BIO10-329 Biofísica de Proteínas
Regente: Célia R. Carlini
Hemoglobinas normais e patológicas
Os assuntos abordados nessa aula são:
• Relações estrutura X função: comparação com a mioglobina
• Aspectos ontogenéticos e filogenéticos
• Hemoglobinopatias
Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações
As globinas constituem um bom exemplo para se compreender as relações
entre a estrutura e a função das proteínas.
A Hemoglobina é um hetero-tetrâmero formada por 2 tipos de globinas: a e b.
Max Perutz e John Kendrew resolveram a estrutura 3D da hemoglobina em 1959
Estrutura 3D do esqueleto covalente da mioglobina.
A mioglobina da baleia cachalote é uma proteína monomérica de 153 aminoácidos
composta por 7 segmentos de a-hélice, denominados de A a H. As porções da cadeia
polipeptídica entre segmentos de a-hélice são chamados cotovelos. As globinas
apresentam um bolsão (fenda) hidrofóbico no qual se aloja o grupo prostético heme.
O ambiente hidrofóbico em torno do heme é fundamental para a atividade
biológica das globinas, que depende de uma interação reversível com oxigênio.
Fe++
Fe++.O2
Comparação das seqüências de aminoácidos da mioglobina (Mb, 153 aa) e das
globinas a (Hba, 141 aa) e b (Hbb, 146 aa) da hemoglobina de cavalo.
As seqüências começam com o resíduo N-terminal NA1 (à esquerda, em cima), antes da hélice A,
composta por 16 aminoácidos. Segue a hélice B, também com 16 resíduos, e assim até a hélice H.
Os aminoácidos idênticos nas três proteínas estão marcados em cinza, e os que interagem com o heme
aparecem em rosa. Entre esses últimos estão a His E57 e a His F8 que ocupam a mesma posição
espacial nas 3 moléculas, apesar de terem posições diferentes nas seqüências correspondentes.
Observe que o grau de identidade da seqüência entre as três globinas é relativamente baixo, da
ordem de 20% (27 resíduos).
Comparação das estruturas 3D das globinas a e b da hemoglobina e mioglobina
globina a
globina b
mioglobina
hemoglobina
Observe a semelhança estrutural das 3 globinas, formadas por
7 segmentos de a-hélice que delimitam uma fenda, na qual se localiza o heme.
Considerando:
1) que a seqüencia de aminoácidos é o que determina a estrutura 3D de
uma proteína,
2) e o baixo grau de identidade das 3 sequëncias globínicas,
Como se explica o fato delas possuírem estrutura 3D tão semelhantes ?
Como visto na aula anterior, os radicais dos aminoácidos
não participam das ligações que estabilizam a a-hélice.
Assim, pode haver mudanças na seqüência primária de
uma proteína sem afetar a estrutura secundária, no caso
dessas ocorrerem numa região de a-hélice ou de folha b.
Como as globinas contêm grande proporção de a-hélices,
ao longo da evolução acumularam número significativo de
mutações pontuais sem alteração de sua forma 3D. .
O heme das globinas é responsável pela ligação ao oxigênio.
O heme, também presente nos citocromos, é sintetizado nas células aeróbicas
através de uma cadeia complexa de enzimas, a via das porfirinas. Na última etapa,
um átomo de ferro é introduzido na protoporfirina IX, originando o heme.
+ Fe2+
Heme sintase
Outros derivados porfirínicos não hemínicos importantes são a cobalamina ou
vitamina B12, que contem Co2+ ao invés de ferro, e clorofilas, que contém Mg2+
Nas globinas, o Fe2+ hemínico faz 6 ligações de coordenação: 4 ligações planares
com os nitrogênios dos anéis pirrólicos da protoporfirina, e 2 perpendiculares ao plano
do heme. A 5ª. ligação é permanentemente ocupada com um dos N imidazólico da
histidina F8 (proximal). A sexta coordenação pode ser ocupada pelo oxigênio, ou pela
histidina E7 (distal) nas globinas desoxigenadas.
Fe
No desenho ao lado, a globina a. Observar os
resíduos hidrofóbicos (em preto) que forram o
bolsão do heme nas globinas.
A estrutura tetramérica da hemoglobina confere à molécula maior
controle da afinidade por oxigênio
A Mioglobina, composta por uma cadeia polipeptídica,
é uma proteína armazenadora de oxigênio presente
no tecido muscular de mamíferos.
1 heme = 1 O2
apresenta alta afinidade por O2
A Hemoglobina, composta por quatro cadeias
polipeptídicas (dois dímeros ab), é uma proteína
transportadora de oxigênio.
apresenta afinidade variável por O2
A curva de saturação com O2 mostra diferenças importantes na afinidade
da hemoglobina e da mioglobina pelo oxigênio.
A curva de saturação descreve a percentagem de moléculas carregando O2 (eixo y) à medida que se aumenta
a pressão parcial do gás (pO2, eixo x).
• A Mioglobina (Mb) tem a curva hiperbólica,
e atinge 50% de saturação (p50) com uma pO2
de ~1 torr.
• A Hemoglobina (Hb) tem a curva sigmóide,
indicando alosteria ou cooperativadade entre
suas subunidades. Sua pO2 é de ~ 26 torr e
sua afinidade pelo O2 varia com o grau de
saturação da molécula.
Observe os valores da pO2 venosa (nos
tecidos) e arterial (nos pulmões).
A diferença de afinidade por O2 faz com
que nos tecidos, a Mb fique 100% saturada,
enquanto que a saturação da Hb diminui a
~55%, liberando de 1 a 2 moléculas de O2.
Essa diferença de comportamento
está de acordo com a função de
armazenamento de O2 da Mb e de
transporte de O2 pela Hb.
Por que a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio é 26 vezes menor do
que a da mioglobina, se as proteínas possuem as estruturas 3D de suas
cadeias globínicas (ambiente onde está o complexo heme-Fe2+ ~ O2) tão
semelhantes ?
Quais são os mecanismos que fazem a afinidade da hemoglobina variar
conforme o grau de saturação em O2 ? Por que isso não ocorre com a
miglobina ?
A hemoglobina passa por várias alterações conformacionais na transição do
estado desoxigenado para oxigenado.
O2
No estado oxigenado, a cavidade
central do tetrâmero diminue.
Vários “loops” se movem.
Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do
estado oxigenado para desoxigenado
Observar os movimentos da cadeia b
em relação ao Heme. A histidina 92 é a
F8 proximal.
Observar a expansão da cavidade
central do tetrâmero e as mudanças
nos contactos entre as subunidades
Alterações conformacionais da hemoglobina A durante a transição do
estado oxigenado para desoxigenado
O estado de oxigenação afeta propriedades físicas da Hemoglobina como a interação
com a luz visível.
A hemoglobina desoxigenada interage mais com a luz azul (absorção no comprimento de
onda de 600-650 nm), dando ao sangue venoso uma cor acastanhada (não é sangue sujo !),
quando comparado ao sangue arterial.
As alterações conformacionais que ocorrem nas cadeias globínicas da
hemoglobina na transição oxigenação-desoxigenação são transmitidas de
uma cadeia a outra, através de contactos nas interfaces das subunidades.
Esse fenômeno é a base molecular da cooperatividade, uma forma de
alosteria característica de proteínas oligoméricas. Por ser monomérica, a
mioglobina não tem essa propriedade.
A cooperatividade na hemoglobina é positiva. Isso significa que quando
uma cadeia passa do estado oxigenado para o desoxigenado, as alterações
conformacionais que essa molécula sofre são “sentidas” pelas cadeias
vizinhas. Essas, por sua vez, respondem com uma diminuição de sua
afinidade pelo oxigênio, facilitando a desoxigenação da hemoglobina.
O mesmo tipo de fenômeno ocorre na oxigenação da molécula, que
também acontece de forma positivamente cooperativa.
A cooperatividade na transição oxigenação-desoxigenação da hemoglobina
é a causa de sua curva de saturação ter aspecto sigmóide, e uma das
razões da afinidade variável da hemoglobina pelo oxigênio.
Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio.
O efeito Bohr é um dos mais importantes em termos fisiológicos.
O efeito Bohr é a modulação da
afinidade da Hb por O2 pelo pH
do meio, facilitando a desoxigenação da Hb a nível tecidual.
O sangue venoso é mais ácido
do que o arterial, pela presença
de CO2 vindo dos tecidos. Esse
forma ácido carbônico H2CO3,
que se dissocia liberando H+
para o meio.
A curva ao lado mostra como a
% de saturação da Hb, em uma
pO2 próxima aos valores nos
tecidos (20 torr), diminue em
função do pH do meio.
Para a mesma pO2, a saturação da Hb diminue
de 45% em pH 7,6 para 22% em pH 7,2.
Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e
suas propriedades de tampão.
TECIDOS
PLASMA
CO2
Nos tecidos, a pO2 é de 25 a
40 torr e o pH ligeiramente
mais ácido (7,2-7,3). O CO2
produzido difunde-se para o
plasma e para as hemácias.
2.
Nas hemácias, o CO2 é
convertido a H2CO3 pela
enzima anidrase carbônica.
3.
O H2CO3 se dissocia no íon
bicarbonato HCO3- e um
próton H+. Parte do HCO3(~60%) difunde para o
plasma, onde constitue o
principal sistema tampão.
4.
Uma parte pequena (~8%)
do CO2 liga-se diretamente
ao resíduo N-terminal de
cada globina, formando a
carbamino-Hb.
HEMÁCIAS
DIFUSÃO
CO2
(1)
(2) Anidrase
carbônica
O HCO3transportado no
plasma
representa 60%
do CO2 formado
nos tecidos
1.
HCO3-
Cl
(3)
+H2O
H2CO3
HCO3-
+ H+
Cl
(4)
NH3+
Hb
pO2 – 25 a 40 torr
NHCOO-
Hb
Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e
suas propriedades de tampão.
TECIDOS
PLASMA
CO2
CO2
Anidrase
carbônica
O2
6.
Ao receber o próton, a HbO2
sofre o efeito Bohr, que
resulta em uma diminuição
da afinidade pelo o O2,
facilitando a desoxigenação.
7.
Concordando com o efeito
Bohr, a Hb oxigenada é mais
ácida (pK ~7.4) do que a Hb
desoxigenada (pK ~7.6 ).
+H2O
H2CO3
HCO3-
Cl
DIFUSÃO
HCO3-
+ H+
Cl
FeO
(6)
2
(6)
H
C
Fe2+
H
C
(5)
N
NH
(5)
HC
C
NH3+
Hb
pO2 – 25 a 40 torr
O próton H+ gerado da
dissociação do H2CO3 é
tamponado por histidinas
que ligam o heme.
HEMÁCIAS
DIFUSÃO
O HCO3transportado no
plasma
representa 60%
do CO2 formado
nos tecidos
5.
N
HC
NHCOO-
Hb
N
NH2
C
Para entender o efeito Bohr , vamos ver como se dão as trocas de gases na Hb, e
suas propriedades de tampão.
ALVÉOLOS
PLASMA
CO2
CO2
HCO3-
(10)
HCO3-
Cl
+ H+
Cl
(9)
Fe2+
H
C
HC
NH2
NH
NHCOO-
C
Hb
(11)
10. Esses fatores fazem a anidrase
carbônica catalizar a reação
reversa, formando CO2 e H2O a
partir de H2CO3, resultante da
associação bicarbonato e H+.
11. O CO2 ligado à
FeO2
Hb é liberado.
H
C
N
pO2 – 100 torr
A Hb desoxigenada recebe O2 e
libera os prótons H+ recebidos no
tecido. O efeito Bohr agora resulta
em um aumento da afinidade pelo
o O2, facilitando a oxigenação.
(10)
H2CO3
DIFUSÃO
9.
+ H2O
Anidrase
carbônica
(12)
O2
No pulmão, a pO2 é de 100 torr e
o pH é mais alcalino (pH ~7.6).
HEMÁCIAS
DIFUSÃO
O HCO3transportado no
plasma
representa 60%
do CO2 formado
nos tecidos
8.
N
HC
NH3+
Hb
NH
C
12. O CO2 difunde
para o plasma
e daí para os
alvéolos.
Vários mecanismos regulam a afinidade da hemoglobina pelo oxigênio.
O 2,3-difosfoglicerato é um regulador alostérico negativo da hemoglobina.
O 2,3-bifosfoglicerato (2,3 BPG) é um
produto exclusivo do metabolismo das
hemácias, formado a partir de um dos
intermediário da via glicolítica, por uma
enzima mutase específica.
Glicose
1,3 bifosfoglicerato
2,3-BPG
Mutase
(só em hemácias)
piruvato
Via glicolítica nas hemácias
O 2,3 BPG liga-se na cavidade central do tetrâmero
da hemoglobina, estabilizado por interações
eletrostáticas com resíduos de carga positiva.
A ligação de uma molécula de 2,3 BPG à
hemoglobina reduz a sua afinidade por O2,
facilitando a desoxigenação.
Na oxihemoglobina, a cavidade central é menor, expulsando o 2,3-DPG e
aumentando a afinidade da molécula por O2.
A mudança conformacional que ocorre na primeira desoxigenação torna essa
cavidade maior na desoxi-hemoglobina, possibilitando a ligação do 2,3-DPG.
A concentração plasmática de 2,3-DPG é
constante, ~5 mM.
Populações que habitam regiões de
elevada altitude, onde a atmosfera é
rarefeita, apresentam como mecanismo
compensatório um aumento nos níveis da
enzima mutase que forma o 2,3 BPG.
Com concentrações plasmáticas mais
elevadas de 2,3-BPG, e uma consequente
diminuição da afinidade da Hb por O2, não
há prejuizo da oxigenação dos tecidos,
apesar da pO2 atmosférica mais baixa
eventualmente não ser suficiente para
saturar 100% a Hb.
A regulação da afinidade da hemoglobina pelo O2 é um somatório do
efeito Bohr e do 2,3 –bifosfoglicerato, além da cooperatividade positiva.
A figura ilustra a somatória de efeitos
moduladores negativos do 2,3 BPG e
do CO2 (efeito Bohr) sobre a afinidade
da hemoglobina para o oxigênio.
50%
Observe como a P50 (pressão parcial
de O2 que satura 50% das moléculas)
aumenta progressivamente a medida
que os moduladores são adicionados
ao meio.
O efeito Bohr (presença de CO2) e o
2,3-BPG, juntos, diminuem em cerca de
2,6 vezes a afinidade da Hb pelo O2.
Stripped Hb – Hb sem nenhum
modulador
Whole blood – Hb em sangue total,
com todos seus moduladores
Evolução das globinas
heme
mioglobina
hemoglobina
Na evolução das globinas, houve um evento de duplicação gênica, e depois,
divergência de cada um dos genes através de mutações pontuais, que acabaram
originando as duas cadeias globínicas da atual hemoglobina.
Ontogenia das hemoglobinas humanas
A hemoglobina A (HbA), composta
das cadeias a e b, corresponde a
96-98 % da hemoglobina total de um
adulto.
Um variante normal da hemoglobina
A, correspondente a 2-3% da
hemoglobina total em adultos, é a
HbA2, formada por cadeias a e d
(delta), ou seja, a2d2.
No adulto, a Hemoglobina A resulta
da expressão co-dominante de 2
genes que codificam a cadeia b e de
4 genes que codificam a cadeia a.
Existem 17 genes para globinas no
genoma humano.
Durante a vida embrionária e fetal,
diferentes genes para as globinas
são expressos sucessivamente.
Ontogenia das hemoglobinas humanas: 17 genes codificando cadeias globínicas
Hb embrionárias
Hb Portland
z2e2
a2e2
z2g2
Hb Fetal
a2g2
Hb adulto
a2b2
a2d2
Hb Gower 1
Hb Gower 2
idade gestacional
(semanas)
idade pós-natal
(semanas)
O gráfico e a tabela mostram a sucessão de diferentes hemoglobinas e a sua composição em
cadeias globínicas presentes no embrião, feto (após a 12a. semana) e no adulto.
Após o nascimento, com a repressão da síntese da cadeia g e aumento da síntese da cadeia b,
ocorre a troca da HbF pela HbA, que se completa entre o 3o e 4o mês de vida. Nessa fase são
muito importantes os “banhos de luz” dados na criança, pois estes auxiliam na degradação de
derivados tóxicos do heme, formados na destruição das hemácias fetais.
A Hemoglobina Fetal (HbF)
• A HbF possue cadeias g (gama)
equivalentes à cadeia b da HbA, com
10 aminoácidos diferentes nas
sequências primárias dessas globinas.
• Uma das substituições importantes
na HbF é a posição 82 da cadeia g, que
possui um resíduo de serina (polar sem
carga), diferentemente da cadeia b, que
tem lisina (Lys82; com carga positiva)
nessa posição.
•
Essa substituíção resulta numa
ligação mais fraca do 2,3-DPG, que
interage com as globinas por interações
eletrostáticas, à HbF.
•
Como resultado, a HbF apresenta
maior afinidade por O2 do que a HbA
materna, possibilitando a captação de
O2 a nível da barreira placentária.
Ligação do 2,3-BPG com a hemoglobina A
Hemoglobinopatias
•
Hemoglobinopatias podem resultar de
mutações nos genes estruturais das globinas,
ou ainda nos genes reguladores da síntese das
diferentes globinas, que é o caso das
talassemias.
42
92 93
145
63
143
23
6
73
76
79
121
• Mutações pontuais nos genes das globinas
a e b são relativamente frequentes. Em outubro
de 2003 já eram conhecidos mais de 900 tipos
de hemoglobinas anômalas contendo a troca de
1 aminoácido na cadeia a ou na cadeia b.
• Mutações duplas, inserções e deleções são
casos mais raros.
• Como existem 4 alelos de cadeia a e 2 de
cadeia b expressos co-dominantemente, são
conhecidos mais mutantes de cadeia b
(produzem 50 % de Hb anômala) do que de
cadeia a (produção de 25 % de Hb anômala).
A figura acima ilustra posições na sequência primária de cadeias a ou b para as quais são
conhecidos mutantes pontuais de Hb com alterações na estabilidade e/ou solubilidade da
proteína ou na afinidade por oxigênio, que resultam em patologias.
Observe que a grande maioria dessas posições estão em “cotovelos” da molécula, onde
as a-hélices não existem. Mutantes das histidinas proximal e distal (posições 92 e 63 na
cadeia b, respectivamente), podem resultar em incapacidade de ligar O2.
A tabela mostra exemplos de hemoglobinas anormais que são mutantes pontuais.
Hemoglobina*
Anormal
Resíduo Normal
e Posição
Substituição
Cadeia Alfa (4 alelos)
Torino
MBoston
Chesapeake
GGeorgia
Tarrant
Suresnes
Fenilanina 43
Histidina 58
Arginina 92
Prolina 9
Aspartato 126
Arginina 141
Valina
Tirosina
Leucina
Leucina
Asparagina
Histidina
Cadeia Beta (2 alelos)
S
Riverdale-Bronx
Genova
Zurich
MMilwaukee
MHyde Park
Yoshizuka
Hiroshima
Glutamato 6
Glicina 24
Leucina
Histidina 63
Valina 67
Histidina 92
Asparagina 108
Histidina 146
Valina
Arginina
Prolina
Arginina
Glutamato
Tirosina
Aspartato
Aspartato
* Variantes da hemoglobina normalmente recebem o nome do local
geográfico de origem
Hemoglobinas M apresentam
substituições nas histidinas
proximal ou distal, ou resíduos
hidrofóbicos do bolsão do heme.
Como resultado, nas HbM
ocorre a oxidação do Fe2+a Fe3+,
tornando-as incapaz de ligar O2.
Metahemoglobina é uma HbA
normal oxidada a Fe3+, situação
que pode ser causada por
fumaça de cigarro, cianetos, etc.
Não confundir metahemoglobina
com HbM.
Hemoglobina S ou falciforme
apresenta uma troca de uma
resíduo ácido por um apolar,
causando alterações na
solubilidade da proteína, que
passa a ter tendência de
polimerizar. Não há alterações
na afinidade pelo O2.
Algumas variantes de hemoglobina com importância clínica
Hemoglobina
Origem
geográfica
Substituição de
Aminoácido
% presente
em
heterozigotos
* Existem outros variantes de HbG de cadeia a. A HbG Philadelphia é um variante de
cadeia a que frequentemente traz deleção dos alelos não afetados. Quando não ocorre
deleção, existe ~20% de HbG, com deleção de 1 alelo, ~30% de HbG, e com deleção de 2
alelos, ~40% HbG.
*** HbD Punjab apresenta o mesmo tipo de mutação.
#
Não é uma mutação pontual e sim um porduto de crossover durante a meiose.
Anemia falciforme e hemoglobina S (HbS)
A HbS apresenta um resíduo de valina na posição
6 da cadeia b, no lugar do ácido glutâmico
presente na HbA.
Hemácia falcêmica
Essa troca resulta em alteração da solubilidade da
HbS, que apresenta tendência de polimerizar
quando desoxigenada, formando fibras que se
depositam dentro da hemácia, deformando-a.
Deformadas, essas hemácias são retiradas de
circulação, causando o quadro anêmico.
A figura ao lado é uma micrografia de uma fibras
de HbS, que se organizam por polimerização de
muitas moléculas, conforme o esquema abaixo.
Fibra de HbS
6
Hemoglobina S: a valina na posição 6 da cadeia b da HbS faz interação hidrofóbica com
resíduos Phe 85 e Leu 88 da cadeia b de outra molécula de HbS, determinando
polimerização da HbS desoxigenada.
A polimerização reverte quando a HbS fica 100% saturada. Não há alteração
da afinidade por O2, ou seja, o efeito Bohr, a ligação do 2,3-BPG e a cooperatividade
não são afetados.
A Hemoglobina Porto Alegre
• Origem geográfica: região de São Leopoldo, RS, Brasil
• mutação pontual com substituição de Ser por Cys na
posicão 9 da cadeia b na região helicoidal A6
• por conter uma cisteína a mais, a HbPorto Alegre
apresenta tendência de polimerizar, fazendo tetrâmeros
via pontes –S-S• a polimerização é baixa in vivo, mas intensa em
hemácias armazenadas (diminuição do poder redutor)
Tetrâmero de HbPA
• veja artigo e texto complementar para mais informações.
Microscopia eletrônica de tetrâmeros de HbPa