Expressão, purificação e cristalização da
endo- e exo-α
α-1,5-L-arabinanases obtidas
de uma biblioteca metagenômica
Bolsista
Maria da Conceição M. F. da Costa
Estudante de Biomedicina da Universidade
Federal de Pernambuco
Orientador
Prof. Dr Mário Tyago Murakami
Dra Camila Ramos dos Santos
LNBio
2
Expressão, purificação e cristalização da
endo- e exo-α
α-1,5-L-arabinanases obtidas
de uma biblioteca metagenômica
Bolsista
Maria da Conceição M. F. da Costa
Estudante de Biomedicina da Universidade
Federal de Pernambuco
Orientador
Prof. Dr Mário Tyago Murakami
Dra Camila Ramos dos Santos
LNBio
2011
3
“Sabemos que todas as coisas cooperam para o bem daquele que amam a Deus,
daqueles que são chamados segundo seu propósito.”
Romanos 8:28.
4
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus, o autor e consumador da minha fé, que
me conduziu até aqui. Sem Ele eu nada sou e nada posso fazer.
Aos meus queridos pais, que me ajudaram, incentivaram e lutaram
comigo pra chegar até aqui.
Aos meus amigos, todos que me apoiaram e estiveram comigo, ainda que
de longe se fizeram perto.
Agradeço a todos do grupo BBE que me deram o apoio, bancada e que
tiraram dúvidas durante todo o “bolsas de verão”.
Aos meus orientadores Dr. Mario Murakami e Dra. Camila Santos, os quais
me ensinaram muito, e me permitiram vivenciar toda a experiência do “bolsas de
verão” com muita intensidade.
Agradeço também a todos que organizaram o programa e tiveram a visão
de proporcionar a difusão de conhecimento e experiências, não apenas entre
diversas partes do país, mas por vários países da América latina.
Quero agradecer aos bolsistas pelo apoio mútuo, compreensão e paciência
por todo o período que longe de casa estivemos.
5
Resumo
A busca por fontes alternativas de energia tem estimulado de maneira
significativa o mercado mundial de biocombustíveis. Sabe-se hoje que resíduos
gerados na produção de etanol, como a palha e o bagaço de cana, são ricos em
polissacarídeos que podem ser utilizados na produção do chamado etanol de
segunda geração. Para utilização da celulose, a fonte de açúcar fermentável, é
necessária a sua a adequada liberação, a qual pode ser efetuada através de
métodos físicos, físico-químicos e químicos. Métodos biológicos, que utilizam
enzimas para hidrólise da parede celular vegetal, vêm sendo estudados. Nesse
caso, se faz necessária uma gama de enzimas, devido à variedade de
polissacarídeos que compõem a parece celular. Entre elas, estão as arabinanases,
que clivam ligações α-1,5 entre resíduos de L-furanosil presentes nas pectinas.
Neste trabalho escolhemos como objeto de estudo uma endo e uma exoarabinanase obtidas através de metagenômica de microbiota de rúmen de vaca.
A endo-α-1,5-L-arabinanase (ARN2) degrada o esqueleto de L-arabinofuranosil
de arabinanas de modo aleatório, resultando em arabino-oligossacarídeos,
enquanto a exo-α-1,5-L-arabinanase (ARN3) cliva regiões terminais das
arabinanas, liberando sempre resíduos de arabinose. A ARN3 apresenta somente
um domínio, que se enovela em um β-propeller, ao passo que a ARN2 apresenta
dois domínios, um em b-propeller e um em barril β, conforme predito por
modelagem por homologia. O objetivo principal desse trabalho é a cristalização
das
proteínas
escolhidas
visando
à
determinação
da
sua
estrutura
tridimensional. Esses resultados com certeza contribuirão para o conhecimento
sobre arabinanases, enzimas que são de grande interesse biotecnológico, porém
com poucos estudos na área estrutural. Além disso, nosso trabalho pode
impulsionar a bioprospecção no Brasil, pois embora existam projetos de
metagenômica no país, até o momento nenhuma estrutura de proteína oriunda
desta abordagem foi determinada. As proteínas foram expressas em fusão com
tiorredoxina no N-terminal e com uma cauda de 6 resíduos de histidina no Cterminal, em Escherichia coli. Elas foram purificadas por cromatografia de
afinidade e exclusão molecular. Espalhamento dinâmico de luz indicou amostras
monodispersas e monoméricas. As proteínas foram cristalizadas pelo método de
6
difusão de vapor usando gota sentada. Após refinamento das condições iniciais,
foram obtidos cristais adequados aos experimentos de difração de raios X. Os
dados coletados permitiram a determinação da estrutura usando o método de
substituição molecular para solução do problema das fases.
7
Sumário
Agradecimentos ................................................................................................................................ 4
Resumo ................................................................................................................................................ 5
1. Introdução...................................................................................................................................... 9
Biocombustíveis de Segunda Geração................................................................................. 9
Parede Celular de Vegetais ................................................................................................... 10
Degradação da matéria lignocelulósica ........................................................................... 12
Arabinanases ............................................................................................................................. 13
Metagenômica ........................................................................................................................... 14
Endo-α-1,5-L-arabinanase (ARN2) ................................................................................... 14
Exo-α-1,5-L-arabinanase (ARN3) ...................................................................................... 16
2. Objetivo ........................................................................................................................................ 17
3. Materiais e métodos ................................................................................................................ 18
3.1 Transformação de Cepas de Escherichia coli.......................................................... 18
3.2 Mini preparações plasmidiais ...................................................................................... 18
3.3 Expressão protéica ........................................................................................................... 19
3.3.1 Indução ......................................................................................................................... 19
3.3.2 Cultura permanente ................................................................................................ 20
3.3.3 Eletroforese de proteínas ...................................................................................... 20
3.4.1 Cromatografia de afinidade .................................................................................. 21
3.4.2 Teste de proteólise limitada das proteínas recombinantes ..................... 22
3.4.3 Cromatografia de Exclusão molecular.............................................................. 22
3.5 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) ..................................................................... 23
3.6 Concentração de amostras ............................................................................................ 23
3.6.1 Medidas de concentração de proteína ............................................................. 23
3.7 Ensaios de Cristalização ................................................................................................. 24
3.8 Coleta e processamento dos dados de difração .................................................... 25
3.9 Determinação da estrutura tridimensional ............................................................ 25
4. Resultado e discussão............................................................................................................. 26
4.1 Extração plasmidial.......................................................................................................... 26
4.2 Expressão Protéica ........................................................................................................... 26
4.3 ARN2 ...................................................................................................................................... 27
4.3.1 Cromatografia de afinidade .................................................................................. 27
4.3.2 Proteólise limitada ................................................................................................... 29
4.3.3 Cromatografia de exclusão molecular .............................................................. 29
4.3.4 Espalhamento dinâmico de luz (DLS) .............................................................. 31
8
4.3.5 Ensaios de Cristalização......................................................................................... 32
4.3.6 Coleta e processamento de dados ...................................................................... 34
4.3.7 Determinação da estrutura cristalográfica..................................................... 35
4.4 ARN3 ...................................................................................................................................... 37
4.4.1 Cromatografia de afinidade .................................................................................. 38
4.4.2 Cromatografia de exclusão molecular .............................................................. 40
4.4.3 Espalhamento Dinâmico da Luz (DLS) ............................................................. 41
4.4.4 Ensaios de Cristalização......................................................................................... 41
5. Conclusão .................................................................................................................................... 42
6. Referências ................................................................................................................................. 43
9
1. Introdução
Biocombustíveis de Segunda Geração
Desde 1751 aproximadamente 337 bilhões de toneladas de carbono foram
liberadas na atmosfera a partir do consumo de combustíveis fósseis e produção
de cimento. Metade dessas emissões ocorreu desde meados dos anos 70. Dentro
deste cenário, a busca por uma fonte renovável de combustível tem
impulsionado o mercado mundial de combustíveis (Boden, 2010).
Os biocombustíveis constituem uma excelente alternativa ao petróleo.
Contudo, até meados dos anos 70 sua produção para fins energéticos era
irrisória. O panorama mundial mudou em 1975 com o programa de incentivo
brasileiro – Proalcóol (Programa nacional do álcool) – o qual impulsionou a
indústria dos biocombustíveis. Entretanto, os combustíveis renováveis, em
especial os advindos de cereais, podem gerar um conflito com a agroindústria
pela terra (Rosa, 2010). É, portanto, de fundamental importância a total
utilização dos insumos gerados pela produção de álcool, a fim de produzir cada
vez mais biocombustível sem a necessidade da expansão do cultivo.
A produção do etanol de primeira geração consiste na fermentação do caldo
de cana-de-açúcar por leveduras. Esses microorganismos hidrolisam as
moléculas de sacarose em glicose e frutose e utilizam a glicose em seu processo
de respiração anaeróbica, produzindo etanol. O etanol de segunda geração utiliza
como matéria-prima os resíduos gerados na produção do etanol de primeira
geração, como palha e bagaço da cana-de-açúcar. Atualmente, esses resíduos têm
sido usados na geração de energia elétrica e para cobertura do solo, a fim de
evitar a erosão e repor nutrientes (Martins-Filho, 2009; Goldemberg, 2007).
10
Parede Celular de Vegetais
A parede celular vegetal é bastante complexa (Fig. 1), sendo rica em alguns
tipos de polímeros – celulose, hemicelulose, pectina e lignina, os quais estão
ligados através de ligações químicas covalentes e não-covalentes – formando
uma matriz altamente recalcitrante bastante importante na proteção do vegetal
contra agentes externos (Pérez, 2002).
Figura
1
–
Parede
celular
secundária
de
vegetais.
(Fonte:
http://www.ccrc.uga.edu/~mao/intro/ouline.htm)
A celulose é um polímero linear de resíduos D-glicose, ligados entre si
através de ligações glicosídicas do tipo β-1,4. As moléculas de celulose se
agrupam em microfibrilas através de ligações de hidrogênio e força de van der
Waals. Essas microfibrilas podem se apresentar na forma cristalina ou na forma
11
amorfa, sendo que a segunda é mais suscetível à degradação enzimática. Entre as
microfibrilas de celulose estão a hemicelulose e lignina.
A hemicelulose é um polímero complexo de polissacarídeos, com peso
molecular mais baixo que a celulose. Consiste de D-xylose, D-mannose, Dgalactose, D-glucose, L-arabinose, 4-O-methyl-glucuronico, D-galacturonico e
ácido D-glucuronico, ligados através de ligações do tipo β-1,4 e ocasionalmente
β-1,3.
A lignina, juntamente com a celulose, é o polímero mais abundante na
natureza. Estruturalmente é um heteropolímero amorfo, não solúvel em água e
opticamente inativo. Consiste de unidades de fenilpropano unidas por diferentes
tipos de ligação (Pérez, 2002).
Figura 2 – Componentes da parede celular vegetal. (a) celulose, (b) hemicelulose e (c)
lignina. (Fonte: http://www.ceres.net/AboutUs/AboutUs-Biofuels-Carbo.html)
As pectinas ou substâncias pécticas são um dos componentes majoritários
da parede celular primária e presente em menor quantidade nas paredes
secundárias. São constituídas por um complexo polissacarídico heterogêneo e
ramificado, o qual possui regiões planas de homogalacturanos e regiões
ramificadas
de
xilogaracturanos
e
ramnogalacturanos
(Fig.
3),
cujos
componentes são cadeias de açúcares neutros como arabinanas, galactanas e
arabinogalactanas (Wong, 2008a).
12
Figura
3
–
Estrutura
básica
da
pectina.
(Fonte:
http://www.ccrc.uga.edu/~mao/intro/ouline.htm)
Degradação da matéria lignocelulósica
A primeira etapa no processamento biomassa lignocelulósica para a
produção de etanol de segunda geração é o pré-tratamento. Este pode ser
realizado através de métodos físicos, químicos e biológicos.
A metodologia mais comum é a explosão de vapor, no qual a biomassa
triturada é tratada com vapor (saturado, 160°-260° C) seguido de uma rápida
descompressão. O processo causa a degradação da hemicelulose e a
transformação da lignina devido à alta temperatura. Desse modo, há um
aumento na potencial hidrólise da celulose. As vantagens do método incluem a
baixa energia requerida comparada com a moagem mecânica. Contudo, há
destruição de uma porção de xilana, além da ruptura incompleta da lignina e
geração de compostos que podem inibir os microorganismos utilizados na
fermentação (Rosa,2010; Sun, 2002).
Ácidos concentrados tais como H2SO4 e HCl tem sido usado no tratamento
da matéria lignocelulósica. Entretanto, ácidos concentrados são tóxicos e
corrosivos, além do que devem ser recuperados após hidrólise para tornar o
processo economicamente viável (Sivers, 1995). Ácidos diluídos têm sido usados
13
com
sucesso
no
pré-tratamento
da
biomassa,
e
podem
aumentar
significativamente a hidrólise da celulose. Contudo, ainda possui um custo alto
quando comparado às outras metodologias. O uso dos ácidos requer a
neutralização do pH previamente à fermentação, o que também encarece o
processo.
A metodologia aplicada ultimamente no pré-tratamento da matéria
lignocelulósica, tem demonstrado desvantagens que acabam por impulsionar a
busca por métodos mais econômicos e integrados. Por esse motivo tem-se
estudado o pré-tratamento biológico, no qual são usadas enzimas produzidas por
microrganismos como fungos e bactérias que são capazes de degradar a matéria
lignocelulósica.
Entre
elas,
lignina
peroxidases,
peroxidase
manganês-
dependente, polifenol oxidases, laccases, arabinanases, arabinofuranosidases,
xilases, etc. Cada enzima tem a capacidade de quebrar ligações específicas de
diferentes substratos. A principal vantagem do pré-tratamento biológico está em
requerer baixa energia e leves condições ambientais (Sun, 2002).
Apesar de trazer inúmeras vantagens, o alto custo da redução de
polissacarídeos complexos da biomassa para açúcares fermentáveis impede que
essa tecnologia seja empregada. Os custos de celulases e hemicelulases
contribuem substancialmente para o preço do bioetanol e, por isso, novos
estudos visando a compreensão e o melhoramento da eficiência e da
produtividade dessas enzimas são de fundamental importância.
Arabinanases
São enzimas que podem ser encontradas em várias bactérias e fungos,
assim como em sementes germinativas de plantas (Wong, 2008b). As
arabinanases são glicosidases que hidrolizam ligações glicosídicas do tipo α-1,5
entre resíduos arabinofurasil encontrados no polímero de arabinana, os quais
estão presentes nas pectinas.
São membros da família 43 de hidrolases glicosídicas (GH43), de acordo
com
a
classificação
do
CAZy
(Carbohydrate-Active
enZymes,
http://www.cazy.org/). Membros desta família catalisam suas reações através
do mecanismo de inversão anomérica do carbono quiral. Possuem sítio ativo
14
com três resíduos catalíticos essenciais, sendo que dois destes resíduos são
aminoácidos carboxilados que atuam como ácido e base, respectivamente, na
inversão anomérica. O terceiro resíduo age, em geral, mantendo o correto
alinhamento do resíduo ácido em referencia ao substrato e modulando o pKa
(Alhassid, 2009).
As arabinanases são enzimas ainda pouco estudadas, quando comparado a
outras hidrolases como celulases ou xilanases. Contudo, elas têm atraído à
atenção em decorrência de sua aplicação em diversas áreas, tais como na
indústria alimentícia, síntese orgânica e degradação de matéria lignocelulósica
para a produção de biocombustível.
Metagenômica
Esta é uma abordagem que busca descobrir novas enzimas através do
screening de cepas bacterianas. Para tal, é feita a clonagem direta de genomas
coletivos extraídos de uma microflora ambiental. É um eficaz meio de explorar a
diversidade e complexidade de variados genes e enzimas de microrganismos
não-cultiváveis (Lorenz, 2002). O uso da metagenômica permite uma nova forma
de estudo e exploração dos recursos naturais biológicos: a bioprospecção. Esta
pode ser definida como: o método ou forma de localizar, avaliar e explorar
sistemática e legalmente a diversidade de vida existente em determinado local
(Santos, 2002). A bioprospecção tem como principal finalidade a busca de
recursos genéticos e bioquímicos para fins comerciais.
Endo-α
α-1,5-L-arabinanase (ARN2)
A ARN2 é uma endo-α-1,5-L-arabinanase obtida através de metagenômica
de microbiota de rúmen de vaca. Essa proteína contém 585 resíduos de
aminoácidos incluindo um predito peptídeo sinal de 19 resíduos de aminoácidos.
A proteína madura, de 566 resíduos, tem um peso molecular predito de 64.816,5
Da, com um ponto isoelétrico (pI) de 6,07. A molécula não possui linker rico em
Ser/Gly ou módulo de ligação a carboidrato (CBM) comumente encontrado em
hidrolases modulares.
15
A estrutura primária da ARN2 a classifica como membro da família GH43.
Modelagem por homologia da ARN2 com a hidrolase glicosídica YxiA de Bacillus
licheniformis (código PBD: 3LV4, 37% de identidade) indica que essa proteína
possui dois domínios, sendo um em five-bladed β-propeller e outro em barril-β
(Fig. 4). Além de apresentar 7 inserções, sendo as maiores de 19 resíduos
localizadas entre a 1ª e 2ª folha β, e entre a 2ª e 3ª folha β, ARN2 possui um Cterminal estendido, com 44 resíduos adicionais, quando comparado com a
proteína de B. licheniformis. Alinhamento de seqüências indica que Asp29 atua
como base e o Glu278 atua como ácido catalítico.
Figura 4 – Modelo da ARN2 indicando a presença de dois domínios. Cada uma das 5
folhas β do propeller está colorida de uma cor. Os resíduos catalíticos estão mostrados
em destaque, em modelo ball-and-sticks. O domínio em barril-β está colorido em cinza
escuro.
A enzima recombinante possui máxima atividade catalítica em pH 6,0-7,0, e
é relativamente estável na faixa de pH entre 5,0-8,0. Sua temperatura ótima
encontra-se entre 40-50°C, e demonstra estabilidade acima de 40°C, sendo
completamente inativa quando incubada a 55°C. Sua atividade de endoarabinanase foi demonstrada experimentalmente, pela presença de oligômeros
16
de cadeia curta nos menores tempos de hidrólise e acúmulo de arabinotriose e
arabinotetraose com progressão da reação. A ARN2 demonstra alta atividade
para arabinanas que foram desrafimicadas, entretanto, dados cinéticos indicam
que sua especificidade não se encontra na diferença de afinidade de ligação com
o substrato, mas nas etapas químicas subseqüentes à ligação (Wong, 2009).
Exo-α
α-1,5-L-arabinanase (ARN3)
A ARN3 é uma Exo-α-1,5-L-arabinanase de 347 resíduos de aminoácidos
obtida da extração do genoma total da microbiota presente no líquido de rumem
de vaca. Sua porção N-terminal possui um peptídeo sinal com 20 resíduos de
aminoácidos contendo seis resíduos de Leucinas com um sítio predito de
clivagem entre a Ala20 e a Gln21. A estrutura primária não revela um linker rico
em Ser/Gly ou um CBM, típicos de hidrolases modulares.
A proteína madura tem seu peso molecular calculado em 37.300,8 Da e um
pI de 7,13. ARN3 é composta por apenas 1 domínio, que se enovela em fivebladed β-propeller (Fig. 5). A modelagem por homologia usando a α-Larabinanase 43A de Cellvibrio japonicus revelou que ARN3 contém uma
seqüência extra de resíduos de aminoácidos (195 a 201, KGEPKTI), tornando
maior o loop que conecta a terceira e a quarta fitas da terceira folha β. Um
segmento adicional de resíduos de aminoácidos (223 a 226, NQAP) alongou o
loop que liga a terceira e quarta folhas β. Análise de alinhamento de seqüência
com outras arabinanases sugere que o ácido e a base catalíticos da ARN3
consistem do Glu234 e do Asp40, respectivamente.
17
Figura 5 – Modelo da ARN3 em que cada uma das 5 folhas β do propeller está colorida
de uma cor.
A ARN3 recombinante tem um pH ótimo de 6,0-7,0, é relativamente estável
na faixa de pH 3,0-7,0, sua maior estabilidade é obtida em pH 5,0. Sua
temperatura ótima é aos 50°C, e a enzima se mostra estável em temperatura
menor ou igual a 45°C. Sua atividade de exo-arabinanase foi comprovada em
ensaios nos quais foi observado o acúmulo de arabinose durante a reação sem a
presença de oligômeros intermediários. A enzima recombinante não cliva
arabinanas ramificadas. Possivelmente as cadeias laterais de arabinofuranosil
causam impedimento estérico, afetando a ligação do substrato no sítio ativo da
enzima (Wong, 2008b).
2. Objetivo
O principal objetivo deste trabalho é cristalizar as enzimas de interesse
biotecnológico endo-α-1,5-arabinanase e exo-α-1,5 -L-arabinanase provenientes
de uma biblioteca metagenômica de microbiota de rúmem de vaca.
18
3. Materiais e métodos
3.1 Transformação de Cepas de Escherichia coli
Foi realizada transformação por eletroporação da cepa BL21 (DE3) de
Escherichia coli com a construção plasmidial pET32b/ARN2 e pET32b/ARN3. O
plasmideo usado foi escolhido porque leva à expressão da proteína de interesse
em fusão com a tiorredoxina na porção N-terminal, visando aumentar sua
solubilidade. Além disso, a proteína contém uma cauda de 6 resíduos de histidina
no seu C-terminal, que visa facilitar a purificação da proteína de interesse.
A eletroporação foi iniciada com a adição de 1 µL de cada plasmídeo
(pET32b/ARN2 ou pET32b/ARN3) a 40 µL de células competentes. Esse material
foi transferido para uma cubeta que foi submetida a um pulso elétrico de 2,5V
usando o Gene Pulser II (BioRad). As células foram cultivadas em 1 mL de meio
Luria-Bertani – LB (1% (p/v) de triptona, 1% (p/v) de cloreto de sódio e 0,5%
(p/v) de extrato de levedura) sob agitação de 200 rotações por minuto (rpm) por
1 hora a 37°C. Após esse período 100 µL de células foram plaqueados em meio LB
sólido contendo ampicilina (100 µg/mL). As placas foram mantidas por 16 horas
em estufa a 37°C.
Foi também realizada a transformação por choque térmico da cepa DH5α de
E. coli, com o objetivo de aumentar o número de cópias das construções
pET32b/ARN2 e pET32b/ARN3. Foi misturado 1 µL das respectivas construções
com 40 µL de células quimicamente competentes, estes foram incubados por 30
minutos no gelo, seguido de 30 segundos a 42°C e em seqüência 5 minutos no
gelo. As células foram cultivadas em 1 mL de meio LB por 1 hora a 37°C/200rpm.
Após esse período 100 μL de células foram plaqueados em meio LB sólido
contendo ampicilina. As placas foram mantidas por 16 horas em estufa a 37°C.
3.2 Mini preparações plasmidiais
As colônias crescidas da cepa de E. coli DH5α foram inoculadas em 5 mL de
meio LB líquido com ampicilina, e incubados por 16h a 37°C/200rpm, para em
19
seguida serem realizadas minipreparações plasmidiais. As minipreparações
plasmidiais foram realizadas através do kit QUIAprep® Spin Miniprep (QUIAGEN
– Lot 130188489), segundo protocolo descrito pelo fabricante. As extrações
plasmidiais foram analisadas através de eletroforese em gel de agarose 1% e
visualização em transiluminador de luz ultra-violeta. Foi realizada a quantificação
desse material através de espectrofotômetro NanoDrop™ 2000 (Thermo Fisher
Scientific).
3.3 Expressão protéica
3.3.1 Indução
O protocolo de expressão para as proteínas ARN2 e ARN3 já estava
estabelecido (Wong, 2008b). Com intuito de confirmar os resultados anteriores,
durante a expressão em larga foram retiradas 3 alíquotas, em diferentes tempos.
A metodologia empregada está descrita a seguir.
Colônias advindas da transformação de E. coli BL21 (DE3) com as
construções pET32b/ARN2 e pET32b/ARN3 foram transferidas para 10 mL de
meio LB líquido e incubados por 16 h a 37°C/200rpm. A cultura foi inoculada em
500 mL de meio LB líquido contendo antibiótico ampicilina, e incubada a
37°C/200rpm até atingir a OD600nm = 0,7. A indução foi realizada a 30°C com a
adição de IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) na concentração final de 0,1 mM.
Alíquotas foram retiradas em diferentes tempos (t0=10 mL, t2h=7 mL e t4h=5 mL),
centrifugadas a 3184g/15min/4°C e armazenadas a -20°C. Após 4 horas de
indução os 500 mL de cultura foram centrifugados a 6000g/15min/4°C e o pellet
guardado a -20°C.
As células de 500 mL foram ressuspendidas em Tampão A (0,5 M de NaCl,
tampão 0,5 M de fosfato de sódio pH 7,5, 0,5 M de imidazol) contendo 1 mM de
PMSF e 5 mM de benzamidina e incubadas durante 1 hora com lisozima (80
µg/mL). Em seguida, foram lisadas através de sonicação no equipamento
Vibracell™ VCX 500 (Sonics & Materials Inc.) com pulsos de 15 s, intervalos de 45
s, usando amplitude de 30%. Logo após, as amostras foram centrifugadas a
20
16900g/30 min/4°C e o sobrenadante aplicado em coluna de cromatografia de
afinidade.
As alíquotas coletadas durante a indução foram ressuspendidas em 1 mL de
Tampão A contendo PMSF e benzamidina e lisadas por sonicação com pulsos de
5 s e intervalos de 15 s, com amplitude de 20%. As amostras foram centrifugadas
a 20817g/30min/4°C, os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos e os
pellets ressuspendidos em 1 mL do mesmo tampão. Amostras de pellet e
sobrenadante foram aplicadas em SDS-PAGE 13%.
3.3.2 Cultura permanente
Foram
também
realizadas
culturas
permanentes
das
construções
pET32b/ARN2 e pET32b/ARN3 em BL21 (DE3), com o objetivo de manter uma
fonte segura para a obtenção de bactérias transformadas, além de tornar maior a
chance de reprodutibilidade das expressões. Com o mesmo pré-inoculo usado na
indução foi feita uma cultura permanente. Foram adicionados 600 µL de glicerol
100% estéril a 400 µL de células e o material foi estocado a -80°C.
3.3.3 Eletroforese de proteínas
A análise da indução, da proteólise e dos procedimentos de purificação foi
realizada pela técnica de SDS-PAGE (eletroforese em gel de poliacrilamida docecil sulfato de sódio), o qual é um método de baixo custo, reprodutível e
rápido para quantificar, comparar e caracterizar proteínas. Este método separa
proteínas baseado primeiramente em seus pesos moleculares (Laemmli, 1970).
O SDS liga nas porções hidrofóbicas da proteína, perturbando sua estrutura
tridimensional e permitindo que ela exista de forma estável em solução, em
conformação estendida. Como resultado, o comprimento do complexo proteínaSDS é proporcional ao seu peso molecular.
Foi utilizado um gel composto por duas fases: uma de empilhamento, que
apresenta uma menor concentração de poliacrilamida permitindo que haja o
empilhamento e entrada homogênea das proteínas no gel de resolução, no qual as
proteínas serão efetivamente separadas.
21
3.4 Purificação
3.4.1 Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade é baseada na específica afinidade entre a
proteína e o ligante ligado à matriz. O ligante pode ser biologicamente específico,
tais como peptídeos, anticorpos ou ácidos nucléicos, ou pode explorar interações
não específicas com lectinas ou corantes. Quando a amostra é aplicada na coluna
apenas os componentes com afinidade ao ligante presente na resina
permanecerão adsorvidos à matriz, sendo o restante da amostra retirado por
meio das lavagens realizadas. A dissolução da ligação entre o ligante e a proteína
pode ser realizada através de alteração do pH ou por competição com outras
espécies doadoras de elétrons. Neste trabalho, foi utilizada a técnica denominada
cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados. Em tal técnica a
afinidade ocorre em função de ligações reversíveis formadas entre um íon
metálico aderido à resina, o níquel (Ni2+), e o anel imidazólico de resíduos de
histidina. A ligação ocorre em função da doação de elétrons do aminoácido para o
íon metálico. O desligamento da proteína da coluna por sua vez ocorrerá com a
adição de imidazol, que compete com as histidinas pela ligação ao metal. Esta
técnica só foi possível devido ao fato de que há uma seqüência de seis histidinas
presentes no C-terminal da proteína de interesse, como já foi anteriormente
descrito.
Foi utilizada a coluna HiTrap™ Chelating de 1 mL (GE Healthcare) acoplada
ao sistema ÄKTA™ FPLC™ (GE Healthcare) e um fluxo de 1 mL/min. A coluna foi
previamente carregada com solução 100 mM de sulfato de níquel e equilibrada
com tampão A. Após aplicação da amostra, a coluna foi lavada com tampão A até a
A280nm estabilizar. A eluição da proteína de interesse foi feita através de gradiente
de imidazol de 0 a 500 mM em 20 volumes de coluna. A concentração de imidazol
foi mantida constante durante a eluição de cada pico.
22
3.4.2 Teste de proteólise limitada das proteínas recombinantes
Foi realizada proteólise limitada com as proteínas recombinantes, com o
objetivo de clivar a tiorredoxina fusionada às proteínas de interesse. Foi utilizada
a enzima tripsina na concentração final de 0,01 mg/ml, em presença de 1 mg/mL
da ARN2 ou ARN3 purificadas. Alíquotas foram coletadas em diferentes tempos
de digestão, e após cada coleta foi adicionado PMSF (fluoreto de
fenilmetilsulfonil), inibidor de serino proteases incluindo a tripsina, na
concentração final de 1 mM. Em seguida, analisou-se a degradação através de gel
SDS-PAGE e definiu-se a melhor condição de clivagem.
3.4.3 Cromatografia de Exclusão molecular
A cromatografia de exclusão molecular, também denominada de filtração
em gel, é o único método de separação que não requer ligação de proteínas à
matriz. Deste modo, reduz significativamente o risco de perda da proteína devido
a ligações irreversíveis ou inativação protéica. Neste método separam-se
proteínas de acordo com seu tamanho. A matriz da cromatografia de exclusão
molecular contém poros que permitem que o tampão e as pequenas proteínas
entrem, mas excluem grandes proteínas e agregados protéicos. Assim, grandes
proteínas migram ao redor das partículas da matriz e são eluídas da coluna antes
das proteínas menores.
As amostras da cromatografia de afinidade consideradas puras por SDSPAGE foram juntadas e concentradas por filtração em Amicon® Ultra-4
Centrifugal Filter (Millipore) com poros de 30 kDa para a ARN2 e 10 kDa para
ARN3, centrifugando-se a 3184g a 4°C até obter-se 2 mL. A cromatografia foi
realizada em sistema ÄKTA™ FPLC™ (GE Healthcare), usando-se coluna Superdex
75 16/60 (GE Healthcare), previamente equilibrada com tampão 20 mM de
fosfato de sódio pH 7,5, 150 mM de NaCl, a um fluxo de 0,5 mL/min.
23
3.5 Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)
É ideal que a amostra a ser cristalizada seja homogênea. O DLS é uma
técnica que permite estimar a distribuição de tamanho das populações de
partículas que estão presentes na solução, o que se trata de heterogeneidade
estrutural – diferentes estados de oligomerização da mesma proteína ou a
formação de agregados protéicos.
A análise por DLS foi feita em todas as amostras consideradas puras após
cromatografia de exclusão molecular e analisadas por SDS-PAGE. As amostras
foram previamente centrifugadas por 30 minutos a 20817g a 4°C, e foram
realizadas 100 aquisições de 5 segundos a 18°C. Somente as frações consideradas
monomodais (1 população) e monodispersas (até 25% de polidispersividade),
foram utilizadas para cristalização, pois há relatos na literatura mostrando que
amostras monodispersas têm maior chance de cristalização.
3.6 Concentração de amostras
Visando uma maior chance de cristalização a amostra é concentrada o
máximo possível, ou seja, até o momento em que comecem a surgir pequenos
pontos de precipitado. Para isso, as frações da cromatografia de filtração gel que
se apresentaram puras através de SDS-PAGE e monomodais e monodispersas por
DLS foram reunidas e concentradas pelo método de filtração. Foi usado Amicon®
Ultra-4 Centrifugal Filter (Millipore) com poro de 30 kDa para ARN2 e 10 kDa
para ARN3, centrifugando-se a 3220 g a 4°C até obter-se 0,5 - 1 mL. Durante a
concentração o tampão da proteína foi trocado por 20 mM de Hepes pH 7,5.
3.6.1 Medidas de concentração de proteína
A absorbância da solução contendo a proteína foi lida a 280 nm em
espectrofotômetro DU 640 (Beckman Coulter) utilizando-se cubeta de quartzo de
1 cm de caminho óptico.
24
A concentração da proteína foi calculada segundo a equação de BeerLambert:
Α =ε × c ×l
Onde A é a absorbância em 280 nm, ε é o coeficiente de extinção em M-1
cm-1, c é concentração em M e l é o caminho óptico da cubeta em cm.
O ε teórico da ARN2 e ARN3 com cauda de histidinas e Trx foi calculado
pelo programa ProtParam (http://us.expasy.org/tools/protparam.html) e é de
154590 e 106800 e M-1 cm-1, respectivamente. Após obter a concentração molar,
a concentração em mg/mL foi obtida dividindo-se esse valor pelo peso molecular
da proteína, que é de 76207.6 Da e 50257.5 Da, respectivamente.
3.7 Ensaios de Cristalização
Os ensaios de cristalização foram realizados através do método de difusão
de vapor. Para que ocorra a formação dos cristais é necessário que a solução
fique supersaturada, que nesse método ocorre em função do aumento gradual da
concentração dos componentes da gota através da difusão de vapores que ocorre
no interior da placa de cristalização, entre a solução presente no reservatório e a
gota, constituída de proteína e solução precipitante. Não se sabe ao certo o que
leva a formação de bons cristais, contudo existem etapas críticas, como a
obtenção de proteína pura e em sua máxima concentração. Nessa situação de
supersaturação pode haver tanto a formação de núcleos para a formação dos
cristais, quanto a formação de precipitados amorfos de proteínas.
Ensaios de cristalização foram realizados usando gota sentada a 18°C com a
proteínas fusionadas à Trx no N-terminal e à cauda de histidinas no C-terminal,
nas concentrações de 5,8 mg/ml, para ARN2, e 11,05 mg/ml para ARN3, em
tampão 20 mM de Hepes pH 7,5. Foram utilizadas placas de 96 poços. As gotas
foram preparadas pelo robô de cristalização Honeybee 963 (Genomic Solutions).
No reservatório foram aplicados 80 μL de solução; na gota aplicou-se 0,5 μL de
proteína e 0,5 μL de solução do reservatório. Os kits utilizados foram: Crystal
Screen e Crystal Screen 2 (Hampton Research), Wizard Screens I e II (Emerald
Biosystems), PACT (Nextal/QUAIGEN), JCSG (Nextal/QUAIGEN), SaltRx (Hampton
Research) e Precipitant Synergy (Emerald Biosystems).
25
Quando apareceram cristais, foi feito refinamento da condição, isto é, foram
feitas novas gotas de cristalização, usando soluções semelhantes à condição
inicial, porém, com variação da concentração do agente precipitante. Foram
preparadas placas com gota sentada, pelo robô, da mesma forma que
anteriormente. As mesmas soluções também foram utilizadas no preparo manual
de placas pelo método de gota pendurada. As gotas continham 1,0 μL de proteína
e 1,0 μL de solução do reservatório, e o reservatório continham 200 μL da
solução. Para esta metodologia foram utilizadas placas de 24 poços.
3.8 Coleta e processamento dos dados de difração
Os cristais obtidos foram resfriados a 100 K com fluxo de nitrogênio
gasoso. Os dados de difração foram coletados na linha de luz W01B-MX2 do LNLS
usando detector MAR 225 CCD (Mar Research). Foi utilizado o método de
rotação, com varredura de 1°. O processamento dos dados foi realizado no
programa HKL2000 (Otwinowski, 1997).
3.9 Determinação da estrutura tridimensional
A resolução da estrutura quimérica, ARN2-Trx, foi realizada através do
método de substituição molecular, utilizando o programa MolRep (Vagin, 2010).
O BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) foi utilizado como ferramenta
de busca de sequências similares à ARN2 e cuja estrutura estivesse resolvida,
selecionando-se como banco de dados o PDB. A proteína YxiA de Bacillus
licheniformis (código PDB: 3LV4), que possui 37% de identidade com a ARN2, e a
tiorredoxina de E. coli (código PDB: 2TRX) foram utilizadas como estruturas
moldes para a substituição molecular.
O modelo YxiA foi previamente
modificado usando a opção last common atom do programa CHAINSAW (Stein,
2008).
26
27
esperado, de cerca de 76 kDa para ARN2-Trx e 50 kDa para ARN3-Trx. Embora
houvesse proteínas na fração insolúvel, a quantidade de proteínas na fração
solúvel era suficiente para seguir com o trabalho.
Figura 7 – Avaliação da expressão da ARN2-Trx e ARN3-Trx, em diferentes tempos de
indução com IPTG, através de gel SDS-PAGE 13%. PM marcador de peso molecular. P
pellet obtido após sonicação e centrifugação. S sobrenadante recuperado após sonicação
e centrifugação.
5.3 ARN2
4.3 ARN2
4.3.1 Cromatografia de afinidade
As células provenientes de 500 mL de meio foram ressuspendidas e
lisadas por métodos químicos e físicos. O sobrenadante obtido foi aplicado em
coluna de cromatografia de afinidade (Fig. 8). A eluição foi realizada mediante a
aplicação de gradiente linear de imidazol. Contudo, a concentração foi mantida
constante durante a eluição de cada pico.
28
Figura 8 – Gráfico da cromatografia de afinidade a metal da ARN2-Trx, mostrando a
absorbância em 280 nm (azul), a condutividade (marrom) e a concentração de imidazol
(verde).
O cromatograma mostrou a existência de dois picos, os quais foram
avaliados através de gel SDS-PAGE 13% (Fig. 9). As frações a partir da metade do
primeiro pico até o final do segundo continham proteína com peso molecular
correspondente a ARN2, com poucos contaminantes.
Figura 9 – Eletroforese em gel SDS-PAGE 13% das frações coletadas durante a
cromatografia de afinidade da ARN2-Trx. PM marcador de peso molecular. P pellet
obtido após sonicação e centrifugação. S amostra aplicada na coluna.
29
4.3.2 Proteólise limitada
Foi realizada proteólise limitada da fração 25 da cromatografia de
afinidade a metal da ARN2. Alíquotas coletadas nos diferentes tempos de digestão
foram avaliadas através de gel SDS-PAGE (Fig. 10). Os resultados indicam que a
incubação com tripsina não levou à clivagem da quimera ARN2-Trx, pois não se
observa redução do peso molecular da proteína.
Figura 10 – SDS-PAGE 13% das alíquotas coletadas durante proteólise limitada da
ARN2-Trx. Linha 1 corresponde à amostra não digerida; as linhas de 2-6 correspondem
a proteólise realizada durante 5, 15, 30, 60 e 120 minutos, respectivamente. M marcador
de peso molecular
Devido ao fato que não houve clivagem da Trx durante a proteólise
limitada, fizemos a opção de continuar trabalhando com a proteína quimérica
ARN2-Trx.
4.3.3 Cromatografia de exclusão molecular
As frações 14 a 26 obtidas por meio da cromatografia de afinidade a metal
foram juntadas e concentradas através do método de filtração. A amostra foi
aplicada na coluna de exclusão molecular. O gráfico gerado demonstra dois picos,
30
indicando a presença de contaminantes ou a proteína em diferentes estados
oligoméricos (Fig. 11).
Figura 11 – Gráfico da cromatografia de exclusão molecular. A absorbância em 280 nm
é mostrada em azul, a condutividade em marrom.
SDS-PAGE das frações (Fig. 12) revelou que havia uma única proteína em
ambos os picos. Medidas de DLS indicam as proteínas do pico 1 e do pico 2
apresentam diferentes conformações ou estados oligoméricos, devido à diferença
de raio hidrodinâmico observado (Tabela 1).
Figura 12 – Eletroforese das frações coletadas durante a cromatografia de exclusão
molecular da ARN2-Trx. M marcador de peso molecular. S amostra aplicada na coluna.
31
4.3.4 Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
Logo após a cromatografia de exclusão molecular e a avaliação de sua
eficiência mediante SDS-PAGE, as frações do pico maior foram submetidas a
medidas de DLS, com a finalidade de se obter informações sobre a
polidispersividade (Tabela 1).
Tabela 1 – Dados obtidos através de DLS das frações provenientes da crometografia de
exclusão molecular.
R
Pd
PM
Massa
(nm)
(%)
(kDa)
(%)
6
5,1
14,6
153
100
10
4,3
30,4
103
100
11
3,8
17,3
77
100
12
3,9
17,1
79
100
13
3,7
1,5
73
100
14
3,9
19,5
83
100
15
4,2
28,9
96
100
Fração
R raio hidrodinâmico, Pd polidispersividade, PM peso molecular
As frações com menos polidispersividade (11-14) foram misturadas e
concentradas, e o tampão trocado para 20 mM de Hepes pH 7,5. Em seguida,
foram realizadas novamente as medidas de DLS, o qual mostrou que a amostra
possuía 23% de polidispersividade e um raio hidrodinâmico de 3.9 nm (Fig 13).
Esta amostra foi então submetida aos testes de cristalização.
32
Figura 13 – Histograma representativo das populações presentes na amostra de
proteína ARN2-Trx concentrada. Que apresentou um raio hidrodinâmico de 3,9 nm e
23% de polidispersividade.
4.3.5 Ensaios de Cristalização
Os ensaios iniciais de cristalização foram feitos por meio do robô de
cristalização Honeybee 963 (Genomic Solutions), utilizando 6 diferentes kits.
Foram obtidos cristais no primeiro dia após o preparo da gota, na condição
contendo 2,1 M de malonato de sódio pH 7,0 (Fig. 14).
Figura 14 – Fotografia dos cristais iniciais da quimera ARN2-Trx, obtidos na condição
com 2,1 M de malonato de sódio.
33
Em seguida, foi realizado o refinamento dos cristais, utilizando o robô
Honeybee, diminuindo a concentração do agente precipitante. Foram obtidos
cristais nas concentrações de 2,1 M, 2,0 M, 1,9 M e 1,8 M, com 1, 2, 3 e 4-5 dias,
respectivamente (Fig. 15).
A
B
C
D
Figura 15 – Fotografias dos cristais da ARN2-Trx obtidos em cada condição de
refinamento: 2,1 M (A), 2,0 M (B), 1,9 M (C) e 1,8 M (D). Os cristais apresentam
dimensões máximas de 75 (A), 125 (B), 400 (C) e 450 µm (D).
O mesmo refinamento foi realizado através de difusão de vapor em gotas
penduradas preparadas manualmente (Fig. 16).
A
B
C
D
Figura 16 – Fotografias de cristais da ARN2-Trx obtidos após refinamento em gota
pendurada utilizando o malonato de sódio como agente precipitante: a 2,1 M (A), 2,0 M
(B), 1,9 M (C) e 1,8 M (D). Os cristais apresentam dimensões máximas de 400 µm (C) e
500 µm (D).
Pode-se observar que os cristais formados em gotas penduradas foram
maiores que os formados em gotas sentadas.
34
4.3.6 Coleta e processamento de dados
Os cristais da figura 16C e 16D foram utilizados nos experimentos de
difração de raios X. O cristal formado na condição com malonato de sódio 1,9 M
(Fig. 16C) apresentou difração de até 2.8 Å, e por isso foi coletado um conjunto de
dados. Contudo, o cristal formado na presença de 1,8 M de malonato de sódio
(Fig. 16D) difratou até 2,6 Å (Fig. 17), por isso foi coletado um novo conjunto de
dados. Os conjuntos foram processados, através do programa HKL2000. Na
Tabela 2 estão mostradas as estatísticas do segundo conjunto de dados coletados,
que apresentou dados melhores e a mais alta resolução.
Figura 17 – Padrão de difração do cristal da ARN2-Trx formado na presença de 1,8 M de
malonato de sódio. À direita, zoom da região de mais alta resolução, mostrando em
destaque um spot a 2,6 Å.
35
Tabela 2 – Processamento de dados do 2° conjunto de dados da proteína ARN2-Trx
Comprimento de onda (Å)
1,3591
Temperatura (K)
100
Número de imagens coletadas
140
Grupo espacial
P212121
Parâmetros da célula unitária (Å,°)
a=98,42 b=113,56 c=166,61 α=β=γ=90
Resolução (Å)
30,00-2,60 (2,69-2,60)
Mosaicidade (°)
0,6
I/σ(I)
12,8 (3,6)
Completeza (%)
99,4 (98,6)
Multiplicidade
5,3 (5,3)
Rmerge (%)
11,0 (41,7)
Reflexões únicas totais
57.767 (5.642)
Reflexões totais
303.718
Valores em parênteses se referem à camada de mais alta resolução.
Os cristais da ARN2-Trx pertecem ao grupo espacial P212121,
apresentando os seguintes parâmetros da célula unitária a=98,42 b=113,56
c=166,61 Å, α=β=γ=90°. O calculo do coeficiente de Matthews, usando o peso
molecular de 76 kDa, resultou em 3,06 e 2,04 Å3 Da-1, indicando a possibilidade
de 2 ou 3 moléculas de proteína quimérica dentro da unidade assimétrica, com
60 ou 40% de solvente, respectivamente.
4.3.7 Determinação da estrutura cristalográfica
A estrutura foi resolvida pelo método de substituição molecular
utilizando o programa MolRep. Através da ferramenta BLAST foi encontrada a
proteína YxiA de B. licheniformis (código PDB: 3LV4), com 37% de identidade
com a ARN2, que foi utilizada como modelo de busca para a ARN2. Como a
tiorredoxina de E. coli já possui estrutura resolvida (código PDB: 2TRX), esta foi
utilizada como modelo de busca para a Trx.
Para a resolução da estrutura foi primeiramente realizada a procura de
uma molécula de ARN2 utilizando o programa MolRep. Em uma segunda etapa, a
36
molécula ARN2 encontrada foi fixada e procurou-se a molécula de Trx. Após
encontrar ambas, utilizamos a estrutura quimérica como molde para encontrar
as moléculas dentro da unidade assimétrica, que nesse caso foram 2 (Fig. 18a). A
análise da organização tridimensional das moléculas de ARN2-Trx no cristal (Fig
18b) indica a presença de somente 2 monômeros dentro da unidade assimétrica,
embora o coeficiente de Matthews indicasse a possibilidade de até 3 monômeros.
Figura 18 – Estrutura cristalográfica da quimera ARN2-Trx. A Dois monômeros da
proteína quimérica ARN2-Trx encontrados na unidade assimétrica. Em azul e verde
estão as ARN2, e em rosa e amarelo estão representadas as moléculas de Trx. B
organização tridimensional dos monômeros, mostrando as faces C, B e A da célula
unitária, respectivamente.
Foi realizado um primeiro ciclo de refinamento (através do programa
REFMAC), o qual tinha por objetivo verificar o Rfactor, Rfree e a figura de mérito
(FOM). Esses fatores mostram o percentual de erro existente em sua estrutura
resolvida com relação aos dados experimentais e dão indícios se a substituição
molecular teve sucesso. Além disso, é gerado um mapa de densidade eletrônica,
que pode ser visualizado através do programa COOT (Fig 19). Todos esses
valores (Rfactor= 0,416; Rfree= 0,477; FOM= 0,546) e a análise do mapa de
densidade eletrônica indicam que a estrutura da proteína quimérica ARN2-Trx
foi resolvida. Ainda há muitos erros nessa estrutura, os quais serão solucionados
37
através de diversos ciclos de refinamento, que consistem da análise do mapa de
densidade eletrônica e da modificação manual do modelo.
Figura 19 – Parte do mapa de densidade eletrônica da ARN2-Trx mostrando a estrutura
protéica como stiks e a densidade eletrônica em azul.
4.4 ARN3
Com esta proteína foram realizadas duas abordagens. Em uma primeira
etapa, a proteína purificada por cromatografia de afinidade foi submetida à
proteólise limitada (Fig. 20). A redução de peso molecular de cerca de 10 kDa
indicou a clivagem da proteína tiorredoxina. Por isso, a amostra foi submetida à
cromatografia de exclusão molecular, que permitiu a separação da ARN3 e da
tiorredoxina. A amostra de ARN3 clivada foi então submetida aos testes de
cristalização. Esses testes resultaram em gotas com precipitados e gotas claras.
38
Figura 20 – SDS-PAGE 13% da ARN3-Trx clivada com tripsina. Linha 1 corresponde a
amostra protéica sem clivagem, linhas 2-4 corresponde a alíquotas da proteína clivada
em 5, 15, 30, 60 e 120 minutos, respectivamente. Bandas com cerca de 35 kDa
correspondem à ARN3 e as bandas com cerca de 14 kDa correspondem à Trx. A partir de
30 minutos toda a proteína da amostra já havia sido clivada, sendo este o tempo
estabelecido para a proteólise limitada.
Sendo assim, passamos à outra abordagem que utilizava a proteína
quimérica inteira, ARN3-Trx. Foram realizadas as cromatografias de afinidade e
exclusão molecular e após estes passos seguiu-se com os ensaios de cristalização.
Estes novos testes com a proteína quimérica produziram cristais na condição que
continha como agente precipitante o PEG 400 em uma solução tamponada em pH
9,5 com CHES (ácido N-ciclohexil-2-aminoetanosulfonico). São estes os
resultados que estão descritos a seguir.
4.4.1 Cromatografia de afinidade
A cromatografia de afinidade a metal produziu dois picos de eluição (Fig.
21). As frações provenientes de ambos os picos foram analisadas através de SDSPAGE (Fig. 22).
39
Figura 21 – Cromatografia de afinidade da ARN3-Trx. Absorbância em 280 nm mostrada
em azul, condutividade em marrom e concentração de imidazol em verde.
Figura 22 – SDS-PAGE das frações coletadas durante a eluição da ARN3-Trx da
cromatografia de afinidade. M peso molecular. Frações 4-9 correspondem ao pico 1,
fração 19 corresponde ao pico 2.
Através da análise por SDS-PAGE das frações coletadas pode-se observar
que havia bastante proteína, com pouco contaminante, a partir da metade do
primeiro pico até o fim do segundo pico.
40
4.4.2 Cromatografia de exclusão molecular
As frações 5 a 20 da cromatografia de afinidade foram juntadas e
concentradas através do método de filtração. Em seguida, foram aplicadas em
coluna de cromatografia de exclusão molecular (Fig. 23). As alíquotas coletadas
durante a eluição da amostra foram analisadas através de SDS-PAGE (Fig. 24).
Todos os picos contêm a proteína de interesse pura, em diferentes concentrações,
e em diferentes estados oligoméricos.
Figura 23 – Gráfico gerado durante cromatografia de exclusão molecular da ARN3-Trx.
Absorbância em 280 nm (azul).
Figura 24 - SDS-PAGE 13%. Alíquotas coletadas durante cromatografia de exclusão
molecular da ARN3-Trx. M marcador de peso molecular. Fração 3: pico 1, fração 10: pico
2, frações 15-24: pico 3.
41
4.4.3 Espalhamento Dinâmico da Luz (DLS)
As frações de 16 a 21 provenientes da cromatografia de exclusão
molecular foram juntadas, concentradas e tiveram seu tampão trocado por 20
mM de HEPES pH 7,5. Em seguida, foram realizadas as medidas de DLS. Os
resultados indicam que a amostra possuía 16% de polidispersividade e raio
hidrodinâmico de 3,5 nm (Fig. 25).
Figura 25 – Histograma representativo das populações presentes na amostra da
proteína quimérica ARN3-Trx concentrada, que apresentou raio hidrodinâmico de 3.5
nm e 16% de polidispersividade.
4.4.4 Ensaios de Cristalização
Os ensaios iniciais de cristalização foram feitos por meio do robô de
cristalização Honeybee 963 (Genomic Solutions), utilizando 6 diferentes kits.
Foram obtidos cristais no sexto dia após o preparo da gota, na condição contendo
100 mM de CHES/NaOH pH 9,5 e 30% (v/v) de PEG-400 (Fig. 26).
42
Figura 26 – Fotografia dos cristais da quimera ARN3-Trx formados na condição com
30% de PEG-400 e 100 mM de CHES pH 9,5, que apresentam dimensão máxima de 50
µm.
O refinamento dos cristais foi realizado diminuindo-se a concentração do
agente precipitante, o PEG 400. O refinamento foi realizado em gota sentada, no
robô, e gota pendurada, manualmente. Até o presente momento não foi
observada a formação de novos cristais.
5. Conclusão
Neste trabalho as duas proteínas de interesse, ARN2 e ARN3 foram
eficientemente expressas na fração solúvel em E. coli, fusionadas à Trx no Nterminal e a uma cauda de 6 histidinas no C-terminal. As proteínas foram
purificadas por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular, alcançando
alto grau de pureza e homogeneidade estrutural. O objetivo principal do trabalho,
que era cristalizar as proteínas de estudo, foi alcançado. Ambas as proteínas
foram cristalizadas na sua forma quimérica, isto é, em fusão com a Trx. Os
objetivos foram ainda ultrapassados, pois realizamos refinamento dos cristais da
ARN2-Trx, experimentos de difração de raios X com estes cristais, processamento
dos dados de difração e determinação da estrutura cristalográfica dessa quimera
a 2,6 Å. Esse trabalho traz diversas novidades, como a cristalização da proteína de
interesse em fusão com outra (Trx) que geralmente é usada somente para
43
aumento de solubilidade; primeira estrutura de metagenômica do Brasil, o que é
um passo além no âmbito da bioprospecção no país; traz maior conhecimento
acerca de arabinanases, contribuindo para um melhoramento direcionado dessas
enzimas de ampla aplicação biotecnológica.
6. Referências
Alhassid, A., Ben-David, A., Tabachnikov, O., Libster, D., Naveh, E., Zolotnitsky, G.,
et al. Crystal structure of an inverting GH 43 1,5-alpha-L-arabinanase from
Geobacillus stearothermophilus complexed with its substrate. The
Biochemical journal, 422(1), 73-82, 2009.
Boden, T.A., Marland, G., Andres, R.J.. Global, Regional, and National Fossil-Fuel
CO2 Emissions. Carbon Dioxide Information Analysis Center, Oak Ridge
National Laboratory, U.S. Department of Energy, Oak Ridge, Tenn., U.S.A.,
2010.
Goldemberg, J., Lucon, O. Energy and environment in Brazil. ESTUDOS
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