Objectivo: Separar uma proteína das restantes no extracto celular
Estratégia: Existem inúmeras técnicas de purificação disponíveis. O
procedimento exacto e a ordem dos métodos a aplicar dependem do tipo de proteína
e empregam-se de acordo com as características da mesma
No Início de uma Purificação...
Temos células animais, de plantas, ou microbianas
Torna-se necessário:
-Partir as Células: Fraccionamento Celular
-Separar o Extracto: Centrifugação
-Obter a Fracção Solúvel (onde se encontram as proteínas)
Dependendo do tipo de tecido ou célula temos :
Métodos /
Técnicas
aplicadas
Suaves
Químicos
Detergentes
Culturas de
células
Bioquímicos
Lise enzimática
Tecidos Vegetais
Cél. bacterianas
Fungos
Físicos /
Mecânicos
1 - Choque osmótico
2 - Arrefecimento /
Aquecimento
3 - Potter - Elvjehem
Exemplos
1 - Lise de células
sanguíneas e culturas
de células
3 - Fígado
Moderados
Homogeneização
por lâminas
Células e tecidos
animais e vegetais
Vigorosos
1 - French - Press
2 - Ultra-sons
3 - Moinho de
esferas
4 - Homogeneizador
de Manton-Gaulin
Suspensões
celulares e
microorganismos
com parede celular
Exemplos
Alguns exemplos de técnicas de desintegração:
Centrifugação Diferencial :
Centrifugação do material a separar a velocidades
crescentes.
1ª-fracção: Nuclear
2ª- fracção: Mitocondrial
3ª- fracção: Microssomal / Sobrenadante
Citosólica
Centrifugação em
• Isopicníca Gradiente de Densidade :
gradiente de densidade abrange as densidades
das partículas a separar. Amostra adicionada a
gradiente formado ou a formar.
(meio suporte em gradiente
de densidade)
• Por Zonas de Velocidade -
Centrifugação de Fluxo Contínuo :
gradiente de densidade
menos denso que partícula
menos densa. Amostra
adicionada no topo de
gradiente formado.
mistura de partículas introduzida continuamente no rotor
em movimento. Partículas sólidas depositam-se na
parede do rotor e líquido livre de resíduos abandona o
rotor.
Separação pelo Tamanho: Diálise
usada para remover o excesso de sal
ou mudar o tampão de uma proteína.
Moléculas grandes
não atravessam a
membrana
Moléculas pequenas
atravessam
membrana
Membrana semipermeável
Atenção.
Não separa proteínas !
Princípio da Cromatografia: Separação de moléculas baseada
nas suas mobilidades relativas através de uma matriz.
diferentes interacções com a matriz.
Interacções com base em propriedades físico/químicas das proteínas
Tamanho –Filtração em Gel
Carga –Troca Iónica
Hidrofobicidade –Interacção Hidrofóbica
Especificidade para uma biomolécula –Cromatografia de Afinidade
Separação pelo Tamanho: Filtração em Gel
Esferas da resina com poros
nas
quais
partículas
pequenas podem entrar e as
grandes não podem entrar.
Proteínas eluídas por ordem
decrescente de tamanho
A coluna
deverá
possuir a
distância
necessária
para uma
boa
separação…
Separação pela Carga: Cromatografia de Troca Iónica
Questões a Colocar antes da Separação por Carga
Qual é o Ponto Isoeléctrico da Proteína ?
Qual é o pH do Tampão ?
• pH
> pI proteína carregada negativamente Proteína Desprotonada
• pH
< pI proteína carregada positivamente
Proteína Protonada
A Matriz da Coluna (resina)
é um polímero contendo grupos ligados carregados
Se se pretende “agarrar” uma proteína a uma resina
de troca iónica, esta deve possuir sinal contrário à
carga global da proteína alvo mas grupos ligados contra-iões- do mesmo sinal
Separação pela Carga: Cromatografia de Troca Iónica
Troca Catiónica
resinas apresentam cargas negativas e ligam proteínas com carga global
positiva.
Troca Aniónica
resinas apresentam cargas positivas e ligam proteínas com carga global
negativa.
Proteínas eluídas da coluna de troca iónica por por alteração da
afinidade por:
1 – Aumento da Força Iónica (= aumento da concentração de iões de um
sal) Ex: iões Na+ competem com os grupos da proteína carregados
positivamente para a ligação na resina
2 – Alterando o pH (provoca a variação da carga global da proteína)
Separação pela Carga: Cromatografia de Troca Iónica
Proteínas baixa afinidade para a
resina movem-se rapidamente,
através da coluna.
Proteínas elevada afinidade para a
resina
eluídas lavando a coluna
com um tampão de maior força
iónica ou com um pH ≠.
Separação por Afinidade: Cromatografia de Afinidade
Não tem em conta propriedades físicas ou químicas
especificidade biológica
Permite num só passo purificar uma proteína/enzima
de uma mistura complexa.
Princípio da Separação:
Ligando imobilizado na
matriz/resina ao qual se liga a
proteína de que o ligando é
substrato.
Ligando
Braço
espaçador
Matrix
Princípio da Electroforese: Estudo do movimento de partículas
carregadas sob acção de um campo eléctrico
Partícula migra na direcção do eléctrodo de carga oposta
Migração depende: Carga, Tamanho e forma
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE)
• Condições nativas: Proteína pura?
• Condições desnaturantes: MM? sub-unidades?
separação só pelo tamanho (razão carga/massa cte) devido ao SDS
atribui carga global negativa constante
Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE)
Padrões
Amostra
mobilidade moléculas
pequenas > moléculas
grandes
Cálculo da massa
molecular
Focagem Isoeléctrica ou Isoelectrofocagem
Mobilidade de compostos em função do pH
Carga da proteína depende : Ponto isoeléctrico (pI), pH meio
Abaixo pI – Carga +move-se para Cátodo (-)
pH meio
Igual pI – Carga global Zero
Acima pI – Carga - move-se para Ânodo (+)
•Separa proteínas ≠ e determina pI numa só
“corrida”
•Gradiente de pH : anfólitos