Exercício 3 PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
(Polymerase Chain Reaction - PCR)
Uma das dificuldades dos pesquisadores frente à análise baseada no DNA é a
escassez deste. Na medicina forense pode-se ter em mãos apenas uma gota de
sangue ou de saliva para testar; um evolucionista pode querer analisar um exemplar
de um museu sem destruí-lo. Mesmo que se tenha uma grande quantidade de tecido,
seria trabalhoso purificar o DNA em larga escala.
Em 1985, foi introduzida uma técnica revolucionária. Esta técnica permite gerar uma
grande quantidade de cópias de um fragmento de DNA específico. Ela foi inventada
por um cientista de indústria farmacêutica chamado Kary Mullis, que teve sua
inspiração inicial numa noite em 1983 quando ele estava dirigindo e pensando sobre
um problema técnico que ele estava enfrentando em seu trabalho.
A essência da idéia de Mullis é o seguinte: se você pudesse colocar em um tubo uma
reação na qual a DNA polimerase duplicasse uma única fita-molde de DNA em 2
moléculas, estas em 4, então em 8, 16, 32, etc, você teria um número virtualmente
infinito de cópias da molécula original. Cada ciclo da síntese de DNA dobraria o
número de moléculas iniciais: uma reação em cadeia produzindo fragmentos
específicos de DNA. A nova técnica de Mullis foi chamada de reação em cadeia da
polimerase (Polymerase Chain Reaction) ou PCR.
Naturalmente, Mullis fez mais do que apenas perceber que a DNA polimerase pode
copiar uma hélice de DNA em duas. Você também já sabia disto. O que ele fez foi
imaginar como realizar a reação in vitro e como utilizar esta reação para copiar um
segmento de DNA de interesse.
O método de Mullis se baseia nas características das enzimas DNA polimerases e no
processo de hibridação.
Lembre-se de que as DNA polimerases devem ter um
iniciador (primer) pareado a uma fita molde para sintetizar uma fita complementar e
também que a hibridação é um processo espontâneo no qual as bases formam pares
complementares. Você pode separar duas fitas de uma hélice pelo calor, mas se
resfriá-las, elas tornarão a se unir.
Mas como Mullis utilizou a DNA polimerase e a hibridação para realizar a reação em
cadeia de síntese do DNA? Siga a Figura 1 durante a explicação.
Primeiro você deve decidir qual segmento do DNA você deseja duplicar (os
pesquisadores dizem amplificar ao invés de duplicar porque eles estão fazendo muitas
cópias). Então você sintetiza duas moléculas de DNA de fitas simples curtas (20 a 28
nucleotídeos) e complementares às extremidades do segmento que você escolheu.
Estas duas moléculas pequenas devem ter características específicas. Observe o
início da figura 1 (ciclo 1). Estão esquematizadas uma fita dupla de DNA e duas
cópias de duas moléculas pequenas de DNA de fita simples.
Cada uma das
moléculas de fita simples é complementar a apenas uma fita do DNA parental e cada
uma é complementar apenas à porção final do segmento.
Além disso, se você
imaginar estas moléculas pequenas pareadas às regiões complementares respectivas
na fita-dupla, os seus finais 3' vão apontar um para o outro.
Estas moléculas
pequenas e de fita-simples são chamadas de iniciadores (primers).
Para realizar a PCR uma grande quantidade de iniciadores e de molécula-molde são
misturadas em um tubo contendo um tampão e muitos deoxinucleotídeos trifosfatados.
Esta mistura é aquecida até quase a ponto de ebulição e então as fitas das moléculasmolde desnaturam (se separam uma da outra).
Depois, esta mistura é resfriada. Eventualmente, as fitas da molécula parental de
DNA se reúnem, mas como há uma grande quantidade de iniciadores na mistura,
alguns deles encontram seus sítios complementares nas fitas-molde antes que estas
se reúnam (Hibridação do primer com a fita-molde na figura 1).
Agora a DNA polimerase é adicionada à reação.
Os iniciadores hibridados à
molécula-molde são os pré-requisitos para que a DNA polimerase inicie a síntese do
DNA. A DNA polimerase começa a adicionar os deoxinucletídeos no final 3' dos
iniciadores, formando uma nova fita complementar (Síntese do DNA na figura 1).
Após um curto espaço de tempo, a mistura é novamente aquecida. Agora, as duas
fitas-molde novas desnaturam, resultando em quatro fitas-simples (Desnaturação no
ciclo 2 da figura 1). A mistura é resfriada e os iniciadores se hibridam às moléculas de
fita simples (Hibridação, ciclo 2).
A DNA polimerase é adicionada à reação e os
deoxinucleotídeos são adicionados ao final 3' dos iniciadores hibridados, formando
quatro moléculas de fita-dupla (Síntese de DNA, ciclo 2). Note que duas das fitas
recém-sintetizadas começam e terminam nos sítios de hibridação dos iniciadores.
Este processo de desnaturação, hibridação e síntese de DNA se repete de 25 a 45
vezes, resultando em um grande número de moléculas.
A grande maioria das
moléculas recém-sintetizadas vai de um sítio de hibridação do iniciador ao outro.
Então, o pesquisador pode escolher qual segmento será amplificado através da
escolha dos iniciadores. Hoje a PCR é utilizada rotineiramente para muitos propósitos
diferentes: para amplificar um fragmento específico de DNA para clonagem, para gerar
um fingerprint de uma amostra muito pequena de DNA, para o diagnóstico de
doenças, etc.
Um aperfeiçoamento técnico do processo tornou a PCR muito mais fácil. Você notou
que a DNA polimerase foi adicionada antes de cada síntese de DNA? Isto porque as
primeiras PCR utilizavam a DNA polimerase da Escherichia coli, a qual é inativada sob
alta temperatura. Então, a enzima deveria ser acrescentada a cada ciclo de síntese.
Posteriormente, foram isoladas enzimas de microrganismos que vivem em águas
oceânicas profundas. Estas enzimas não são inativadas pelo calor e resistem às
temperaturas elevadas necessárias para a síntese do DNA. Hoje a PCR é realizada
com DNA polimerases resistentes ao calor, e então é adicionada apenas uma vez no
início da reação.
A DNA polimerase mais utilizada é a Taq DNA polimerase
(proveniente da bactéria Thermus aquaticus).
Quando a PCR foi desenvolvida, utilizava-se três banhos-Maria com as temperaturas
necessárias para desnaturação, hibridação e síntese do DNA.
Os pesquisadores
transferiam os tubos de um banho para outro. Posteriormente foi desenvolvida uma
máquina que altera rapidamente as temperaturas necessárias, chamada de
termociclador.
Hoje a PCR é realizada através da adição de DNA, iniciadores,
tampão, deoxinucleotídeos e DNA polimerase em um tubo e este é levado ao
termociclador, que pode ser programado com as temperaturas e o número de ciclos
necessários, e espera-se até que os ciclos tenham sido completados (cerca de 2 a 4
horas).
Porém, só se aprende a fazer PCR com a prática. E por isso você vai simular uma
PCR e um teste diagnóstico baseado em PCR no papel (você pode pintar o DNAmolde, os iniciadores e as moléculas recém-sintetizadas para facilitar a sua
compreensão).
Ciclo 1
Ciclo 2
Fita-dupla de DNA parental
Desnaturação
5’ CCCGG
AGCTT 3’
5’ GGGCC
TCGAA 3’
5’ CCCGG
CCCGG
5’
3’ GGGCC
CCCGG
3’
5’
AGCTT 3’
TCGAA
5’
Iniciadores
3’
de fita simples
TCGAA
3’
TCGAA
5’
3’
5’
5’
Desnaturação
5’ CCCGG
CCCGG
TCGAA 3’
5’ GGGCC
TCGAA 3’
AGCTT 3’
Hibridação
5’ CCCGG
5’ GGGCC
TCGAA 3’
5’
Hibridação
5’
5’ CCCGG
AGCTT 3’
TCGAA
5’
CCCGG
5’ GGGCC
AGCTT 3’
CCCGG
3’ GGGCC
TCGAA
5’
TCGAA
5’
TCGAA 3’
CCCGG
TCGAA
5’
5’
CCCGG
5’ GGGCC
5’
TCGAA 3’
TCGAA 3’
Síntese do DNA
5’ CCCGG
Síntese do DNA
5’ CCCGG
3’ GGGCC
AGCTT 3’
3’ GGGCC
5’
AGCTT 3’
TCGAA
TCGAA
TCGAA 3’
CCCGG
3’ GGGCC
TCGAA
CCCGG
3’ GGGCC
TCGAA 3’
TCGAA 5’
5’
5’
5’
CCCGG
5’ GGGCC
TCGAA 3’
TCGAA 3’
Figura 1. PCR
5’
5’
TCGAA 3’
TCGAA 3’
CCCGG
5’ GGGCC
etc
5’
Questões
1. O que um cientista deveria saber antes de desenvolver um teste de diagnóstico
baseado na PCR para o vírus X?
2. Como um cientista pode se assegurar de que os iniciadores que ele desenvolveu
vão hibridar apenas com o segmento de DNA que ele deseja amplificar?
3. Escreva uma expressão matemática que prediz o número de moléculas geradas a
partir de uma única fita-dupla de DNA após n ciclos de síntese.
4. Prediga o número de fitas de DNA produzidas que não são delimitadas pelos
iniciadores e que seriam geradas a partir de uma molécula de DNA de fita-dupla
após n ciclos de síntese.
5. Você poderia amplificar um DNA utilizando apenas um iniciador? Quais seriam os
produtos após um ciclo? Dois ciclos? Quatro ciclos?
Molécula de DNA parental e iniciadores para a PCR
5’
TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
3’
5’
TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
3’
5’
TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
3’
5’
TACGACCCGGTGTCAAAGTTAGCTTAGTCA
3’
5’
CCCGG
3’
5’
CCCGG
3’
5’
CCCGG
3’
5’
CCCGG
3’
Amostras de DNA e iniciadores para o diagnóstico baseado na PCR
3’
ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
5’
3’
ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
5’
3’
ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
5’
3’
ATGCTGGGCCACAGTTTCAATCGAATCAGT
5’
3’
TCGAA 5’
3’
TCGAA 5’
3’
TCGAA 5’
3’
TCGAA 5’