AVALIAÇÃO DE UMA VACINA RECOMBINANTE PARA PREVENIR A
ELIMINAÇÃO DE OOCISTOS DE Eimeria tenella EM FRANGOS DE
CORTE
Vanessa Figueredo Pereira (CNPq/MAPA/SDA Nº 64/2008), José da Silva
Guimarães Junior (Orientador), João Luis Garcia, Odilon Vidotto, Guilherme
Felippelli Martins, Alexey Leon Gomel Bogado, e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva/Londrina, PR.
Ciências Agrárias/Doenças Parasitárias de Animais
Palavras-chave: Eimeria, proteína recombinante, frango de corte.
Resumo:
A Eimeriose aviária é uma doença causada por protozoários, coccídios que
apresentam ciclo biológico intracelular ao longo do epitélio intestinal. As aves
se infectam ao ingerir oocistos esporulados, podendo causar graves problemas às criações de frangos, como redução do ganho de peso e aumento da
conversão alimentar, gerando grandes perdas econômicas, sendo a prevenção mais importante que o tratamento. O objetivo do presente trabalho é
avaliar uma vacina recombinante para prevenir a eliminação de oocistos de
Eimeria tenella em frangos de corte. A metodologia utilizada foram técnicas
de reação em cadeia da polimerase (PCR), e será realizada clonagem dos
genes, expressão de proteínas em Escherichia coli BL21. As proteínas recombinantes serão purificadas por afinidade em coluna de resina de níquel
(Qiagen) por condições desnaturantes. As etapas seguintes serão a caracterização das proteínas por gel de poliacrilamida SDS- PAGE e western blotting. Os resultados obtidos até o momento foi possível obter fragmentos do
DNA através da reação em cadeia da polimerase (PCR). Uma vez confirmada a identidade por sequenciamento dos genes obtidos, será realizada a clonagem destes segmentos gênicos, expressão e caracterização das proteínas. Finalmente o projeto seguirá com o teste in vivo e avaliação do potencial das proteínas em estimular a imunidade protetora.
Introdução
Eimeria tenella é uma das principais espécies envolvidas na coccidiose em
frangos de corte e está associada à perdas na produção avícola
(GUIMARÃES Jr, et al. 1988), com custos estimados em U$ 3 bilhões em
todo o mundo (WILLIAMS, 1999).
O principal método utilizado para o controle desta parasitose consiste
no uso de anticoccídicos acrescentados à ração, no qual se observa pelo
menos três problemas: a ocorrência de resistência por Eimeria spp.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
(Vermeulen et al., 2001), a exigência da população consumidora, que busca
produtos isentos agentes químicos (Min et al., 2004) e a retirada progressiva
dessas drogas como exigência de mercados importadores (Shirley et al.,
2007).
As vacinas atualmente comercializadas ou as em fase de pesquisa,
como alternativa aos medicamentos anticoccídicos, incluem organismos
vivos virulentos ou atenuados, parasitas não infectivos, vacinas de
subunidades e vacinas obtidas por engenharia genética (HONG et al., 2006).
As vacinas vivas atenuadas ou virulentas são utilizadas no campo e
desenvolvem uma sólida imunidade contra a infecção do parasita. No
entanto não há uma aceitação universal do seu uso pelos criadores de
frango de corte, devido ao desempenho das aves nem sempre ser similar ao
observado nos grupos medicados profilaticamente (Danforth, 1998).
Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo produzir
proteínas recombinantes de E. tenella para uso como imunógeno e avaliar a
proteção contra a eliminação de oocistos em frangos de corte.
Material e métodos
O estudo está sendo realizado no Laboratório de Parasitologia e Doenças
Parasitárias e no Setor de Isolamento do Hospital Veterinário, vinculados ao
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva da Universidade Estadual
de Londrina - UEL, localizada no norte do estado do Paraná. A produção de
oocistos para obtenção de esporozoítos e para o desafio homólogo será a
partir de uma cepa virulenta de Eimeria tenella, obtida a campo. A
construção dos plasmídeos de expressão será realizada com os segmentos
de DNA, das proteínas 3-1E (EF069437) HSP70 (Z46965), ROPN2
(AM773998), TA4 (AJ586531) e SAG21 (AJ586546) obtidos pela técnica de
reação em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando oligonucleotídeos
iniciadores específicos para os genes confeccionados a partir de seqüências
conhecidas (Genbank). A clonagem dos genes será realizada no vetor
pET102/D-TOPO do Kit de clonagem pET102 ® Directiona TOPO ®
(Invitrogen, life Technologies).
As proteínas recombinantes serão expressas em Escherichia coli
BL21 em seguida serão purificadas por afinidade em coluna de resina de
níquel (Qiagen) por condições desnaturantes.
As etapas seguintes serão a caracterização das proteínas por gel de
poliacrilamida SDS- PAGE e western blotting. No teste in vivo será avaliado
o potencial das proteínas em estimular a imunidade protetora por meio de
parâmetros parasitológicos (produção de oocistos e escore de lesão),
parâmetros clínicos (ganho de peso, conversão alimentar e níveis de
carotenóides) e parâmetros imunológicos (teste imunoenzimático ELISA e
proliferação de linfócitos periféricos). Por fim, os dados serão submetidos a
testes estatísticos paramétricos e quando necessário não paramétrico, tendo
por base os valores de p<0,05 sendo considerados estatisticamente
significantes.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
Resultados e Discussão
Foi possível obter fragmentos do DNA através da reação em cadeia da
polimerase (PCR), quando utilizado os primers do gene TA4 conforme a
figura 1. Este produto da PCR tem 1107 pares de base e apresenta-se com
banda única.
Xu et al. (2004) e Wu et al. (2004) realizaram a produção de proteínas
recombinantes a partir do gene TA4 de E. tenella, obtendo resultados
significativos na redução das lesões cecais, da perda de peso e da
eliminação de oocistos, demonstrando seu potencial para uso como vacina
contra a coccidiose aviária.
Os outros genes terão seus primers redesenhados com a finalidade
de obtermos um produto da PCR de melhor qualidade. Uma vez confirmada
a identidade por sequenciamento dos genes obtidos, será realizada a
clonagem destes segmentos gênicos, expressão e caracterização das
proteínas.
Finalmente o projeto seguirá com o teste in vivo e avaliação dos
parâmetros citados no material e métodos.
Figura 1.- Gel de agarose 1,5% mostrando o resultado da PCR para o gene TA4, cujo
fragmento apresenta banda única com o número de pares de base previsto de 1107. O peso
molecular LOW encontra-se do lado esquerdo da foto.
Conclusão
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
A metodologia e os primers utilizados foram eficientes para amplificar em
quantidade a região correspondente ao gene TA4 da espécie Eimeria
tenella.
Referências
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experimental studies and field trials. Int. J. Parasitol., 1998, 28, 1099-1109
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Xu, Q.; Song , X.; Xu, L.; Yan, R.; Shah, MA.; Li.; X. Vaccination of chickens
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Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.