudaram a sensibilidade a anticoccidianos de cepas de E. acervulina,
E. maxima e E. tenella isoladas de produções avícolas no sul da China.
Utilizaram o índice anticoccidial (IA) e percentagem ótima de atividade
anticoccidiana (POAA) e como resultados encontraram que E.
acervulina, E. maxima e E. tenella foram resistentes a monensina,
sensíveis a salinomicina e lasolacida e parcialmente sensíveis a
maduramicina e senduramicina. Guo et al. (2007) testaram a eficácia da
maduramicina e decoquinato em duas cepas de laboratório de E. tenella
e em 20 isolados de campo de Eimeria spp., obtidos de operações
avícolas na China. Dezoito isolados foram resistentes a maduramicina,
enquanto o decoquinato a 20 ppm controlou todos os isolados de campo.
Dez dos 20 isolados eram oriundos de propriedades onde a
maduramicina havia sido usada continuamente por mais de dois anos,
enquanto o restante foi oriundo de propriedades onde a maduramicina
havia sido usada antes de ser substituída por diclazuril e, esse, usado por
dois anos antes de amostras de fezes serem obtidas. Segundo os autores,
não houve diferença na sensibilidade para maduramicina entre as
granjas onde esta havia sido usada continuamente, das demais, onde a
maduramicina foi substituída pelo diclazuril por dois anos. Os autores
concluíram que o decoquinato tem um valor potencial como um
anticoccidiano para uso em frangos na China e em outros países, onde
não tenha sido usado anteriormente. Abbas et al. (2008) conduziram um
ensaio para avaliar a sensibilidade a anticoccidianos em três isolados de
campo de E. tenella obtidos de operações avícolas do Paquistão,
utilizando o IG. Todos os isolados de E. tenella apresentaram resistência
parcial contra a salinomicina e, vários graus de sensibilidade foram
observados contra maduramicina e clopidol. O IG (1 = muito boa
32
eficácia; 2 = boa eficácia, 3 = eficácia limitada, 4 = parcialmente
resistente e 5 = resistente) dos grupos medicados, quando comparado
com os controles não medicado não desafiados e não medicado
desafiados, demonstrou que todos os isolados de E. tenella possuíam o
mesmo nível de sensibilidade à salinomicina (IG=4). Contudo, os
isolados de E. tenella mostraram diferentes níveis de susceptibilidade à
maduramicina (Isolado 1 = IG 4, Isolado 2 = IG 2, Isolado 3 = IG 3) e
clopidol (Isolado 1 = IG 4, Isolados 2 e 3 = IG 2). O isolado 1
apresentou resistência cruzada entre salinomicina e maduramicina e,
resistência múltipla entre salinomicina, maduramicina e clopidol.
Györke, et al. (2011) obtiveram isolados de Eimeria de 14 lotes de
frangos de corte comerciais da Romênia. Foram identificados quatro
espécies de Eimeria pela PCR: E. acervulina (88%), E. tenella (64%),
E. maxima (28%) e E. praecox (12%). Cepas de E. acervulina e E.
tenella, provenientes de sete lotes, foram submetidas a testes de
resistência a anticoccidianos por meio do TSA, com base no percentual
de redução do escore de lesão. O ganho de peso, conversão alimentar e
oocistos por grama de fezes também foram avaliados. Segundo os
autores, foi encontrada resistência em 50% dos isolados de campo de E.
acervulina a monensina, salinomicina, narasina/nicarbazina e
robenidina, em 37,5% a lasalocida; 100% de isolados de campo de E.
tenella a robenidina, 50% a monensina, narasina/nicarbazina e diclazuril
e 25% a salinomicina e lasalocida. A E. acervulina foi sensível a
maduramicina e diclazuril e E. tenella a maduramicina. Zhang et al.
(2013) durante quatro anos coletaram fezes de 545 propriedades em
nove diferentes regiões geográficas da China, juntamente com o
histórico clínico das aves e, compararam o Oopg com a morbidade dos
frangos e a presença de fezes com sangue. Durante as coletas, frangos
encontrados mortos ou doentes foram necropsiados e as lesões
encontradas nos cecos foram submetidas a um esfregaço. Os autores
relataram que o limite para a doença estava na faixa de 5 X 10 4 oocistos
por grama de fezes, sendo que em propriedades com >5 X 10 4 oocistos
por grama de fezes, havia um quadro de coccidiose. Quanto à
sensibilidade das cepas aos anticoccidianos, concluíram que um
princípio de instauração da resistência estava na recuperação de 2 X 10 4
oocistos, já com a excreção de >5 X 104 oocistos por grama de fezes,
tratava-se de um alto grau de resistência. Quinze isolados de E. tenella
foram submetidos a testes para verificar a sensibilidade a maduramicina,
utilizando o IA (1 = resistência severa; 2 = resistência moderada; 3 =
resistência leve e 4 = ausência de resistência), para isso foram
mensurados parâmetros como ganho de peso, mortalidade, escore de
33
lesão, taxa de excreção de oocistos. Como resultado, observaram que
isolados expostos a 2 – 5 mg/kg maduramicina desenvolveram
resistência leve, a 5 mg/kg resistência severa e, isolados de granjas em
que não se utilizaram maduramicina eram sensíveis, sugerindo que a
aquisição de resistência está relacionada a dose de anticoccidiano
utilizada.
Arabkhazaeli et al. (2013) avaliaram a resistência a
anticoccidianos em três isolados de campo de Eimeria spp. Foram
registrados dados como, o ganho de peso, consumo de ração, escore de
lesão, Oopg, mortalidade e conversão alimentar e, utilizados três índices
para avaliar a eficácia: Atividade anticoccidiana ótima (AAO), onde são
utilizados os parâmetros como as taxa de crescimento e sobrevivência;
TSA, calculada com base na redução do escore médio de lesão e; o IG
que utiliza para a avaliação o ganho de peso, a conversão alimentar,
Oopg, o escore de lesão e a mortalidade. Segundo os autores, tanto a IG
e AAO deram resultados semelhantes e, mesmo sendo o primeiro teste
mais preciso, porém, considerando a facilidade de pesagem das aves, em
comparação com a avaliação do escore de lesão e Oopg, também,
porque o peso é o principal fator de rentabilidade na indústria,
concluíram que pode ser aconselhável propor a utilização do AAO como
um índice único, para avaliação da resistência a fármacos de modo que
as pesquisas com base em um método comum possam ser comparadas.
Quanto à resistência, foi relatada resistência total ao amprolio +
etopabato, resistência parcial a salinomicina e; resistência parcial a total
para o diclazuril. A última droga disponibilizada para uso foi o
diclazuril em 1990 e o primeiro relato de cepas resistentes para essa
droga ocorreu no Brasil em 1994 (CHAPMAN, 1997). Chapman (1997)
citou que um dos motivos da escassez de novos produtos é o fato de que
o método tradicional para o desenvolvimento de novas drogas é um
processo difícil, executado a partir de testes aleatórios com vários
compostos. Danfort e Ruff (1999) citaram que o alto custo para o
desenvolvimento de novos anticoccidianos tem desestimulado muitas
empresas farmacêuticas a desenvolverem novos compostos. Williams
(1998) citou que o investimento para o desenvolvimento de uma nova
molécula varia de 50 a 100 milhões de dólares.
2.3.2
Vacinação
As espécies de Eimeria aviária são altamente imunogênicas e,
com uma ou mais passagens pelo hospedeiro promovem o
desenvolvimento de uma sólida imunidade contra desafios subsequentes
(ALLEN; FETTERER, 2002).
34
Lillehoj (1999) e Kawazoe, (2000) citaram que frangos
infectados com Eimeria produzem anticorpos parasito-específicos, por
meio de linfócitos B ativados (células T dependentes). Essas
imunoglobulinas estão presentes na circulação e nas secreções mucosas,
e atuam somente na fase extracelular do parasito. Lillehoj (2005) e,
McDonald e Shirley (2009) citaram que foi constatado o carater
secundário da imunidade humoral em aves imunes, que após
bursectomizadas, permaneceram resistentes as infecções.
Segundo Lillehoj (1999) o controle da coccidiose é
desempenhado, principalmente, pela imunidade celular, tanto por
mecanismos de citotoxidade, desencadeados pelos linfócitos T nas
células parasitadas, como pela produção de citoquinas como o interferon
gama (IFNγ). A importância da imunidade celular foi comprovada em
experimentos com o fornecimento, para aves imunes contra Eimeria
spp., de drogas que causam imunodepressão, como ciclosporina,
betametasona e dexametasona e, por meio de timectomia. Ambos os
tratamentos tornaram essas aves susceptíveis as infecções com Eimeria
spp.
As vacinas contendo oocistos vivos permanecem sendo a única
alternativa prática para a substituição dos anticoccidianos no controle da
coccidiose em criações industriais de frangos de corte, conforme
relataram Chapman et al. (2002) e Williams (1998). Existem dois
grupos de vacinas, contendo parasitos vivos do tipo selvagem ou
atenuados, ambas com formulações variadas, contendo uma ou mais
espécies de Eimeria que parasitam galinhas (SHIRLEY; BEDRNIK,
1997).
A vacinação com oocistos vivos requer um eficiente e prático
sistema de distribuição das doses de oocistos aos frangos, para uma
exposição sincronizada de todas as aves de um lote a um pequeno e
uniforme número de parasitos (DANFORTH, 1998). As vacinas são
aplicadas via spray em incubatório ou via água de bebida, ração ou gel
comestível na granja. Atualmente tem sido introduzida a vacinação “in
ovo”, executada no 18° dia de incubação.
Segundo Chapman et al. (2002) espécies menos patogênicas
presentes no ambiente, mas que não estejam inclusas na vacina, podem
afetar o desempenho do lote, e terem sua incidência aumentada,
resultado da seleção imunológica.
Outro problema observado é a variação imunogênica entre
cepas de uma mesma espécie de Eimeria, relatado com frequência em E.
maxima. Segundo Danforth (1998) o uso de uma vacina contendo uma
cepa de E. maxima canadense que conferiu 100% de proteção contra
35
desafios homólogos, protegeu apenas 3% e 47% contra isolados de
Maryland e Flórida (Estados Unidos), respectivamente. A vacina foi
reformulada, com a adição das duas cepas de E. maxima e, dessa forma
foi capaz de conferir proteção aos desafios de campo.
McDonald e Shirley (2009) citaram que com o propósito de
ampliar o espectro de proteção algumas vacinas, têm incluído em sua
formulação duas cepas de E. maxima com propriedades imunogênicas
distintas e, para o controle mais eficiente de variantes regionais, têm
surgido alternativas de vacinas formuladas com cepas autóctones como,
por exemplo, na Austrália e China (MCDONALD; SHIRLEY, 2009).
Segundo Danforth (1998) antes da utilização de uma vacina o
ideal e que se faça um estudo de proteção contra as cepas locais
(DANFORTH, 1998). Chapman et al. (2002) relataram que uma
vantagem é que as vacinas podem ser moldadas às necessidades
regionais, apenas com a inclusão de cepas autóctones e, isso a um baixo
custo, diferente do processo de desenvolvimento de uma nova droga.
Chapman et al. (2002) e Williams (1998) citaram que a rotação
de programas utilizando vacinas e anticoccidianos podem trazer
benefícios como: repovoação do campo com cepas sensíveis a
anticoccidianos, transferência dessa característica para as cepas locais,
sendo que essa medida pode auxiliar a estender a vida útil dos
anticoccidianos. Também, a precocidade das cepas vacinais que as
tornam menos patogênicas é uma característica herdável.
Entretanto, a utilização de vacinas compostas de oocistos vivos
não tem sido muito aceita para o uso em frangos de corte, sob a alegação
de que poderiam piorar o desempenho zootécnico (DANFORTH, 1998),
portanto, novas alternativas têm sido pesquisadas, como por exemplo,
vacinas de subunidades, tecnologias baseadas em DNA e vacinas vivas
recombinantes vetoriadas.
Wallach et al. (1995) utilizaram um antígeno purificado de
gametócito (APGA) de E. maxima para elaborar uma vacina inativada e
estimular células B a produzirem altos títulos de imunoglobulinas para a
proteção da progênie contra desafios homólogos com E. maxima e
heterólogos com E. acervulina e E. tenella. Os autores acreditavam que
a proteção cruzada se deva a presença de epítopos conservados nas
diferentes espécies, conforme demonstrado por meio de provas de
Western Blot para E. maxima e E. tenella. Todavia, segundo Shirley et
al. (2007) a proteção cruzada entre as espécies não tem sido coprovada
em infecções naturais, tornando curioso o fato de que isso ocorra com a
utilização do APGA.
36
Xu et al. (2008) utilizaram um método para imunização de
frangos contra E. tenella a partir de um DNA quimérico, clonado para
codificar os genes que expressam o antígeno TA4 de E. tenella e a
citoquina interleucina - 2 (IL-2) de frangos. A partir de testes
controlados foram encontrado os seguintes resultados: o grupo controle
desafiado exibiu uma redução no ganho de peso (68,1%) quando
comparado com o grupo controle não desafiado e, essa diferença foi
estatisticamente significativa. Já, imunização com o DNA-TA4, DNATA4-IL-2 e DNA-IL-2, obtiveram 90,4%; 97,3% e 93,7% de ganho de
peso relativo (em comparação com o grupo controle não desafiado),
respectivamente. Frangos imunizados com DNA-TA4-IL-2 obtiveram
um ganho de peso maior e, houve diferença estatisticamente
significativa com os tratamentos DNA-TA4 e DNA-IL-2. A imunização
com o DNA-TA4-IL-2 resultou em uma maior queda na taxa de
excreção de oocistos (75,1%) quando comparado com o grupo controle
desafiado e, com os outros dois grupos (DNA-TA4 = 68,7% e DNA-IL2 = 66%). Também, foi observada uma diminuição no escore de lesão
em aves imunizadas (DNA-TA4 = 0,6; DNA-TA4-IL-2 = 0,4 e DNAIL-2 = 1,6), quando comparado com o controle não imunizado e
desafiado (3,5) e, essa diferença foi estatisticamente significativa. Em
frangos imunizados com DNA-TA4-IL-2, também houve uma diferença
estatisticamente significativa no escore de lesões, quando comparado
com os outros grupos vacinados. O Índice Anticoccidial encontrado para
cada grupo foi: DNA-TA4 = 183, DNA-TA4-IL-2 = 192, DNA-IL-2 =
176, grupo controle não imunizado e não desafiado = 200 e grupo
controle não imunizado e desafiado = 123.
Konjufca et al. (2006) utilizaram a Salmonella enterica Sorovar
Typhimurium para expressar e entregar antígenos específicos de
merozoítos (EAMZ250) e esporozoítos (EASZ240) de E. acervulina, no
citoplasma da célula hospedeira pelo type 3 secretion system – T3SS
(sistema bacteriano de secreção tipo 3). Para o experimento de desafio,
grupos de aves foram imunizados com o Vetor Recombinante de
Salmonella Atenuada (VRSA) expressando cada um dos antígenos e
ambos, após, foram desafiados com E. acervulina e, comparados com
grupos controles não imunizados, desafiado e não desafiado. O menor
ganho de peso (129g) e maior escore de lesão (2,1) foram observados
para o controle não imunizado e desafiado com E. acervulina. O ganho
de peso para o grupo controle desafiado foi próximo a 80% do obtido
pelo grupo controle não desafiado (157g). Frangos imunizados com o
VRSA expressando o antígeno de esporozoíto EASZ240 exibiram um
baixo escore de lesão (1,4), contudo, o ganho de peso (135g) foi
37
deprimido como ocorreu no grupo controle desafiado. Já, os frangos
imunizados com o VRSA expressando o antígeno de merozoíto
EAMZ250 obtiveram um aumento no ganho de peso (147g) e menor
escore de lesão (1,5) quando comparado com o controle não imunizado
e desafiado, sendo que, houve diferença estatisticamente significativa
entre esses grupos, porém, para o ganho de peso entre o grupo
imunizado com o EAMZ250 e desafiado e, o não imunizado não
desafiado, não houve diferença estatisticamente significativa. A
coadministração dos VRSA expressando ambos os antígenos, não
promoveu nenhum efeito aditivo em relação ao VRSA expressando
somente o EAMZ250. Konjufca et al. (2008) em outro estudo utilizaram
o T3SS e o T2SS da S. enterica Sorovar Typhimurium para expressar e
entregar os antígenos SO7 de E. tenella e EAMZ250 de E. acervulina. O
menor ganho de peso foi observado em um grupo controle imunizado
com o VRSA não expressando antígenos, e desafiados com E.
acervulina (127g) ou E. tenella (92g). Os frangos imunizados com o
VRSA expressando os antígenos EAMZ250 e SO7 via T3SS e,
desafiados com E. acervulina, obtiveram um maior ganho de peso
(140g) que o controle imunizado com o VRSA não expressando
antígenos e desafiado com E. acervulina, sendo que, houve uma
diferença estatisticamente significativa entre estes grupos. Também, o
ganho de peso para o VRSA expressando ambos os antígenos foi maior
que nos outros grupos imunizados com VRSA expressando apenas um
dos antígenos e, similar ao ganho de peso (141g) do controle não
desafiado, indicando que houve uma proteção significativa contra
desafios. Segundo os autores esses resultados sugerem que a indução de
resposta imune mediada por células a múltiplos antígenos (EAMZ250 e
SO7) conduziu a uma proteção superior contra E. acervulina. Em um
segundo estudo de desafio para verificar a proteção contra E. tenella,
todos os grupos foram imunizados com o VRSA expressando o antígeno
SO7. Os animais imunizados e desafiados com E. tenella obtiveram um
maior ganho de peso que o controle imunizado com o VRSA não
expressando antígenos e desafiado e, verificou-se uma diferença
estatisticamente significativa. Segundo os autores a imunização com o
VRSA que entregou o antígeno SO7 via o T2SS pareceu conferir uma
maior proteção, pois esse grupo obteve o maior ganho de peso (124g) e,
não houve diferença estatisticamente significativa com a taxa de
conversão alimentar desse grupo com o grupo controle e não desafiado.
Yang et al. (2008) utilizaram um Pox Vírus Aviário
recombinante para expressão do gene rombóide (rPVA-rombóide). As
proteases rombóides têm papel na clivagem do micronema durante a
38
invasão da célula hospedeira. A organela conhecida como micronema é
responsável pela adesão e reconhecimento da célula hospedeira
(KAWAZOE, 2000). Aplicado por via subcutânea, o Pox vírus
recombinante, induziu uma resposta imune humoral e estimulou a
proliferação de linfócitos no sangue periférico. Foi elaborado um
experimento para testar diferentes diluições do rPVA-rombóide,
conforme segue: G1 (102 PFU), G2 (104 PFU) e G3 (106 PFU). Duas
semanas depois, as aves foram desafiadas com E. tenella e, foi
observada uma diminuição do número de oocistos excretados pelos
frangos imunizados com o rPVA-rombóide, G1 (6,12x107), G2
(5,94x107) e G3 (5,91x107), quando comparada com o grupo controle
não imunizado e desafiado (10,13x107), essa diferença foi
estatisticamente significativa. No grupo controle foi observado um
escore médio de lesão de 3,9, enquanto que nos grupos G1, G2 e G3 os
escores médios de lesão foram de 1,73, 1,49 e 1,40, respectivamente,
sendo que, entre os dois últimos não houve diferença estatisticamente
significativa. O ganho de peso dos grupos vacinados (G1 = 65g, 2 =
68,3g e 3 = 68,9g) foi significativamente maior que o controle (50g). Os
autores concluíram que as eficácias para as diferente diluições do rPVArombóide foram: G1 = 39,6%, G2 = 41,1% e 3 = 41,7%.
McDonald e Shirley (2009) citaram que uma das dificuldades
para o desenvolvimento dessas vacinas está em identificar antígenos
protetores e diferenciá-los de moléculas apenas imunogênicas e, que
estudos têm demonstrado que somente a inclusão de antígenos
referentes a cada uma das sete espécies de Eimeria talvez não seja
suficiente, pois, verificou-se a existência de uma variação na
composição antigênica do primeiro e segundo estágios de merogonias
em E. tenella. Lillehoj (2005) citou que outro desafio reside em como
veicular esses antígenos de forma a mimetizar os estímulos causados
pelo parasito, durante o seu ciclo no hospedeiro. Shirley et al. (2007)
citaram que a elaboração de uma vacina que não necessite da passagem
do parasito vivo pelo hospedeiro, ainda está longe de se tornar uma
realidade.
2.4
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES
2.4.1
Método de diagnóstico morfo-clínico
As infecções coccidianas geralmente são causadas por mais de
uma espécie do gênero Eimeria (MCDOUGALD, 1986; WILLIAMS et
al., 1996; MORRIS et al., 2007). O local e as características
39
macroscópicas das lesões muitas vezes fornecem um indicativo da
espécie envolvida (LONG e JOYNER, 1984). As sobreposições de
características para a identificação das espécies, muitas vezes inviabiliza
a sua utilização de forma isolada (KUČERA, 1990). Assim, o
diagnóstico morfo-clínico torna-se laborioso, demorado e oneroso, pois
exige o uso de animais para experimentação (CONWAY; MCKENZIE,
2007; LONG; REID, 1982) e de técnicos que possuam ampla
experiência para que se evitem os erros de diagnóstico (LONG;
JOYNER 1984).
Segundo Long e Joyner (1984) a crença de que o ciclo de vida
das espécies de Eimeria seguia um padrão quase imutável foi
abandonada após vários estudos provarem que características como a
morfologia, localização e tempo para a geração dos esquizontes podem
ser modificados pela seleção de populações de Eimeria spp. Long
(1972) descreveu uma variação nos estágios endógenos de
desenvolvimento quando comparou uma amostra de E. tenella adaptada
para passagem em embriões de pinto, que difere da E. tenella não
adaptada, por possuir esquizontes de segunda geração aproximadamente
um quinto menor. Este fato restringe seu desenvolvimento no epitélio,
não mais alcançando a lâmina própria do ceco, que é característico dessa
espécie.
Utilizando a morfologia e o tamanho dos oocistos (Figura 3)
algumas vezes pode-se chegar à identificação da E. maxima, que produz
os maiores oocistos, de parede irregular e com uma coloração castanha
característica que difere das demais espécies de Eimeria que parasitam
galinhas (JOYNER; LONG, 1974). Schnitzler e Shirley (1999)
relataram que os oocistos de E. brunetti possuem uma faixa de tamanho
próximo da E. maxima e podem ser confundidos. Para todas as outras
espécies a identificação utilizando somente a morfologia e tamanho dos
oocistos é ainda mais complexa (LONG; JOYNER, 1984; LONG;
REID, 1982; SUN et al., 2009).
Outro parâmetro complementar utilizado para auxiliar no
diagnóstico é o período pré-patente que difere entre as espécies. Porém,
Long e Joyner (1984) citaram que essa característica não pode ser
considerada como uma constante, pois, há variações dentro das espécies
(LONG; JOYNER, 1984). A seleção de cepas de Eimeria spp. pela
precocidade altera essa medida (KAWAZOE et al., 2005; MCDONALD
et al., 1986; SHIRLEY et. al., 1984). É utilizada para escolha de cepas
mais seguras para a inclusão em vacinas, que podem diminuir o valor
desse parâmetro para o diagnóstico.
40
Segundo Long e Reid (1982), o tempo de esporulação pode ser
utilizado como um parâmetro para auxiliar na identificação das espécies
de Eimeria. Os oocistos devem ser suspendidos em solução de
dicromato de K+ a 2%, com constante aeração e em temperatura de 30°
C. Long e Joyner (1984) citaram que a esporulação deve ser conduzida
em condições controladas para que esta medida tenha validade
sistemática, pois, a variação temporal para a esporulação parece ter uma
grande dependência da temperatura. A verificação da esporulação pode
ser feita de forma empírica (com a infecção de aves susceptíveis e a
observação da excreção ou não de oocistos) ou por microscopia para a
visualização das alterações morfológicas dos oocistos.
Figura 3 – Oocistos de E. maxima (a), E. brunetti (b), E. tenella (c), E.
necatrix (d), E. praecox (e), E. acervulina (f) e E. mitis (g).
Fonte: Castañón et al. (2007).
Dentre todas as características biológicas e morfológicas
utilizadas na identificação das espécies de Eimeria, os testes de
especificidade imunológica parecem ser os mais confiáveis (JOYNER;
LONG, 1974). Entretanto, a ocorrência de amostras antigenicamente
diferentes dentro de uma mesma espécie (MARTIN et al., 1997;
SCHNITZLER e SHIRLEY, 1999) pode requerer a utilização de outros
parâmetros associados tais como morfologia e tamanho dos oocistos,
período pré-patente, tempo mínimo de esporulação, características e
41
localização das lesões, para que seja possível a diferenciação entre
espécies. Este é um método demorado, que para ser executado necessita
da manutenção de cepas puras das sete espécies de Eimeria e do uso de
animais.
Embora muitos autores reconheçam que a identificação por
meio das características morfo-clínicas é um método demorado e pode
falhar na identificação das espécies de Eimeria, principalmente, quando
algumas características são utilizadas isoladamente, estudos ainda são
desenvolvidos com base nessa metodologia (AL-GAWARD et al., 2012;
AWAIS et al., 2011; CARDOZO e YAMAMURA, 2006; JADHAV et
al., 2012; LUCHESE et al., 2007; SANTOS et al., 2003; TERRA et al.,
2001; TOLEDO et al., 2011).
Uma identificação rápida e precisa das espécies
de Eimeria é requerida para várias finalidades.
Em estudos epidemiológicos, é importante
seguir um agente infeccioso ao longo do tempo
e espaço, a fim de saber como ele pode se
espalhar. Para o desenvolvimento de vacinas, é
imperativo trabalhar com linhagens puras e
evitar inadvertidas contaminações cruzadas. Os
métodos convencionais de identificação
requerem pessoal altamente treinado uma vez
que as diferenças na morfologia dos oocistos
são pequenas e não são facilmente visíveis.
(STUCKI et al., 1993).
2.4.2
Diagnósticos bioquímicos e moleculares
2.4.2.1
Eletroforese de isoenzimas
Essa prova consiste em um método de tipificação de enzimas e
tem auxiliado na identificação de espécies e diferentes cepas de
parasitos, devido às características de variação eletroforética na
mobilidade de algumas isoenzimas (KUČERA, 1989). Shirley (1975)
foi quem primeiro padronizou e empregou a eletroforese de isoenzimas
em gel de amido para a identificação das espécies de Eimeria de
galinha. Utilizou para essa prova as enzimas lactate dehydrogenase –
LDH (lactato dehidrogenase); glucose phosphate isomerase – GPI
(glicose fosfato isomerase); 6-phophogluconate dehydrogenase – 6PGD
42
(6-fosfogluconato
dehidrogenase);
e
glucose-6-phosphate
dehydrogenase – G6PD (glicose-6-fosfato dehidrogenase). Segundo
Kučera (1989) a LDH e a GPI são as enzimas mais adequadas para esse
propósito. Entretanto, Shirley (1975) verificou que ocorreu um padrão
de migração idêntico da enzima LDH entre as espécies E. acervulina e
E. tenella.
Kučera (1990) utilizou a eletroforese de isoenzimas para
complementar o diagnóstico pelas características morfo-clínicas em um
trabalho de identificação de espécies de Eimeira na Tchecoslováquia, e
concluiu que a utilização de ambos os métodos isoladamente não é
conclusivo. Tebo et al. (1998) e Willians et al. (1996) também
empregaram essa prova juntamente com as características morfoclínicas para o diagnóstico das espécies de Eimeria que parasitam aves
da espécie G. gallus domesticus em estudos epidemiológicos executados
na Suécia e França, respectivamente.
Todavia, essa técnica demanda grande quantidade de oocistos,
pois em alguns casos é incapaz de detectar espécies que estejam em um
número inferior a 20%, entre às presentes na amostra. Para contornar
esse problema, em alguns casos faz-se necessário à propagação dos
oocistos da amostra em aves, o que torna o teste mais caro, demorado e
trabalhoso (KUČERA, 1990; FERNANDEZ et al., 2003a). Tebo et al.
(1998) em seus estudos de identificação das espécies de Eimeria em
aves da espécie G. gallus domesticus, utilizaram uma camada fina de
poliacrilamida ao invés de amido ou agarose e com isso aumentou a
sensibilidade da prova, sem a necessidade de uma prévia propagação da
amostra em aves.
2.4.2.2 Detecção
de
“Restriction
Fragment
Polymorphism” (RFLP) por hibridização Southern blot
Length
A Southern Blot é uma técnica mais sensível para a análise
intraespecífica que a de isoenzimas, porém, também demanda grande
número de oocistos (FERNANDEZ et al., 2003a). A técnica consiste na
utilização de enzimas de restrição para a digestão do DNA, separação
dos fragmentos por meio de eletroforese em gel de agarose e a
transferência desses para uma membrana, resultando em uma réplica dos
fragmentos de DNA do gel na membrana. Em seguida aplica-se uma
sonda marcada, geralmente derivada do mesmo DNA genômico, para
hibridizar com as sequencias específicas, possibilitando a visualização
do padrão (tamanho e disposição) e espaçamento entre os fragmentos
(SHIRLEY, 1994). Essa técnica permite uma melhor visualização, pois,
43
no gel pode ocorrer uma grande quantidade de sinais de hibridização
inespecífica que pode mascarar as específicas (BROWN, 2003). É uma
técnica que fornece uma quantidade menor de informações, é mais
trabalhosa e demorada, quando comparada com RAPD e AFLP
(MUELLER; WOLFENBARGER, 1999). Shirley (1994) utilizou a
transferência de Southern para RFLP com quatro sondas de DNA que
repetem várias vezes no genoma de E. tenella para diferenciar oito
amostras de E. tenella, três das quatro sondas hibridizaram apenas com
o DNA de E. tenella enquanto uma sonda também hibridizou com o
DNA de E. praecox e E. acervulina. No entanto, a detecção de RFLP
por hibridização Southern Blot é trabalhosa, requer marcadores de DNA
específicos e é relativamente dispendiosa (PROCUNIER, et al., 1993).
2.4.2.3
“Random Amplification of Polymorphic DNA” (RAPD)
A RAPD, ao contrário da PCR, é uma ferramenta que pode ser
utilizada para a identificação das espécies sem a necessidade do
conhecimento prévio da sequência da região a ser amplificada. Para essa
técnica são empregados iniciadores arbitrários sob condições de baixa
estringência, ou seja, pequenos oligonucleotídeos utilizados como
“primers” são colocados para hibridizar a uma baixa temperatura, isso
permite menores incompatibilidades de ligação. Após, são feitas
comparações dos tamanhos das bandas geradas para a análise de
marcadores que possam ser usados para a diferenciação entre as espécies
(FERNANDEZ et al., 2003b; MACPHERSON; GAJADHAR, 1993;
PROCUNIER et al., 1993). Possui como inconvenientes baixa
reprodutibilidade e a possibilidade de ocorrerem sobreposições de
bandas, o que diminui sua exatidão para diagnósticos de amostras de
campo, que geralmente são compostos por mais de uma espécie
(FERNANDEZ et al., 2003b). Essa técnica tem sido empregada para a
diferenciação entre espécies de Eimeria e entre cepas de uma mesma
espécie que parasitam aves da espécie G. gallus domesticus. Procunier et
al., (1993) perceberam que as diferenças encontradas entre as espécies
eram maiores que as observadas entre cepas de uma mesma espécie,
também, observaram uma maior relação entre as amostras de E. tenella
(98%) que de E. acervulina (61%). A mesma abordagem foi utilizada
para a diferenciação de sete espécies de Eimeria, dentre estas, uma de
aves e seis de mamíferos (MACPHERSON; GAJADHAR, 1993).
Johnston e Fernando, (1995) utilizando a técnica de RAPD e
comparando dois métodos para a visualização dos resultados, a
Denaturing gradient-gel electrophoresis – DGGE (eletroforese em gel
44
com gradiente de desnaturação) e Polyacrylamide gel electrophoresis –
PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida) não só confirmaram a
maior proximidade de cepas de E. tenella quando comparadas com E.
acervulina como também perceberam uma melhor resolução dos
fragmentos quando utilizada a DGGE. A técnica de RAPD pode ser
empregada para pesquisar marcadores moleculares conhecidos como
SCAR, utilizados na identificação das espécies de Eimeria de galinhas,
por meio da PCR (FERNANDEZ et al., 2003b; 2004). A partir dos
SCAR são desenhados “primers” específicos, mais longos que os
utilizados na RAPD, que são utilizados em condições mais rigorosas
(alta temperatura de hibridação), tornando a PCR com esses “primers”
mais confiáveis que a técnica de RAPD para o diagnóstico. Fernandez et
al., (2004) identificaram 84 SCAR espécie-específicos e 67 com
especificidade parcial para as espécies de Eimeria de galinhas.
2.4.2.4
“Amplified Fragment Length Polymorphysm” (AFLP)
A técnica de AFLP, a exemplo da RAPD e da RFLP, também,
pode ser utilizada para a identificação de marcadores moleculares. Para
a elaboração dessa técnica, primeiramente são utilizadas enzimas de
restrição que fazem a digestão do DNA em locais específicos, de acordo
com a enzima utilizada, em seguida faz-se a ligação de adaptadores nas
extremidades dos fragmentos resultantes dessa digestão enzimática, e a
execução de uma AFLP-PCR com a utilização de “primers” específicos
que se ligam às sequências dos adaptadores. Dessa forma são
amplificados os fragmentos resultantes da digestão com as enzimas de
restrição, e finalmente o material amplificado é visualizado em um gel
de eletroforese (MUELLER; WOLFENBARGER, 1999). É uma técnica
que, diferentemente da RAPD, é altamente replicável, pois, “primers”
específicos são utilizados na reação da AFLP-PCR sob alta temperatura
de hibridização, e possibilita uma melhor visualização, pois, a produção
de artefatos é muito menor que na RAPD. Shirley e Harvey (2000), com
o objetivo de investigar as bases genéticas da abreviação do ciclo de
cepas precoces de Eimeria spp., cruzaram uma linhagem de E. tenella de
menor período pré-patente com outra resistente ao anticoccidiano
arprinocida. Nesse estudo, foram empregadas três abordagens para a
identificação de marcadores de DNA, hibridização de RFLP por
Southern Blot, RAPD-PCR e AFLPs. A técnica de AFLP gerou um
número maior de informações, mais de 8.600 fragmentos foram
amplificados, sendo que destes, 379 eram polimórficos. No mapa gerado
foram identificados “loci” genéticos implicados na regulação do ciclo de
45
vida desse parasito no cromossomo 2 e “loci” para resistência à
arprinocida no cromossomo 1. Uma limitação é que a AFLP requer
DNA de alta qualidade, portanto, a dificuldade para reproduzir um
grande número de parasitos recombinantes e a subsequente coleta do
DNA genômico a partir de esporozoítos purificados torna-se um entrave
para a execução da técnica.
2.4.2.5
“Polymerase Chain Reaction” (PCR)
A reação em cadeia da polimerase (PCR) consiste em uma
amplificação seletiva de uma região da molécula de DNA que é
selecionada por meio, da utilização de dois pequenos oligonucleotídeos
(primers) que são desenhados para hibridizar com as extremidades de
uma sequencia alvo (um para cada uma das fitas de DNA). Para isso é
necessário o conhecimento das sequencias das extremidades (BROWN,
2003). Na maioria das vezes a amplificação é realizada por uma enzima
termoestável, a Taq DNA-polimerase, purificada da bactéria termófila,
Thermus aquaticus (Taq), que pode sobreviver à incubação prolongada
a 95°C (SAIKI et al., 1988). Essa enzima promove a polimerização de
novas fitas de DNA no sentido 5’-3’, durante a fase de extensão.
Prichard (1997) citou que a reação em cadeia da polimerase é
uma ferramenta que possui alta sensibilidade e especificidade, torna
possível que um fragmento específico de uma pequena quantidade de
DNA seja multiplicado seletivamente em milhares de cópias, podendo
dessa forma se determinar, por exemplo, a identidade de um parasito a
partir de menos que 1 ng de DNA. Segundo Saiki (1988) o alvo
específico multiplica-se em uma razão de 2n, onde n é o número de
ciclos de hibridização e extensão.
Stucki et al. (1993) com o objetivo de obter um marcador para a
identificação de E. tenella, clonaram uma cópia do gene codificador da
unidade 5S do RNA ribossômico dessa espécie e encontram uma região
codificadora de 120 nucleotídeos e uma intergênica de 608 nucleotídeos.
Nessa última existem muitas repetições contíguas de sequencias que são
dispersas através do genoma (ex. o trinucleotídeo CAG e seu
complemento CTG). Essas repetições fornecem algumas vantagens em
um diagnóstico baseado em DNA, por exemplo, por estarem presentes
em um grande número de cópias, melhoram a sensibilidade da prova, e a
menor conservação das regiões do espaço entre os genes ribossômicos
permite a discriminação entre as espécies. Depois de identificada a
região alvo, um conjunto de “primers” foi desenhado e testado em uma
PCR usando DNA genômico purificado de seis espécies de Eimeria,
46
incluindo quatro espécies de aves e duas de mamíferos, apenas um
produto de 560 pb que corresponde a E. tenella foi amplificado.
2.4.2.5.1 PCR utilizando o primeiro e o segundo “Internal
Transcribed Spacer” (ITS) do DNA ribossômico
Schnitzler et al. (1998, 1999) sequenciaram o ITS-1 do DNA
ribossômico (rDNA) e perceberam que a sua heterogeneidade no
comprimento e nas sequências de bases entre as espécies poderiam
conceber marcadores para o desenho de “primers” espécie-específicos,
para a utilização em uma PCR, para a identificação das sete espécies de
Eimeria que parasitam aves da espécie G. gallus domesticus. Nesse
estudo encontraram dois padrões de bandas para E. maxima, uma
superior de 630 pb e outra inferior de 505 pb, e segundo os autores,
estudos futuros poderão determinar sua aplicabilidade na identificação
de cepas dessa espécie.
Lew et al. (2003) utilizaram o ITS-1 como gerador de alvos
para PCR em um estudo para confirmar a presença de sete espécies de
Eimeria de galinhas na Austrália e analisar as relações evolutivas de
isolados australianos. Para isso, vinte e duas regiões distintas do ITS-1
de 15 isolados australianos de Eimeria de frangos foram sequenciadas e
analisadas. Evidenciaram a presença de duas regiões ITS-1, uma curta e
uma longa, que podem coexistir em uma cepa, como demonstrado em
um clone de E. tenella. Para a PCR foram empregados marcadores ITS1 previamente publicados para as espécies de E. acervulina, E. tenella,
E. necatrix e E. brunetti, combinados com novos marcadores elaborados
para esse estudo (E. mitis, E. praecox e E. maxima australiana). O
conjunto de “primers” designado para amplificar uma cepa americana de
E. maxima não amplificou a cepa australiana da mesma espécie.
Segundo os autores isso se deve pelo fato de que os dois tipos de ITS-1
não coexistem na amostra australiana. Isso reforça a ideia de que os
ensaios de PCR utilizando ITS-1 devem ser avaliados em amostras de
origens geográficas diferentes, para garantir que eles possam ser usados
a nível mundial (HAUG et al., 2007). Lew et al. (2003) encontraram
dois clones diferentes de E. mitis provenientes do isolado “A”, portanto,
dois conjuntos de “primers” foram desenhados (AMit1 e AMit5) para a
identificação dos três isolados australianos estudados dessa espécies,
porém, enquanto a PCR empregando o conjunto AMit1 (328 pb) foi
capaz de identificar todas as amostras. O mesmo não aconteceu com a
PCR utilizando o par de iniciadores AMit5 (193 pb). Apesar da variação
47
inter e intraespecífica da região ITS-1, as sete espécies de Eimeria que
parasitam galinhas foram identificadas na Austrália.
Su et al. (2003) avaliaram a PCR baseada em marcadores ITS-1
para a identificação das espécies de Eimeria contidas em duas vacinas
comerciais e uma cepa de E. tenella originária de Taiwan. Empregaram
para a PCR um conjunto de cinco “primers” previamente desenhados (E.
acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix e E. brunetti,). Todos os
conjuntos de “primers” amplificaram e não houve nenhuma
amplificação inespecífica.
Estudos de prevalência e levantamentos de espécies de Eimeria
têm sido executados por meio da PCR utilizando como alvo marcadores
situados no ITS-1. Com o objetivo de verificar a presença de E. mitis e
E. praecox, espécies de Eimeria até então pouco relatadas no Brasil,
Meireles et al. (2004) submeteram à PCR (ITS-1) 156 amostras
procedentes de sete estados produtores mais o Distrito Federal. E.
praecox estava presente em todos os estados amostrados, enquanto a E.
mitis não foi encontrada apenas nos Estados de Goiás e Minas Gerais.
Em um estudo para identificação de Eimeria spp. em
instalações industriais de criação de frangos de corte, em Concórdia,
Santa Catarina, foi empregado a PCR (ITS-1) para a detecção de E.
acervulina, E. maxima, E. tenella e E. mitis. Sendo E. mitis a única
espécie não encontrada (PRADO, 2005).
Haug et al. (2008) empregaram a análise morfométrica de
oocistos e a PCR para um estudo epidemiológico das espécies de
Eimeria que parasitam frangos na Noruega. Verificaram que cinco
espécies de Eimeria estavam presentes nas criações de frango (E.
acervulina, E. maxima, E. tenella, E. praecox e E. necatrix) e que a
concordância da morfometria com a PCR na identificação das espécies
foi de apenas 49%.
Aarthi et al. (2010) estudaram a prevalência molecular da
coccidiose em frangos na Índia. Os marcadores utilizados foram
desenhados a partir de alvos no ITS-1 e a amostragem foi feita de
porções de tecidos de vários locais do intestino de aves que
apresentavam sinais clínicos. Utilizaram nested PCR, com um conjunto
de “primers” para a detecção do gênero Eimeria. O produto dessa reação
foi clonado e o DNA extraído do plasmídeo foi submetido a sete reações
da PCR para identificação das espécies que acometem frangos. Todas as
sete espécies estavam presentes, geralmente em infecções múltiplas.
Na Coréia, Lee et al. (2010), conduziram um estudo
epidemiológico das espécies de Eimeria que parasitam frangos. Com
esse propósito foram coletadas amostras em 356 granjas, a identificação
48
das espécies foi realizada por meio da PCR (ITS-1). Todas as sete
espécies que parasitam galinhas foram identificadas e geralmente as
infecções eram ocasionadas por mais de uma espécie
concomitantemente.
Com o objetivo de estudar o emprego do segundo espaçador
transcrito interno do DNA ribossômico (ITS-2) na diferenciação
específica e intraespécie de amostras australianas de E. acervulina, E.
maxima, E. tenella, E. praecox, E. brunetti e E. necatrix, Woods et al.
(2000) utilizaram a técnica de PCR-RFLP. Primeiro amplificaram o
ITS-2 por meio da PCR, esses amplicons foram digeridos com
endonucleases de restrição e então submetidos a desnaturação em uma
eletroforese em gel para a análise do polimorfismo no comprimento dos
fragmentos produzidos. Encontraram variação consistente de tamanho e
número de bandas entre as espécies, demonstrando que o ITS-2 pode
servir de alvo para o desenvolvimento de marcadores para a
identificação das espécies de Eimeria de frangos.
Gasser et al. (2001) utilizaram como alvo para a identificação
das sete espécies de Eimeria que parasitam galinhas, um único conjunto
de iniciadores, “primer WW2 – forward”, marcado com 6-fluoresceina
(para o gênero Eimeria) e “primer WW4r – reverse” (para família
Eimeriidae), desenhados a partir da região ITS-2. Os produtos da
amplificação foram termicamente desnaturados e, submetido à
eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante, em um sequenciador
ABI Prism 377®. Os cromatogramas produzidos foram analisados, por
meio de um software. Para a padronização da técnica foram utilizadas
amostras de DNA de linhas monoespecíficas, das sete espécies de
Eimeria e, assim, definidas as regiões de cromatogramas para a
identificação espécie-específica. Os autores observaram uma variação
nos cromatogramas relacionada a diferentes cepas, em duas espécies.
Esta técnica, também foi utilizada por Gasser et al. (2005), que
submeteram amplicons termicamente desnaturados a uma eletroforese
em capilar, acoplada em um sequenciador MegaBACE 1000®. Segundo
os autores, a eletroforese em capilar elimina a necessidade de géis,
possibilitando uma maior agilidade e menor mão de obra para a
identificação das sete espécies de Eimeria que parasitam frangos.
Lien et al. (2007) empregaram marcadores da região ITS-2
(primer WW2 - frente e primer WW4r - reverso) para identificar e
caracterizar nove cepas representando três espécies de Eimeria (E.
acervulina, E. maxima e E. tenella), isoladas a partir de surtos em
Taiwan. O produto da PCR foi clonado e sequenciado e, na análise
49
filogenética, encontraram a menor homologia entre as duas cepas de E.
maxima (96.8-98.3%).
2.4.2.6
“Real-time PCR”
A PCR em tempo real possui o mesmo princípio da PCR
convencional para a amplificação do DNA, porém, associado a
mecanismos de detecção e quantificação por fluorescência. Isso permite
que os processos de amplificação, detecção e quantificação de DNA
sejam realizados em uma única etapa. O método mede a acumulação do
produto da PCR por meio de uma sonda fluorescente duplamente
marcada. As sondas utilizam corantes fluorescentes, sendo que uma das
sondas funciona como um emissor (contendo por ex.: 6carboxifluorceína) e a outra como um inibidor da fluorescência da
primeira (ex.: 6-carboxi-tetrametilrodamina). À medida que as sondas
são clivadas pela atividade 5’ nuclease da Taq DNA polimerase durante
a fase de extensão, a sonda inibidora não consegue mais captar com
eficiência a fluorescência da sonda emissora, e assim o pico de emissão
da fluorescência é detectado pelo aparelho. A PCR em Tempo Real
possui a capacidade de medir a quantidade inicial da sequência alvo de
DNA, podendo-se estimar o grau de contaminação de uma amostra
(HEID et al., 1996).
É um teste capaz de identificar e quantificar as espécies de
Eimeria de galinhas e que pode ter várias aplicações como, por
exemplo, fornecer informações epidemiológicas importantes,
investigações de surtos de coccidiose (espécie(s) causadora(s) e a
quantidade de oocistos necessários para ocasionar o surto), a avaliação
do risco de doença, o monitoramento da eficácia dos programas de
vacinação e a minimização de custos da vacinação pela utilização de
regimes de tratamento direcionados (MORGAN et al., 2009). No
entanto, o custo do equipamento e das sondas restringe seu uso
(MORRIS et al., 2006; VRBA et al., 2010).
Blake et al. (2006) padronizaram a PCR em tempo real para a
identificação e quantificação de E. maxima, utilizando como alvo para
amplificação um fragmento de 185 pb de uma proteína do micronema
(MIC1), também conhecida como sequência do antígeno principal
homólogo de E. maxima (emp100) e, Blake et al. (2008) padronizaram a
PCR em tempo real para outras três espécies (E. acervulina, E. tenella e
E. necatrix), utilizando marcadores SCAR desenvolvidos por Fernandez
et al. (2004).
50
Na Austrália, Morgan et al., (2009) empregaram como
marcador genético o segundo espaçador transcrito interno do DNA
nuclear ribossômico (ITS-2) para a identificação e quantificação de E.
acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis e E.
praecox. Utilizando “primers” para o ITS-2 em uma PCR em tempo
real, detectaram as cepas Australianas e de outras regiões do mundo,
porém a sonda específica para E. praecox não detectou a estirpe
“Houghton”, presente na vacina Paracox 8®, motivo pelo qual os
autores recomendam que sejam feitos testes locais antes da aplicação
dessa prova em outras regiões. Segundo Vrba et al. (2010) isto
provavelmente ocorreu devido ao alto polimorfismo das regiões do
espaçador transcrito interno do DNA nuclear ribossômico (ITS-1 e ITS2). Essas regiões estão presentes em múltiplas cópias no genoma que
partilham muitas das mesmas sequências, mas possuem certo grau de
variabilidade entre cepas e entre as espécies que pode interferir na
identificação das espécies presentes em uma amostra.
Kawahara et al. (2008) utilizaram a PCR em tempo real para o
estudo de cinco espécies de Eimeria no Japão (E. acervulina, E.
maxima, E. tenella, E. necatrix e E. brunetti). Os “primers” foram
desenhados para alvos da região ITS-1, com o objetivo de aumentar a
sensibilidade do teste por se tratar de uma região multicópias, porém,
segundo os autores, é provável que o número de cópias dessa região seja
diferente entre as espécies e/ou cepas. Portanto, mesmo obtendo uma
correlação do número de oocistos com os resultados da PCR, a
amplificação dessa região não é ideal para uma análise quantitativa.
Com o objetivo de desenvolver um ensaio para a identificação e
quantificação de espécies de Eimeria que parasitam galinhas, que
possuísse validade global, Vrba et al. (2010), utilizaram a PCR em
tempo real para identificar e quantificar as sete espécies de Eimeria que
parasitam galinhas. Empregaram, para o ensaio, os marcadores
utilizados por Blake et al. (2008) para E. maxima, E. necatrix e E.
tenella e, validaram outros para E. acervulina, E. brunetti, E. praecox e
E. mitis. Esses últimos foram concebidos utilizando a base de dados
SCARdb de SCAR espécie-específica (FERNANDEZ et al., 2004). Os
autores utilizaram marcadores definidos pela ausência de polimorfismo,
com o objetivo de garantir uma correspondência exata dos iniciadores e
das sondas durante a PCR, permitindo a identificação e quantificação
com o máximo de precisão das espécies em uma amostra,
independentemente das cepas presentes. Para isso os marcadores SCAR
foram definidos com base no estudo de cepas de diferentes origens,
sendo que, várias dessas foram sequenciadas em pelo menos um “lócus”
51
até que marcadores apropriados, não polimórficos, fossem identificados
para todas as sete espécies (VRBA et al., 2010).
2.4.2.7
Pirosequenciamento
Segundo Ronaghi (2001) o pirosequenciamento é uma técnica
de sequenciamento do DNA que se baseia na detecção de pirofosfato
inorgânico liberado (PFi) durante a síntese de DNA. Uma sequencia de
reações enzimáticas é responsável pela geração de luz que é
proporcional ao número de nucleotídeos incorporados. A cascata
começa com uma reação de polimerização de ácido nucleico em que o
PFi inorgânico é libertado como resultado da incorporação de
nucleotídeos pela polimerase. O PFi liberado é posteriormente
convertido em ATP pela ATP sulfurilase, que proporciona a energia
para a luciferase oxidar a luciferina e gerar luz. O nucleotídeo
acrescentado é conhecido, assim a sequência do molde pode ser
determinada. Ao contrário de outros métodos de sequenciamento que
utilizam nucleotídeos modificados para terminar a síntese de DNA, o
método de pirosequenciamento manipula a DNA polimerase pela adição
de um único dNTP em quantidades limitadas. Uma vez incorporado o
dNTP complementar, a DNA polimerase estende o iniciador e para. A
síntese do DNA é reiniciada após a adição do próximo dNTP
complementar no ciclo de distribuição. Os dNTPs são liberados
individualmente nos poços em uma ordem sequencial predeterminada e
a bioluminescência é fotografada com um dispositivo de carga acoplada
a uma câmara. A ordem e a intensidade dos picos de luz são registradas
como fluxogramas, que revelam a sequencia de DNA (METZKER,
2010). Conforme Petrosino et al. (2009) uma limitação do
pirosequenciamento é a sua incapacidade em de sequenciar longos
trechos de DNA. Com primeira e segunda geração de
pirosequenciadores químicos as leituras de sequencias raramente
ultrapassavam 100-200 bases. Entretanto, atualmente existem
equipamentos com capacidade de leitura superior a 350 bases. Seal et al.
(2013) citaram que o pirosequenciamento foi utilizado como uma
melhoria em relação a contagem manual de oocistos fecais para
demonstrar a redução de E. maxima no sistema gastrointestinal de
frangos de corte, após a alimentação com fitonutrientes.
2.4.2.8
“Multiplex PCR”
52
Fernandez et. al., (2003a), desenvolveram uma PCR múltipla
para a identificação das sete espécies de Eimeria de galinhas em uma
reação. Para isso, utilizaram marcadores SCAR, obtidos a partir da
técnica de RAPD. A escolha dos marcadores foi feita de modo a
permitir que os sete conjuntos de “primers” pudessem ser utilizados em
uma PCR, com as mesmas condições de ciclo e com a geração de
“amplicons” de tamanho específicos. O emprego desses “primers” foi
padronizado, utilizando 33 cepas, no mínimo duas por continente,
compreendendo as sete espécies de Eimeria isoladas de galinhas em
várias regiões ao redor do mundo (América do Sul, América do Norte e
Europa). Todas as cepas testadas foram detectadas, apresentaram bandas
de amplificação do tamanho esperado e não foram relatadas reações
cruzadas, demonstrando a aplicação universal desse ensaio. Gasser et al.
(2001) desenvolveram uma PCR múltipla baseada no ITS-2 para a
identificação das sete espécies de Eimeria de galinhas. Para esse teste,
utilizam um único conjunto de marcadores gênero/família (primers
WW2 / WW4r). Vrba et al. (2010) citaram que podem ocorrer variações
intraespecíficas devido à característica polimórfica da região ITS-2.
Segundo Fernandez et al. (2003a) a Multiplex PCR possui uma
sensibilidade de detecção de 2-8 oocistos esporulados (1 a 5pg) e
percebeu-se apenas uma pequena variação na sensibilidade para a
detecção de E. acervulina (1pg) e E. maxima (5pg) quando da realização
do teste com os sete conjuntos de “primers”. Para as demais espécies
não ocorreram alterações na sensibilidade do teste. Com o propósito de
avaliar a sensibilidade da técnica em condições semelhantes ao campo,
os autores testaram a Multiplex PCR em diluições contendo E.
acervulina, E. maxima e E. tenella, e encontraram que o limite de
detecção foi de 50, 500 e 100 oocistos para cada uma das espécies,
respectivamente. Apesar da maior dificuldade na padronização da
Multiplex PCR, devido a complexa interação molecular que pode alterar
a eficiência de ligação dos “primers”, a técnica diminui a mão de obra e
o tempo de execução dos diagnósticos, visto que seriam necessários sete
reações de uma PCR convencional para a comprovação da existência ou
não das sete espécies de Eimeria que parasitam aves do gênero G. gallus
domesticus.
No Egito, Kutkat et al. (2009) empregaram a Multiplex PCR
para identificação de protozoários do gênero Eimeria. Foram analisados
95 intestinos em 19 instalações avícolas no Egito. Dessas amostras, 66
foram positivas para Eimeria, e todas apresentaram infecções múltiplas,
sendo que seis espécies (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E.
praecox, E. mitis e E. necatrix) estavam presentes em 50% das amostras
53
positivas, e quatro espécies (exceto E. mitis e E. tenella) no restante. A
E. brunetti não foi encontrada.
Carvalho et al. (2011) compararam o diagnóstico morfo-clínico
com a Multiplex PCR para a identificação das sete espécies de Eimeria
que parasitam galinhas, em 30 instalações avícolas em Feira de Santana,
Bahia. O diagnóstico morfo-clínico, empregando apenas dois
parâmetros (morfologia e tamanho de oocistos e o escore de lesões),
forneceu resultados discrepantes daqueles obtidos pela técnica de
Multiplex PCR. Por meio da técnica de Multiplex PCR todas as sete
espécies de Eimeria de frangos foram encontradas em 13,7% das
granjas, enquanto que utilizando a morfologia e medida dos oocistos, as
sete espécies foram identificadas em 60% das propriedades. A Multiplex
PCR foi sensível e específica e, utilizando essa técnica foram
identificados oocistos de E maxima e E. praecox em 100% das granjas,
E. mitis e E. necatrix (93,3%), E. acervulina (56,7%), E. tenella (76,7%)
e, a E. brunetti (16,7%) foi a menos frequente. Porém, utilizando a
morfologia e tamanho de oocistos, a E. brunetti foi identificada em
100% das granjas, esse mesmo percentual foi encontrado para E. tenella
e E. praecox, já, a E. acervulina foi a menos frequente (63,3%). Com o
escore de lesão, foram identificadas E. maxima em 46,7%, E. acervulina
(30%), E. tenella (23,3%) e E. necatrix (10%), entretanto, E. mitis, E.
praecox e E. brunetti não foram identificadas. Os autores concluíram
que a morfologia e tamanho dos oocistos e, o escore de lesões,
utilizados para a identificação, não foram eficientes, principalmente, o
escore de lesão.
Ogedengbe et al. (2011) empregaram a Multiplex PCR para a
identificação das espécies de Eimeria que parasitam galinha em um
estudo de prevalência no Canadá. Segundo os autores, para a pesquisa
foram coletados 360 intestinos, procedentes de 36 granjas comerciais e
77 intestinos de aves caipiras. Foram recuperados oocistos somente em
20 amostras, provenientes de oito granjas comerciais. Todas as amostras
de granjas comerciais foram processadas pela Multiplex PCR e, apenas
nas amostras em que oocistos estavam presentes foram visualizados
amplicons, correspondentes a E. acervulina, E. maxima e E. tenella.
Rao et al. (2013) testaram a aplicabilidade da Multiplex PCR
para a identificação molecular de espécies de Eimeria. Para isso, foram
utilizados oocistos provenientes de onze amostras procedentes de várias
regiões da Índia. Sendo que, os oocistos destas amostras foram
previamente identificados, por outros autores, por meio de
características morfológicas e o tamanho dos oocistos, sendo que nestas
amostras foi relatada a presença das seguintes espécies de Eimeria por
54
amostra, 1 a 3 (E. maxima e E. tenella), 4 (E. maxima), 5 (E. acervulina
e E. tenella), 6 (E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. mitis e E.
brunetti), 7 (E. tenella), 8 e 9 (E. maxima, E. tenella e E. brunetti), 10
(E. tenella, E. necatrix e E. brunetti), 11 (E. acervulina, E. maxima, E.
tenella, E. mitis E. necatrix e E. brunetti). Porém, utilizando a Multiplex
PCR em amostras com múltiplas espécies, os autores relataram que foi
possível amplificar somente os amplicons correspondentes a E. tenella e
E. mitis, já, para as amostras, com outras combinações de espécies não
se obteve sucesso. Também, comentaram que pequenas quantidades de
DNA, obtidas de espécies presentes em um pequeno número de oocistos
nas amostras, podem ter sofrido interferência de outras espécies
predominantes, que não permitiram a identificação das espécies
correspondentes aos oocistos presentes em pequenas quantidades,
conforme observado para E. brunetti, que em todos os casos não sofreu
amplificação. Logo, concluíram que a padronização dessa técnica é
muito difícil.
Portanto, para a melhor adequação de um programa de controle
das espécies de Eimeria em uma determinada região é fundamental o
conhecimento das espécies circulantes e sua ocorrência, pois o grau de
atividade dos anticoccidianos varia de acordo com a espécie de Eimeria
e, principalmente, quando o objetivo for o controle da coccidiose por
meio da vacinação, é fundamental a identificação das espécies, já que a
imunidade contra Eimeria spp é espécie específica. Sendo assim, tornase óbvio a importância do desenvolvimento e aprimoramento de
métodos de diagnóstico que tornem a identificação das espécies de
Eimeria, rápida, fácil, precisa e menos onerosa.
3
OBJETIVOS
3.1
OBJETIVO GERAL
Contribuir com o conhecimento das espécies de Eimeria
circulantes em frangos de corte no estado de Santa Catarina, utilizando o
diagnóstico molecular.
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar as espécies de Eimeria presentes em amostras de
fezes de frangos de corte, provenientes da mesorregião Sul do estado de
Santa Catarina, por meio da técnica de PCR Multiplex.
Verificar a ocorrência das espécies de parasitos do gênero
Eimeria nas integrações avícolas da mesorregião Sul do estado de Santa
Catarina.
4
MATERIAL E MÉTODOS
4.1
CARACTERÍSTICAS DA REGIÃO
As amostras de fezes de frango de corte foram coletadas, em
granjas, nos municípios que compreendem a mesorregião Sul do estado
de Santa Catarina (Figura 4), que possui uma área total de 8.084,5Km2.
O clima, segundo a classificação de Koeppen, é do tipo Cfa –
Subtropical (mesotérmico úmido com verão quente). Com médias
anuais, de 19 a 20ºC de temperatura, 1.100 a 1.500mm de precipitação
pluviométrica e, umidade relativa do ar de 80 a 82% (EMPRESA DE
PESQUISA AGROPECUÁRIA E EXTENSÃO RURAL DE SANTA
CATARINA/CENTRO DE SOCIOECONOMIA E PLANEJAMENTO
AGRÍCOLA, 2003b, c, d, e).
Conforme dados da Associação de Produtores de Pintos de
Corte (APINCO) (AVICULTURA INDUSTRIAL, 2012) o alojamento
de frangos de corte, em Santa Catarina, no mês de julho de 2012 foi de
84.440.519 de cabeças e, segundo o IBGE (2013) a mesorregião Sul do
estado de Santa Catarina foi responsável por 12,33% do rebanho avícola
catarinense em dezembro de 2011, sendo a segunda maior mesorregião
produtora do Estado.
Figura 4 – Divisão do estado de Santa Catarina em cinco mesorregiões
1 - Florianópolis
2 - Norte
3 - Oeste
4 - Serrana
5 - Sul
6 - Vale do Itajaí
Fonte: Wikipédia (2013).
57
4.2
COLETA DAS AMOSTRAS DE FEZES DE FRANGOS DE
CORTE
Segundo a Companhia Integrada de Desenvolvimento Agrícola
de Santa Catarina, estão cadastradas 673 propriedades para a criação de
frangos de corte na mesorregião Sul do Estado (CIDASC, 2013). Para o
cálculo do número de amostras foi considerada uma probabilidade de
ocorrência de 50% de qualquer uma das sete Eimeria spp., conforme
encontrado em outros estudos (CARVALHO et al., 2010; MORRIS et
al., 2007) e, um intervalo de confiança de 95%, com erro de 5%. O n da
amostra para uma população finita (673) foi obtido utilizando o
programa estatístico OpenEpi® - versão 3(DEAN et al., 2013).
Foram coletadas amostras de fezes de frangos de corte com
idade entre 28 a 48 dias em 251 granjas, distribuídas em 21 municípios
(Figura 5), no período de agosto de 2011 a fevereiro de 2012. As
amostras foram estratificadas por faixas etárias dos frangos, em três
intervalos, 28 a 34 dias, 35 a 41 dias e 42 a 48 dias. O número médio de
aves por lote era de 20.202 e a densidade média de 12 frangos / m².
Figura 5 – Locais de coleta de amostras de fezes de frangos de corte na
mesorregião sul do Estado
Municípios
coletados
Fonte: adaptado de Infoescola (2013).
58
Nos aviários de frangos de corte foram coletadas as amostras de
fezes recém-eliminadas de vários pontos (pool de fezes), partindo em
linha reta no lado esquerdo até o final do aviário e voltando pelo lado
direito para completar a coleta. As fezes foram acondicionadas em
frascos de 500mL, contendo 175mL de solução de dicromato de
potássio a 2,5% e completado com o material colhido, até atingir o
volume de 350mL.
As amostras, devidamente identificadas e acondicionadas,
foram encaminhadas ao Laboratório de Parasitologia e Doenças
Parasitárias do Centro de Ciências Agroveterinárias da Universidade do
Estado de Santa Catarina para a purificação dos oocistos de Eimeria
spp.
4.3
PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS DE FEZES DE
FRANGOS DE CORTE
4.3.1
Purificação e quantificação dos oocistos de Eimeria spp.
As amostras foram homogeneizadas e filtradas, utilizando
primeiro uma peneira com malha de nylon e depois um tecido de voil. O
material resultante da filtragem foi colocado em tubos com capacidade
para 125mL, centrifugado a 1.000g, por 5 minutos, o sobrenadante foi
descartado, o sedimento suspenso em água destilada e homogeneizado.
Esse processo foi repetido até a limpeza do sobrenadante
(aproximadamente quatro vezes).
Para a coleta dos oocistos o sedimento foi suspenso em solução
5,5M de NaCl (densidade de 1,209g/mL), homogeneizado e em seguida
centrifugado a 200g, por 10 minutos, os oocistos foram removidos da
superfície da solução com pipeta de Pasteur e transferidos para um tubo
cônico de 50mL. A homogeneização, centrifugação e coleta dos oocistos
foram repetidas quatro vezes.
Em seguida, para retirar o NaCl da amostra, foi adicionada água
destilada (1 parte de solução coletada para 9 partes de água),
centrifugado a 1.000g por 5 minutos e o sobrenadante descartado.
Adicionou-se ao sedimento resultante da etapa anterior, uma solução de
dicromato de potássio a 2,5% até completar um volume final de 10mL.
Os oocistos foram quantificados por meio de contagem em
câmara de Neubauer em um microscópio óptico (aumento de 100x).
Foram contados os oocistos em dez quadrados, sendo cinco de cada lado
da câmara, e o número encontrado multiplicado por mil, obtendo-se a
59
quantidade de oocisto por mL da solução de estoque (COSTA; PAIVA,
2009).
Os oocistos foram armazenados em tubos cônicos de 50mL e
mantidos a uma temperatura de 5 a 7°C até as etapas de extração do
DNA e da PCR, que foram executadas no Laboratório de Hemoparasitos
e Vetores do CAV/UDESC.
4.3.1.2 Análise estatística das médias de oocistos recuperados das
fezes de frangos de corte por intervalos de faixa etária
As médias de oocistos recuperados das amostras de fezes de
frangos de corte, estratificadas em três intervalos, 28 a 34 dias, 35 a 41
dias e 42 a 48 dias, foram submetidas à análise pelo teste de KruskalWallis ao nível de 5% de significância. As análises foram realizadas
utilizando-se o programa Action 2.5® (Free Software Foundation, Inc.).
4.3.2
Limpeza dos oocistos
Inicialmente foi adicionada água destilada a amostra e essa
centrifugada a 2.000g, e o sobrenadante descartado. O processo foi
repetido três vezes para a completa remoção do dicromato de K+, e as
amostras estoque de 10mL, armazenadas em tubos cônicos (tipo falcon
de 50mL) foram reduzidas a 3mL e divididas em dois microtubos de
2mL. Uma alíquota (1,5mL) foi utilizada para a extração, enquanto à
outra foi adicionado 500µL de uma solução de dicromato de potássio a
10% e armazenada a uma temperatura de 5 a 7°C para ser utilizada em
uma nova extração de DNA, caso necessário.
Na alíquota utilizada para a extração do DNA, foi adicionado à
amostra 150µL de uma solução de SDS (Dodecil Sulfato de Sódio) a
20% e homogeneizado por inversão. Para a retirada do SDS, as amostras
foram centrifugadas a 2.500g por 5 minutos, o sobrenadante retirado
com o auxílio de uma micropipeta de 1mL e adicionado ao sedimento
água Milli-Q® até completar o volume final de 2mL. O conteúdo do
tubo foi novamente homogeneizado por inversão e posteriormente
submetido à centrifugação (2.500g/5 min.) e o sobrenadante retirado e
descartado com auxílio de uma micropipeta de 1mL. O procedimento
para a limpeza das amostras foi executado duas vezes, conforme
descrito anteriormente, para cada amostra antes do processo de extração
do DNA.
4.3.3
Purificação do DNA de oocistos de Eimeria spp.
60
4.3.3.1
Ruptura dos oocistos
Para a ruptura dos oocistos o sedimento originado do
procedimento de limpeza foi suspenso em 500µL de tampão de lise
(10mM de Tris-HCl pH 8,0; 50mM de EDTA pH 8,0; 200mM de NaCl),
adicionado 2,5µl de RNAse A (10µg/µL), 0,5g de esferas de vidro de
210 a 300µm de diâmetro (Sigma-Aldrich®) e o microtubo
homogeneizado em um agitador tipo vórtex, na velocidade máxima, por
10 minutos.
4.3.3.2
Digestão com RNAse e Proteinase K
Após a ruptura mecânica dos oocistos, o tubo foi colocado em
um bloco seco a 37°C durante 15 minutos para a ação da RNAse e em
seguida centrifugado a 10.000g por 5 minutos e o sobrenadante
transferido para um microtubo de 1,5mL. Depois, foram adicionados
12,5µL de uma solução de SDS a 20%, 2,5µL de proteinase K
(20µg/µL), o tubo foi homogeneizado e incubado a 50°C em um bloco
seco por 30 minutos, para a ação da proteinase K.
4.3.3.3
Extração com fenol-clorofórmio
Foi adicionado as amostras resultantes da etapa anterior, 500µL
de fenol, homogeneizado e centrifugado a 3.500g durante 5 minutos, a
proteína é desnaturada e desse modo o DNA foi separado,
permanecendo na fase superior da solução, que foi retirada com auxílio
de uma micropipeta de 1mL e depositado em outro microtubo de 1,5mL,
contendo 250µL de fenol e 250µL de clorofórmio. Essa solução foi
homogeneizada e centrifugada a 3.500g durante 5 minutos e a fase
superior retirada e colocada em outro microtubo de 1,5ml contendo
460µL de clorofórmio. O conteúdo foi novamente homogeneizado e
centrifugado a 3.500g durante 5 minutos e a fase superior da solução
contendo o DNA foi retirada e colocada em outro microtubo de 1,5mL.
4.3.3.4
Precipitação e lavagem do DNA
Para a precipitação do DNA, foram acrescentados, à solução
originada da etapa anterior, 500µl de isopropanol (100%) gelado e
100µl de acetato de sódio 3M (pH 5,5), a solução foi homogeneizada e
armazenada a -20°C “overnight”. No dia seguinte, centrifugou-se a
amostra a 10.000g por 15 minutos a uma temperatura de 4°C, o
61
sobrenadante foi removido e descartado com auxílio de uma micropipeta
de 1mL. Depois, adicionou-se ao microtubo 1mL de etanol (70%)
gelado, a solução no tubo foi homogeneizada por inversão, e o tubo
centrifugado a 10.000g, durante 5 minutos a 4°C, e o sobrenadante
removido com uma micropipeta de 1mL. O microtubo foi colocado em
um bloco seco a 50 °C por 15 minutos ou até o etanol evaporar
totalmente e ao final, 40µL de água Milli-Q® estéril foi adicionada ao
tubo contendo o DNA precipitado. A curva de DNA foi medida com
auxílio do NanoDrop 2000® (Thermo Scientific) e a amostra estocada a
-20°C para a posterior utilização na técnica da PCR.
4.3.4
Multiplex PCR
Na figura 6 estão expressas as designações e sequências dos
“primers” utilizados e o tamanho dos amplicons (marcadores SCAR)
para cada uma das sete espécies de Eimeria de aves da espécie G. gallus
domesticus.
Figura 6 – “Primers Forward (F) e Reverse (R)”, utilizados na técnica de
Multiplex PCR para a detecção de E. acervulina (ac), E.
brunetti (br), E. tenella (tn), E. mitis (mt), E. praecox (pr), E.
maxima (mx), E. necatrix (nc) e o tamanho dos amplicons
(TA) gerados.
Designação
ac-A03-F
ac-A03-R
br-J18-F
br-J18-R
tn-K04-F
tn-K04-R
mt-A03-F
mt-A03-R
pr-A03-F
pr-A03-R
mx-A09-F
mx-A09-R
nc-A18-F
nc-ENec-R
Sequências dos Primers
AGT CAG CCA CAC AAT AAT GGC AAA CAT G
AGT CAG CCA CAG CGA AAG ACG TAT GTG
TGG TCG CAG AAC CTA CAG GGC TGT
TGG TCG CAG ACG TAT ATT AGG GGT CTG
CCG CCC AAA CCA GGT GTC ACG
CCG CCC AAA CAT GCA AGA TGG C
AGT CAG CCA CCA GTA GAG CCA ATA TTT
AGT CAG CCA CAA ACA AAT TCA AAC TCT AC
AGT CAG CCA CCA CCA AAT AGA ACC TTG G
GCC TGC TTA CTA CAA ACT TGC AAG CCC T
GGG TAA CGC CAA CTG CCG GGT ATG
AGC AAA CCG TAA AGG CCG AAG TCC TAG A
TTC ATT TCG CTT AAC AAT ATT TGG CCT CA
ACA ACG CCT CAT AAC CCC AAG AAA TTT TG
Fonte: adaptado de Fernandez et al. (2003a).
TA
811pb
626pb
539pb
460pb
354pb
272pb
200pb
62
A reação em cadeia da polimerase múltipla (Multiplex PCR) foi
desenvolvida em 35µL e utilizaram-se os seguintes reagentes: 200µM
de cada dNTP; 2,4mM de MgCl 2; 5U de Taq DNA polimerase e 5,6µL
do tampão (10x NH4 Buffer). Os sete conjuntos de “primers” foram
utilizados em diferentes concentrações, conforme segue: 0,85µM para
os pares de primers Ac-A03-F e R e Br-J18-F e R; 0,70µM para os pares
Pr-A03-F e R e Nc-A18-F e Nc-ENec-R; e 0,55µM para os pares MxA09-F e R, Tn-K04-F e R e Mt-A03-F e R. Para completar o volume de
35µL da reação foi utilizada água Milli-Q® estéril.
Durante a preparação da reação, os reagentes foram mantidos
sob refrigeração e o termociclador foi programado para executar o
seguinte ciclo, uma desnaturação inicial a 96°C durante 5 minutos,
seguido por 35 ciclos de 1 minuto a 94°C (desnaturação) e 2 minutos a
65°C (hibridação e extensão). E uma etapa final de extensão a 72°C
durante 7 minutos.
4.3.5
Eletroforese
Os produtos da PCR foram submetidos a uma eletroforese em
gel de agarose a 2% para que os amplicons pudessem ser separados para
visualização e com isso possibilitar a identificação das espécies de
Eimeria presentes na amostra. Para a eletroforese foram utilizados 12µL
da reação, homogeneizada com 7µL de tampão de amostra (azul de
bromofenol), essa solução foi aplicada em gel de agarose, imerso em
TBE (Tris-borato-EDTA) em uma cuba eletroforética. Para efeito de
escala, utilizou-se marcador de peso molecular de 100pb. E a fonte da
eletroforese foi regulada para aplicar 90V por 210 minutos ou até que o
azul de bromofenol alcançasse aproximadamente 3cm da borda final do
gel. Depois de terminada a corrida, o gel foi corado em uma cuba
contendo uma solução de Brometo de Etídio por aproximadamente 45
minutos e observado sob luz ultravioleta.
4.3.6
Clonagem dos marcadores de “Sequence-characterized
Amplified Region” (SCAR) de Eimeria spp.
Foram montadas reações da PCR utilizando como DNA molde
amostras positivas para uma ou mais espécies de Eimeria, de modo que
fossem gerados amplicons correspondentes a todas as espécies
encontradas. Em seguida, 12µL de cada reação juntamente com 7µL de
um tampão de amostra foram aplicadas em um gel de agarose a 2%,
imerso em TBE (Tris-borato-EDTA) e submetido à eletroforese (90 V
63
por 210 minutos). Depois de terminada a corrida, o gel foi corado em
uma solução de Brometo de Etídio e observado sob luz ultravioleta.
As bandas foram recortadas com auxílio de uma lâmina de
bisturi e retiradas do gel, e o DNA contido foi purificado utilizando-se o
HiYieldTM DNA gel/PCR Extraction Kit® (Real Biotech
Corporation®), conforme instruções do fabricante.
Em seguida, cada gene foi ligado ao plasmídeo pGEM-T Easy®
(Promega®), utilizando o seguinte protocolo:
 5μL de 2x Rapid Ligation Buffer;
 1μL do vetor pGEM-T Easy® (50ng);
 3μL do inserto (produto de PCR purificado);
 1μL da enzima T4 DNA ligase (1U);
 A reação foi mantida a 4ºC durante 12 horas.
Para a transformação, foram utilizadas células de Escherichia
coli (DH10B) cálcio-competentes. Alíquotas de 50μL de células
bacterianas foram homogeneizadas com 5μL da ligação de cada gene em
tubos para microcentrífuga de 1,5mL e incubadas por 30 minutos no
gelo. Em seguida, foi realizado um choque térmico a 42 ºC por 45
segundos e nova incubação no gelo por 90 segundos. Depois, foram
adicionados 300μl de meio SOC em cada tubo e incubados a 37ºC sob
agitação de 120RPM durante 1 hora. Em seguida, 200μL de cada
transformação foi plaqueada em meio LB sólido contendo 100μg/mL de
ampicilina, Xgal e IPTG para a formação de colônias azuis (não
contendo inserto ligado ao plasmídeo) ou brancas (contendo um inserto
ligado ao plasmídeo). As placas foram incubadas a 37 ºC por 16 horas.
A confirmação da presença do DNA clonal inserido no
plasmídeo, para as espécies de Eimeria, foi executada pela PCR
utilizando como DNA molde uma porção da colônia de bactérias e os
respectivos “primers” específicos para cada uma das espécies de
Eimeria, com a verificação o tamanho dos amplicons para as referidas
espécies.
As colônias que foram positivas para o inserto foram
selecionadas e cultivadas em meio LB líquido mais Ampicilina
(100µg/mL) a 37 °C sob agitação a 150rpm durante 16 horas, e o DNA
plasmidial foi extraído utilizando-se o HiYieldTM Plasmid Mini Kit®
(Real Biotech Corporation®), conforme instruções do fabricante.
A clonagem foi executada no Laboratório de Hemoparasitos e
Vetores do CAV/UDESC.
64
4.3.7
Sequenciamento dos clones de Eimeria spp.
O sequenciamento dos clones foi realizado no Laboratório de
Bioinformática da Universidade Federal de Santa Catarina, utilizando
um equipamento MegaBace 1000® DNA Analysis System®
(GE/Amersham Biosciences®). As reações de sequenciamento foram
preparadas a partir do DNA plasmidial e o Kit DYEnamic® ET Dye
Terminator (GE/Amersham Biosciences®) conforme especificações do
fabricante. Cada reação foi realizada empregando 5,0 pmol dos
iniciadores ‘forward’ correspondente ao clone da espécie a ser
sequenciada (Ac-A03F, Br-J18F, Tn-A03F, Mt-A03F, Pr-A03F, MxA09F, Nc-A18F) e EXCEL-R e aproximadamente 800ng de DNA
plasmidial, nas seguintes condições térmicas: 95°C por 25 segundos,
seguidos de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 segundos, ligação
dos iniciadores a 55°C por 30 segundos e extensão a 60°C por 80
segundos. Posteriormente, os produtos marcados foram precipitados
com isopropanol 70% e etanol absoluto, para retirada dos nucleotídeos e
iniciadores não incorporados. Os produtos purificados foram então
eletroinjetados a 2KV por 100 segundos e eletroeluídos por 150 minutos
a 7KV.
As sequências obtidas foram comparadas com as sequências dos
marcadores SCAR, por meio do programa “Basic Local Alignment
Search Tool”, para a confirmação da identidade e, também, para
comparação com as sequencias de outras cepas de Eimeria spp. de
frangos, depositadas (BLAST, 2013).
5
RESULTADOS
5.1
CONTAGEM DOS OOCISTOS DE Eimeria spp. OBTIDOS
DAS AMOSTRAS DE FEZES DE FRANGOS DE CORTE
Durante a contagem dos oocistos após a recuperação das fezes,
observaram-se oocistos não esporulados e esporulados (Figuras 7) e,
foram encontrados oocistos de tamanhos diferentes (Figuras 8).
Figura 7 – Oocistos não esporulado e esporulado, observados durante a
contagem em câmara de Neubaeuer (seta vermelha indica
oocisto não esporulado e seta azul, esporulado).
O número de oocistos recuperados por propriedade variou de
1.000 a 887.000 oocistos por mL, com uma média de 110.410, e com
uma ocorrência do gênero Eimeria de 96,02%. As amostras foram
provenientes de lotes de frangos de corte com idade entre 28 a 48 dias e,
não foi possível equalizar o número de amostras por intervalo. Assim,
foram coletadas 68 (28 a 34 dias); 111 (35 a 41 dias) e 72 (42 a 48 dias)
amostras de fezes de frangos de corte, com as seguintes médias de
oocistos por mL 151.338; 126.802 e 46.486, respectivamente (Figura 9).
66
Figura 8 – Oocistos com tamanhos e morfologias diferentes, observados
durante a contagem em câmara de Neubaeuer (seta vermelha
indica oocisto de menor tamanho e seta azul, de maior).
120
250.000
100
200.000
80
150.000
60
100.000
40
50.000
20
0
0
28 a 34
35 a 41
42 a 48
Idade dos lotes de frangos (dias)
N° de propriedades
N° médio de oocistos
N° médio de oocistos
N° de propriedades
Figura 9 – Número médio de oocistos por mL (+ Intervalo de confiança
a 95%) em amostras de fezes de frangos de corte da
mesorregião Sul de Santa Catarina, em três faixas etárias.
Relacionado com o número de propriedades por faixa etária.
67
Não foram observadas diferenças significativas entre as médias
dos intervalos de 28 a 34 e 35 a 41 dias (p>0,05), porém, houve
diferença significativa entre as médias dos intervalos de 28 a 34 e 42 a
48 dias e entre as médias dos intervalos de 35 a 41 e 42 a 48 dias
(p<0,05) (Tabela 1).
Tabela 1 – Comparação das médias de oocistos por mL recuperados de
fezes de frangos de corte em três intervalos de idades.
INTERVALOS DE IDADE
28 a 34 dias
35 a 41 dias
42 a 48 dias
N° médio de
151.338ª
126.802ª
46.486b
oocistos por mL
Nota: a,b. Letras diferentes na mesma linha significam diferença
estatística (P<0,05).
5.2
IDENTIFICAÇÃO DAS ESPÉCIES DE Eimeria PELA
MULTIPLEX PCR
A E. maxima foi a espécie mais frequente (63,7%), seguida por
E. acervulina (63,3%), E. tenella (54,6%), E. mitis (38,6%), E. praecox
(25,1%), E. necatrix (24,3%) e E. brunetti (13,1%) (Figura 10).
N° de propriedades positivas
Figura 10 – Número de propriedades positivas para E. acervulina (ac);
E. maxima (mx); E. tenella (tn); E. praecox (pr); E. mitis
(mt); E. necatrix (nc) e E. brunetti (br), das 251 granjas de
frangos de corte na mesorregião Sul de Santa Catarina.
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
159
160
137
97
63
61
33
ac
mx
tn
pr
mt
Espécie de Eimeria
nc
br
68
Todas as espécies de Eimeria que parasitam aves da espécie G.
gallus domesticus foram encontradas na mesorregião Sul do estado de
Santa Catarina, porém, as sete espécies não ocorreram em todos os
municípios (Tabela 2).
Tabela 2 – Espécies de Eimeria identificadas e numero de granjas
amostradas, por município na mesorregião Sul do Estado.
N° de espécies
Espécies
Município
N° de granjas
3
pr, nc, br
ac, mx, tn
Grão Pará
Morro da Fumaça
1
2
ac, mx, tn, MT
Braço do Norte
ac, mx, tn, pr
Ermo
1
6
ac, mx, tn, br
Içara
3
ac, mx, tn, mt, pr, nc
Araranguá
ac, mx, tn, mt, pr, nc
Criciúma
4
3
ac, mx, tn, mt, pr, nc
Forquilhinha
1
ac, mx, tn, mt, pr, br
Lauro Müller
5
ac, mx, tn, mt, pr, nc
Sombrio
1
ac, mx, tn, mt, nc, br
Treze de Maio
7
ac, mx, tn, mt, pr, nc
Urussanga
10
4
6
7
Total
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Meleiro
9
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Morro Grande
26
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Nova Veneza
35
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Orleans
31
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Pedras Grandes
11
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Siderópolis
31
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Timbé do Sul
20
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Treviso
14
ac, mx, tn, mt, pr, nc, br
Turvo
30
251
Nota: E. acervulina (ac), E. maxima (mx), E. tenella (tn), E. praecox
(pr), E. mitis (mt), E. necatrix (nc) e E. brunetti (br).
69
A aplicação da técnica de Multiplex PCR nas amostras gerou
amplicons do tamanho esperado para cada uma das sete espécies que
parasitam aves da espécie G. gallus domesticus, conforme segue: E.
acervulina (811 pb), E. brunetti (626 pb), E. tenella (539 pb), E. mitis
(460 pb), E. praecox (354 pb), E. maxima (272 pb) e E. necatrix (200
pb) (Figuras 11 e 12).
Figura 11 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da Multiplex
PCR de Eimeria spp., de amostras da mesorregião Sul do
estado de Santa Catarina: 1(marcador de 100pb); 2
(amostra 163: controle interno positivo com ac, tn, mt, pr,
mx e nc); 3 (ac e mx); 4 (pr); 5 (ac, tn e mx); 6 (ac, tn, mt,
mx e nc), 7 (ac, tn, mt e mx) e 8 controle negativo.
1
2
3
4
5
6
7
8
2.000 pb
1.000 pb
811pb (ac)
500 pb
539pb (tn)
460pb (mt)
354pb (pr)
272pb (mx)
200pb (nc)
100 pb
Nota: E. acervulina (ac), E. maxima (mx), E. tenella (tn), E. praecox
(pr), E. mitis (mt), E. necatrix (nc) e E. brunetti (br).
70
Figura 12 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da Multiplex
PCR de Eimeria spp., de amostras da mesorregião Sul do
estado de Santa Catarina: 1(marcador de 100pb); 2 (
controle positivo - clones: ac, br, tn, mt, pr, mx e nc); 3 a 10
amostras negativas, 11 (br), 12 (ac, mt, pr e mx), 13 (tn, pr
e mx) e 14 controle negativo.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14
2.000 pb
1.000 pb
626pb (br)
500 pb
100 pb
Nota: E. acervulina (ac), E. maxima (mx), E. tenella (tn), E. praecox
(pr), E. mitis (mt), E. necatrix (nc) e E. brunetti (br).
5.3
CONFIRMAÇÃO DA CLONAGEM DOS MARCADORES
DE “SEQUENCE-CHARACTERIZED AMPLIFIED REGION”
(SCAR) DAS AMOSTRAS
O processo de clonagem dos “amplicons” de tamanho
correspondentes aos marcadores SCAR das sete espécies de Eimeria,
detectados em amostras positivas, foi confirmado por meio da Multiplex
PCR, utilizando como molde o DNA plasmidial dos clones das sete
espécies de Eimeria e os sete conjuntos de “primers” correspondentes
aos marcadores SCAR (Figura 13).
71
Figura 13 – Eletroforese em gel de agarose dos produtos da Multiplex
PCR de Eimeria spp.: 1 (marcador de 100 pb); 2 e 3 (clones
dos SCAR de ac, br, tn, mt, pr, mx e nc).
1
2
3
2.000 pb
1.000 pb
811pb (ac)
626pb (br)
500 pb
539pb (tn)
460pb (mt)
354pb (pr)
272pb (mx)
200pb (nc)
100 pb
Nota: E. acervulina (ac), E. maxima (mx), E. tenella (tn), E. praecox
(pr), E. mitis (mt), E. necatrix (nc) e E. brunetti (br).
72
Identificou-se em média, três espécies de Eimeria por
propriedade, nas 251 granjas amostradas. As combinações mais
frequentes foram de E. acervulina, E. maxima e E. tenella (9,16%),
seguida de E. acervulina, E. maxima, E. tenella e E. mitis (8,76%). A E.
acervulina teve uma maior participação em infecções múltiplas (Tabela
3).
Tabela 3 – Número de propriedades com diferentes combinações de
espécies de Eimeria em 251 propriedades (continua).
N° de espécies
1
2
Espécies
N° de propriedades
ac
mx
10
17
tn
5
pr
0
mt
2
nc
5
br
3
ac+mx
7
ac+tn
6
ac+pr
1
ac+mt
3
ac+nc
2
ac+br
2
mx+tn
5
mx+pr
1
mx+mt
3
mx+nc
1
tn+pr
1
tn+mt
4
pr+mt
3
pr+nc
2
mt+nc
1
nc+br
4
Total
%
42
16,73
46
18,33
73
Tabela 3 – Número de propriedades com diferentes combinações de
espécies de Eimeria em 251 propriedades (continua).
N° de espécies
3
4
Espécies
N° de propriedades
ac+mx+tn
ac+mx+mt
23
5
ac+mx+nc
6
ac+mx+br
2
ac+tn+mt
5
ac+tn+nc
2
ac+tn+br
1
ac+pr+mt
2
mx+tn+pr
1
mx+tn+mt
2
mx+pr+mt
1
mx+pr+nc
1
mx+nc+br
1
pr+nc+br
2
ac+mx+tn+pr
4
ac+mx+tn+mt
22
ac+mx+tn+nc
5
ac+mx+tn+br
2
ac+mx+pr+mt
3
ac+mx+mt+nc
1
ac+mx+mt+br
1
ac+tn+pr+nc
1
ac+tn+pr+br
1
ac+pr+mt+nc
1
mx+tn+pr+mt
1
mx+tn+pr+nc
2
mx+tn+pr+br
1
mx+tn+mt+nc
1
mx+mt+nc+br
1
tn+pr+mt+nc
1
Total
%
54
21,51
48
19,12
74
Tabela 3 – Número de propriedades com diferentes combinações de
espécies de Eimeria em 251 propriedades (conclusão).
N° de espécies
Espécies
N° de propriedades
ac+mx+tn+pr+mt
ac+mx+tn+pr+nc
16
1
ac+mx+tn+pr+br
1
ac+mx+tn+mt+nc
3
ac+mx+tn+mt+br
2
ac+mx+tn+nc+br
1
ac+mx+tn+pr+mt+nc
9
ac+mx+tn+pr+mt+br
1
ac+mx+tn+pr+nc+br
3
ac+mx+tn+mt+nc+br
3
ac+tn+pr+mt+nc+br
1
Ooocisto
Negativo
PCR
Negativo
5
6
TOTAL
Total
%
24
9,56
17
6,77
10
10
3,99
10
10
3,99
251
100
Nota: E. acervulina (ac), E. maxima (mx), E. tenella (tn), E. praecox
(pr), E. mitis (mt), E. necatrix (nc) e E. brunetti (br).
A ferramenta “Basic Local Alignment Search” (BLAST, 2013)
foi utilizada para a busca no “GenBank”, de sequências de nucleotídeos
similares aos obtidos do sequenciamento dos clones, provenientes dos
amplicons das sete espécies de Eimeria, identificadas na mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina. Observou-se que as sequências dos
clones foram fiéis aos respectivos marcadores SCAR, utilizados para a
identificação das espécies de Eimeria que parasitam aves da espécie G.
gallus domesticus, nesse estudo. Os percentuais de máxima identidade
variaram de 96 a 99% de acordo com a espécie de Eimeria (Figura 14).
Também, encontrou-se uma cepa Indiana de E. tenella que possui 98%
de similaridade com a cepa dessa espécie, identificada na mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina. O alinhamento das sequências dos
nucleotídeos dos clones obtidos neste trabalho, com outras sequências
75
depositadas no “GenBank”, encontradas utilizando a ferramenta
“BLAST”, estão demonstradas nos anexos A, B, C, D, E, F, G.
Figura 14 – Similaridade dos produtos do sequenciamento com as
sequências dos marcadores RAPD-SCAR das sete
espécies de Eimeria depositados no “National Center for
Biotechnology Information”
Acesso
Descrição
M.P.
T.P.
C.C.
%
E
valor
M.I.
%
AY571520.1
RAPD-SCAR Ac-A03-818
1037
1037
100
0.0
99
AY571556.1
RAPD-SCAR Br-J18-626
965
965
97
0.0
99
AY571503.1
RAPD-SCAR Mt-A03-460
732
732
99
0.0
99
AY571634.1
RAPD-SCAR Tn-K04-539
828
828
44
0.0
99
AY571602.1
RAPD-SCAR Pr-A03-718
488
488
27
4e140
99
AY571564.1
RAPD-SCAR Nc-A18-674
200
200
16
2e-53
96
AY571588.1
RAPD-SCAR Mx-A09-1008
73.1
73.1
7
4e-14
96
Nota: M.P. (máxima pontuação), T.P. (total de pontos), C.C. (percentual
de cobertura de consultas), M.I. (percentual de máxima identidade).
Fonte: adaptado de BLAST (2013).
6
DISCUSSÃO
Foram coletadas amostras em 251 propriedades para o estudo.
Segundo a CIDASC (2013), estão cadastradas 673 propriedades para a
criação de frangos de corte na mesorregião Sul do Estado, portanto,
considerando uma probabilidade de ocorrência de 50% de qualquer uma
das sete Eimeria spp., conforme encontrado em outros estudos
(CARVALHO et al., 2010; MORRIS et al., 2007) e, um intervalo de
confiança de 95%, com erro de 5%, utilizando o programa estatístico
OpenEpi® - versão 3(DEAN et al., 2013), obteve-se, que o n amostral,
necessário para um estudo de prevalência, seria 245 propriedades.
Também, utilizando os mesmos parâmetros, substituindo apenas o n
total (673 propriedades cadastradas) pelo n total de 521, obtido de
acordo com as seguintes informações: alojamento de 84.440.519 pintos
de corte em SC (APINCO, 2012) X 12,33% alojado na mesorregião Sul
do Estado (IBGE, 2013) / 20.000 (n° médio de frangos por propriedade),
neste caso, aplicando o programa estatístico OpenEpi® - versão 3 o n
amostral, seria de 222 propriedades (DEAN et al., 2013).
Demonstrando, que o número de propriedades em que foram coletadas
as amostras, permite uma ótima análise da realidade da ocorrência das
espécies de Eimeria nas instalações de frangos de corte de explorações
avícolas comerciais, instaladas na mesorregião Sul do estado de Santa
Catarina.
A ocorrência do gênero Eimeria nas granjas estudadas foi de
96,02%, semelhante às ocorrências relatadas por Williams et al. (1996)
na França (92,68%), Lee et al. (2010) na Coréia (78,7%), Kawahara et
al. (2008) no Japão (100%), McDougald et al. (1986) nos Estados
Unidos (100%), McDougald et al. (1987) em estudos em algumas
granjas no Brasil e na Argentina (98,89%) e Carvalho et al. (2011) no
estado da Bahia, Brasil (100%). Demonstrando uma alta ocorrência do
parasito nas criações avícolas do Sul do estado de Santa Catarina,
semelhante às descritas em criações avícolas em várias partes do mundo.
A menor quantidade de oocistos de Eimeria spp. na faixa etária
de 42 a 48 dias, quando comparado com os intervalos de 28 a 34 e 35 a
41 dias, pode ser explicado pelo fato de que, frangos mais jovens são
mais susceptíveis a infecção do que frangos mais velhos. Segundo
Chapmam (1999), frangos submetidos ao tratamento profilático com
anticoccidianos adquirirem imunidade contra Eimeria spp. devido a
exposição controlada ao parasito durante a vida do lote, tornando-os
mais resistentes a infecção. Esse autor demonstrou, que frangos criados
77
experimentalmente em camas contaminadas com o parasito não
adquirem imunidade antes da 4ª semana de idade, independente da
utilização ou não de drogas anticoccidianas e, em experimentos com
frangos que foram criados em sistemas comerciais recebendo
anticoccidianos, comprovou que a consolidação da imunidade nessas
aves quando expostas a infecções naturais, ocorre entre a 6ª ou 7ª
semana de idade. Haug et al. (2008), em um estudo epidemiológico na
Noruega, encontraram uma maior quantidade de oocistos por grama de
fezes em frangos de corte com idade entre 20 a 32 dias, do que acima de
36 dias de idade. O fato das aves passarem por um processo de
imunização natural, não assegura que estas aves não possam vir a
desenvolver a coccidiose, caso a medicação via ração seja retirada de
um lote ou integração, acima de 6 ou 7 semanas. Pois, não é possível, a
partir das monitorias executadas usualmente pelos técnicos das
agroindústrias, medir o grau e a uniformidade dos estímulos causados
pelas infecções naturais, de modo a garantir que há uma imunidade
completa contra uma ou mais espécies de Eimeria, em um lote e,
principalmente em todas as propriedades que compõem uma integração.
Também, outros fatores que diminuam a resposta imune dessas aves
como doenças imunossupressoras, podem quebrar o equilíbrio da
resistência contra a coccidiose.
A ocorrência de oocistos de diferentes tamanhos (Figura 5)
justifica a necessidade de aprofundar estudos para identificar as espécies
de Eimeria na mesorregião Sul do estado de Santa Catarina. No entanto,
as características morfológicas por si só, são insuficientes para uma
identificação segura, conforme citaram Macpherson e Gajadhar (1993).
Utilizando a PCR, Prado (2005), investigou a ocorrência de E.
acervulina, E. maxima, E. tenella e E. mitis em 10 granjas de frangos de
corte em Concórdia, empregando como alvo a região ITS-1 do rDNA.
Porém, não encontrou E. mitis. Meireles et al. (2004) utilizaram o
mesmo alvo para investigar a presença de E. mitis e E. praecox, em
cinco amostras de fezes de frangos de corte, provenientes de Santa
Catarina, todas foram positivas para E. mitis e quatro amostras para E.
praecox. A ocorrência das espécies E. necatrix e E. brunetti em lotes de
frangos de corte, não foram investigadas por meio da PCR no estado de
Santa Catarina e, não há registros da utilização da técnica de Multiplex
PCR para a identificação de Eimeria spp no Estado.
Na mesorregião Sul do estado de Santa Catarina foram
encontradas as sete espécies de Eimeria que parasitam aves da espécie
G. gallus domesticus. Apesar das sete espécies de Eimeria não terem
sido identificadas em todos os municípios que compõem a mesorregião
78
estudada, foram encontradas em propriedades que estão vinculadas a
duas empresas integradoras, que atuam na região (em que foram
coletadas as amostras), sem que haja uma divisão geográfica para a
exploração pelas empresas, sendo que, muitas vezes, as propriedades
integradas a uma ou outra empresa estão localizadas próximas.
Associado a isso, cada empresa, possui características operacionais
únicas, que são estendidas a todos seus integrados, como por exemplo, o
manejo; o mesmo veículo de transporte de ração e; as visitas técnicas
nas propriedades de vários municípios são, muitas vezes, executadas
pelo mesmo técnico. Essas características facilitam a disseminação das
espécies de Eimeria entre os municípios. Também, o fato das duas
integrações, possuírem apenas uma fábrica de ração, cada, torna difícil a
implantação de métodos de controles específicos para cada
microrregião, sendo assim, um único método é extendido para toda a
empresa. Portanto, a implantação de diferentes métodos de controle da
coccidiose em uma empresa, como por exemplo, utilização de diferentes
programas anticoccidianos por microrregiões ou a adoção da vacinação
para uma parte da integração, não é de fácil execução. Tornando, usual a
instituição de um método único de controle para toda a integração de
uma empresa, deste modo, deve-se considerar a adoção de medidas
profiláticas que visem o controle de todas as espécies de Eimeria que
parasitam frangos de corte, na mesorregião Sul do Estado.
Em várias regiões do mundo, estudos empregando diferentes
métodos de diagnóstico, como por exemplo, o diagnóstico morfoclínico, associado à eletroforese de isoenzimas (KUČERA, 1990; TEBO
et al., 1998); a PCR utilizando marcadores da região ITS 1 (AARTHI et
al., 2010; LEE et al., 2010; SUN et al., 2009); a PCR utilizando
marcadores da região ITS 2 (MORRIS et al., 2007) e a Multiplex PCR
utilizando marcadores SCAR (CARVALHO et al., 2011), também,
demonstraram a presença de todas as espécies de Eimeria que parasitam
frangos. Confirmando a ampla disseminação das sete espécies em
explorações avícolas.
Neste estudo as infecções múltiplas foram mais comuns, com
uma média de 2,96 espécies de Eimeria por propriedade. O fato de
serem encontradas mais de uma espécie por granja, ou seja, infecções
múltiplas, também, foram relatadas em outras investigações empregando
diferentes métodos de diagnóstico, como por exemplo, o diagnóstico
morfo-clínico (MCDOUGALD et al., 1986), morfo-clínico associado à
eletroforese de isoenzimas (KUČERA, 1990; WILLIAMS et al., 1996);
a PCR utilizando marcadores da região ITS 1 (AARTHI et al., 2010;
HAUG et al., 2008; LEE et al., 2010; SUN et al., 2009); a PCR
79
utilizando marcadores da região ITS 2 (MORRIS et al., 2007) e a
Multiplex PCR utilizando marcadores SCAR (CARVALHO et al.,
2011).
A infecção múltipla mais frequente foi entre E. acervulina, E.
maxima e E. tenella, essa associação, também foi a mais frequente em
um trabalho desenvolvido por McDougald et al. (1986).
A E. maxima foi a espécie de maior ocorrência, estando
presente em 63,7% das amostras. Outros estudos, baseados somente na
morfologia e medidas dos oocistos, também encontraram essa espécie
como a mais frequente (CARDOZO; YAMAMURA, 2006; LUCHESE
et al. 2007; TERRA et al., 2001) e, McDougald et al. (1987) que
utilizaram para o diagnóstico um conjunto de técnicas morfo-clínicas,
tornando assim, o resultado mais confiável que os autores anteriores,
que basearam seus resultados em uma característica apenas. Santos et al.
(2003) identificaram E. acervulina, E. maxima e E. tenella, baseando-se
na análise do local parasitado, aspectos das lesões macroscópicas e
análise morfológica e morfométrica dos oocistos e, citaram que somente
pela a análise morfológica e morfométrica dos oocistos não foi possível
distinguir as diferentes espécies de Eimeria. Também, o período prépatente, associado a raspados da mucosa intestinal das respectivas áreas
de infecção de cada espécie, foram importantes para possibilitar a
identificação de E. praecox (duodeno) e E. mitis (íleo).
A segunda espécie mais frequente na mesorregião Sul do
Estado foi E. acervulina (63,3%), entretanto, em Concórdia, Santa
Catarina, Prado (2005) encontrou uma maior ocorrência de E.
acervulina (90%), seguida de E. maxima e E. tenella que foram
identificadas em 60% das amostras.
Portanto, E. acervulina e E. maxima foram as mais frequentes
dentre as outras sete espécies, o mesmo foi encontrado por McDougald
et al. (1986) e Morris et al. (2007). Essas espécies causam lesões
macroscópicas bem sugestivas, sendo comumente diagnosticadas pelos
técnicos nas integrações avícolas, portanto, são tomadas como as
grandes responsáveis pelos prejuízos causados pela coccidiose, nas
produções de frangos de corte.
A E. tenella foi identificada em 54,6% das amostras. Kutkat et
al. (2009) utilizando a Multiplex PCR, tendo como alvo os mesmos
marcadores SCAR empregados, nesse trabalho, identificou a E. tenella
em 50% das amostras. Já, Prado (2005) encontrou essa espécie em 60%
das granjas analisadas em Concórdia. Alguns autores têm descrito
ocorrências maiores, como por exemplo, Sun et al. (2009) que relataram
a ocorrência de E. tenella em 90% da amostras e Morris et al. (2007) em
80
86%. Esta espécie é altamente patogênica e causa grande mortalidade de
aves.
A E. brunetti esteve presente em um menor número de amostras
(13,1%), o mesmo foi verificado por McDougald et al. (1986) que a
encontraram em 10% das amostras e Sun et al. (2009) em 8%. Porém,
outros autores têm descrito uma grande ocorrência dessa espécie, Morris
et al. (2007) a encontraram em 71% das amostras, Kawahara et al.
(2008), utilizando a “Real-time PCR”, em 65,62% e Lee et al. (2010)
em 59,3%. Essa espécie é considerada como sendo de alta
patogenicidade, portanto, mesmo com uma baixa ocorrência, seu
potencial para causar prejuízos deve ser levado em consideração.
A segunda espécie menos frequente foi a E. necatrix, essa
espécie não havia, até então, sido identificada em criações de frangos de
corte no estado de Santa Catarina. Essa espécie é conhecida por causar
coccidiose em aves de vida longa, pois, o seu baixo potencial
reprodutivo a torna incapaz de competir com outras espécies de Eimeria,
sendo mais comum em lotes de galinhas a partir da 9ª semana de idade
(MCDOUGALD et al., 2003). Segundo Kučera (1990) é provável que a
presença da E. tenella nos cecos, no momento da migração dos
merozoítos de E. necatrix para esta região, limite o desenvolvimento dos
estágios sexuais dessa espécie. Todavia, apesar das amostras de fezes
terem sido obtidas de frangos, com idade máxima de 48 dias, a E.
necatrix foi encontrada em 24,3% das propriedades analisadas na
mesorregião Sul de Santa Catarina. Sun et al. (2009) identificaram essa
espécie em 26% das amostras, provenientes de frangos de corte. A
presença da E. necatrix em frangos tem sido documentada em vários
trabalhos, porém, tem-se descrito grandes variações na ocorrência dessa
espécie, Haug et al. (2008) a encontraram em 2% das amostras,
enquanto que Carvalho et al. (2011) verificaram a presença dessa
espécie em 93,3% e Morris et al. (2007) em 100% das amostras. Essa
espécie é uma das mais patogênicas.
Neste estudo, E. praecox e E. mitis foram encontradas em
25,1% e 38,6% das amostras, respectivamente. Em um estudo, Kučera
(1990) identificou E. praecox em 31,25% das amostras e, Lee et al.
(2010) encontrou E. mitis em 31,5% das amostras. Todavia, as
ocorrências de E. praecox em alguns estudos variou de 10% (HAUG et
al., 2008) a 100% (CARVALHO et al., 2011; KUTKAT et al., 2009;
MORRIS et al., 2007), e de E. mitis de 31,3% (LEE et al., 2010) a
93,3% (CARVALHO et al., 2011). Portanto, em algumas situações
essas espécies encontravam-se amplamente disseminadas nos lotes de
frangos e, apesar de, no passado, terem sido consideradas não
81
patogênicas por muitos pesquisadores, tanto que em muitos estudos não
eram sequer pesquisadas (MCDOUGALD et al., 1986), provou-se que
estão associadas a perdas no desempenho dos frangos (WILLIAMS et
al., 1998; JORGENSEN et al., 1997).
As diferenças nas ocorrências das espécies de Eimeria que
parasitam frangos de corte, demonstradas em vários estudos (HAUG et
al., 2008; KAWAHARA et al., 2008; KUČERA, 1990; KUTKAT et al.,
2009; LEE et al., 2010; MORRIS et al., 2007; PRADO, 2005;
WILLIAMS et al., 1996; SUN et al., 2009). Podem estar relacionadas às
características climáticas da região (AWAIS et al., 2011; HAUG et al.,
2008; NOWZARI et al., 2005), pois durante o ciclo biológico da
Eimeria spp há uma dependencia de condições climáticas (temperatura e
umidade) para que ocorra a fase exógena de desenvolvimento
(esporulação). Também, segundo Williams et al. (1996), os diversos
programas de controle com anticoccidianos (molécula, dose, esquema
de utilização) podem limitar a ocorrência de algumas espécies de
Eimeria mais que outras, ocasionando mudanças nas populações destes
parasitos. A utilização de vacinas que não contenham todas as espécies
de Eimeria circulantes em uma determinada região pode causar uma
seleção imunológica, fazendo com que a frequência de algumas espécies
aumente (WILLIAMS, 1998). Ruff (1999) e Sangster (2001) citaram
que as diferenças de manejo como, por exemplo, os que alteram a
qualidade da cama aviária, podem influenciar na ocorrência das espécies
de Eimeria devido às características biológicas do parasito, pois, as
espécies de Eimeria dependem de umidade para esporular, porém, são
sensíveis ao gás amônia, que é liberado em maior quantidade a partir de
camas aviárias úmidas.
Verificou-se que em apenas dez amostras os resultados
observados com a utilização da Multiplex PCR foram negativos, apesar
do número de oocistos para a extração do DNA nessas amostras,
encontrar-se na faixa de 3.000 a 42.000. Segundo Haug et al. (2007)
problemas com relação a negatividade da PCR podem ocorrer em
amostras com poucos oocistos ou devido a grande quantidade de
resíduos remanescentes da etapa de purificação dos oocistos. Ambos os
fatores podem interferir na extração do DNA por impedir um adequado
rompimento dos oocistos e esporocistos e, além disso, amostras com
grandes quantidades de oocistos podem interferir devido a uma
sobrecarga de DNA que pode inibir a reação. Porém, no presente estudo,
obteve-se a identificação de Eimeria spp. pela técnica da Multiplex PCR
com amostras de DNA extraídas a partir de uma ampla faixa de número
de oocistos (3.000 a 7.266.000), sugerindo que a negatividade observada
82
em algumas amostras não foi ocasionada pela quantidade de oocistos,
estando de acordo com as observações feitas por Jenkins et al. (2006)
que afirmam, que a grande quantidade de DNA não parece ter relação
com a negatividade da PCR, já que algumas amostras são inibitórias,
enquanto outras com mesmas quantidades de oocistos não são, e que
esta interferência na PCR se deve à presença de inibidores da reação em
determinadas amostras de cama aviária.
A comparação das quantidades de DNA obtidos das amostras,
com as quantidades de oocistos presentes nestas, não foi diretamente
proporcional. De acordo com Haug et al. (2007), a qualidade da amostra
(grande quantidade de detritos fecais) interfere na produção de DNA
que por sua vez não é diretamente proporcional à quantidade de
oocistos. Fernandez et al. (2003a) comprovaram esse fato por meio de
testes de sensibilidade da Multiplex PCR a partir de diluições de
oocistos.
Os resultados obtidos no sequenciamento e analisados pelo
“Basic Local Alignment Search” (BLAST, 2013), demonstraram
perfeita similaridade com os respectivos marcadores SCAR das sete
espécies de Eimeria que parasitam aves da espécie G. gallus domesticus,
depositados no “GenBank” por Fernandez et al. (2004). Entretanto, para
os clones de E. tenella, E. maxima, E. praecox e E. necatrix foi obtida a
sequência parcial e, portanto as sequências destes com os respectivos
alvos (SCAR) não puderam ser integralmente verificadas. Todavia,
nesse estudo, os amplicons produzidos para as sete espécies de Eimeria,
resultantes da PCR das amostras, apresentaram tamanhos idênticos aos
marcadores SCAR descritos por Fernandez et al. (2003a). A pesquisa
para analisar a similaridade de cepas de Eimeria spp. identificadas em
outras regiões, com as cepas obtidas e sequenciadas a partir desse
trabalho, utilizando o BLAST (2013), encontrou somente o depósito das
sequências de nucleotídeos referentes aos marcadores SCAR utilizados
na Multiplex PCR, depositados por Fernandez et al. (2004) e
marcadores SCAR para a utilização em um “Real-time PCR” (VRBA et
al., 2010), desenvolvidos com base naqueles primeiros. Apenas uma
cepa de E. tenella (acesso: FJ515794.1), proveniente da Índia,
depositada por Raman et al. (2009, apud BLAST, 2013) foi encontrada,
a partir da busca no “GenBank”, sendo que, o clone obtido nesse
trabalho foi 98% e 99% similar a cepa indiana e ao marcador SCAR
utilizado nesse estudo, respectivamente (BLAST, 2013).
7
CONCLUSÕES
Em frangos de corte na mesorregião Sul do estado de Santa
Catarina ocorre E. acervulina, E. maxima, E. tenella, E. mitis, E.
praecox, E. brunetti e E. necatrix.
As sete espécies de Eimeria que parasitam aves da espécie G.
gallus domesticus, podem ser identificadas em única reação em cadeia
da polimerase, utilizando a Multiplex PCR.
8
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Na mesorregião Sul do estado de Santa Catarina, a adoção de
medidas profiláticas contra coccidiose, em criações de frangos de corte,
deve levar em consideração o controle das sete espécies de Eimeria que
parasitam aves da espécie G. gallus domesticus.
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APÊNDICES E ANEXOS
APÊNDICE A – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. maxima, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina.
Fonte: BLAST (2013).
103
APÊNDICE B – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. acervulina, proveniente da
mesorregião Sul do estado de Santa Catarina.
Fonte: BLAST (2013).
104
APÊNDICE C – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. brunetti, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina (continua).
105
APÊNDICE C – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. brunetti, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina (conclusão).
Fonte: BLAST (2013).
APÊNDICE D – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. mitis, proveniente da mesorregião Sul
do estado de Santa Catarina (continua).
106
APÊNDICE D – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. mitis, proveniente da mesorregião Sul
do estado de Santa Catarina (conclusão).
Fonte: BLAST (2013).
107
APÊNDICE E – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. necatrix, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina.
Fonte: BLAST (2013).
108
APÊNDICE F – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. praecox, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina.
Fonte: BLAST (2013).
109
APÊNDICE G – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. tenella, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina (continua).
110
APÊNDICE G – Sequências de núcleotídeos depositadas no “GenBank”
que produziram alinhamentos significativos com a
sequência de E. tenella, proveniente da mesorregião
Sul do estado de Santa Catarina (conclusão).
Fonte: BLAST (2013).