1
Claudia Severo da Rosa
ESTUDO DO ÁCIDO HIALURÔNICO PROVENIENTE DA CRISTA DE
FRANGO: EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Tese apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciência dos Alimentos da
Universidade Federal de Santa Catarina
como requisito final para obtenção
do título de Doutor
Orientador: Prof. Dr. Luiz Henrique Beirão
Florianópolis, SC, BRASIL
2008
2
R788e
Rosa, Claudia Severo
Estudo do ácido hialurônico proveniente da crista de frango: extração,
purificação, caracterização e atividade antioxidante / Claudia Severo da
Rosa – Florianópolis, 2008.
106 p.
Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) – Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal de Santa Catarina, 2008.
Orientador: Luiz Henrique Beirão.
1. Cristas de frango. 2. Ácido hialurônico. 3. Extração. I. Título.
CDU 612.39
Ficha catalográfica elaborada por Maria Inez Figueiredo Figas CRB10/1612
3
Claudia Severo da Rosa
ESTUDO DO ÁCIDO HIALURÔNICO PROVENIENTE DA CRISTA DE
FRANGO: EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E
ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
Esta Tese foi julgada e aprovada para a
obtenção do título de Doutor em Ciência dos Alimentos
no Programa de Pós-Graduação em
Ciência dos Alimentos da
Universidade Federal de Santa Catarina
Florianópolis , 30 de junho de 2008.
Profa. Dra Marilde Bordignon Luiz
Coordenadora do Curso
BANCA EXAMINADORA
Prof. Luis Henrique Beirão, Dr.
Orientador
Prof. Milton Luiz Pinho Espírito Santo, Dr.
Profa. Maria Enói Santos Miranda, Dra
Prof. César Damian, Dr.
Prof. Pedro Luiz Manique Barreto, Dr.
4
Dedico este trabalho,
A minha família,
em especial ao meu esposo Leandro
e meus filhos Fábio e Juliana
por sempre estarem ao meu lado,
pelo amor e carinho de uma verdadeira família.
5
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Luiz Henrique Beirão, pela orientação e amizade.
Aos professores, Dr. Paulo Mourão e Dra. Ana Tovar do Laboratório de Tecido
Conjuntivo do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, pela acolhida, amizade e pela realização de parte das
análises.
Ao professor Dr. Pedro Barreto pelo auxílio na realização da massa molar, pela
atenção, apoio, colaboração e amizade todos esses anos.
Ao professor Dr. Ernesto Kubota pelo apoio sempre recebido.
A Professora Dra Solange Cristina Hoelzel pela amizade e ajuda na realização da
atividade antioxidante.
Ao professor Dr. Nelcindo Nascimento Terra, sempre pronto para compartilhar seus
conhecimentos.
Aos alunos de mestrado Ricardo Pereira, Jefferson Rotta, Lisandra e Débora pela
ajuda na realização das análises.
À Universidade Federal de Santa Maria e ao Departamento de Tecnologia e Ciência
dos Alimentos pela oportunidade oferecida.
Aos meus colegas de departamento pelo carinho e incentivo.
Aos meus pais Argemira (in memorian) e Oriente, pelo carinho e incentivo.
A Deus pela força e iluminação em minha vida.
6
RESUMO
ROSA, Claudia Severo da. Estudo do ácido hialurônico proveniente da crista de
frango: extração, purificação, caracterização e atividade antioxidante. 2008.
106 p. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) Programa de Pós-Graduação em
Ciência dos Alimentos, UFSC, 2008.
O ácido hialurônico (AH) é uma macromolécula com importância nas áreas médica,
farmacêutica e indústria de cosméticos. O AH é usado no tratamento de doenças
degenerativas e inflamatórias das articulações dos ossos, e na reposição do fluido
sinovial. O cordão umbilical e a crista de galo constituem uns dos tecidos mais ricos
neste polissacarídeo. Sendo o Brasil um dos principais exportadores de frango do
mundo, o aproveitamento das cristas dos animais abatidos para a obtenção de AH
se mostra particularmente atraente. Neste trabalho objetivou-se a extração,
purificação, caracterização e atividade antioxidante do AH proveniente da crista de
frango. Amostras secas e delipidadas foram submetidas à digestão proteolítica e
posteriormente à precipitação com cloreto de cetilpiridínio (CPC). A concentração de
glicosaminoglicanos na crista de frango foi de 14,9 µg de ácido hexurônico/mg de
tecido seco. O fracionamento através coluna de troca iônica e posterior identificação
dos picos por eletroforese em gel de agarose, mostrou que o AH corresponde a 90
% do total dos glicosaminoglicanos extraídos. Os 10 % restantes migram como
cadeias de sulfato de dermatana e sulfato de condroitina na eletroforese em gel de
agarose. A massa molar do ácido hialurônico extraído foi de 1,27 x 106 Da. A
espectroscopia de
13
C RMN da fração correspondente ao AH mostrou tratar-se de
amostra com razoável grau de pureza. O ácido hialurônico apresentou ótima
atividade para seqüestrar o radical DPPH, variando de 83,9 % na concentração de
10 µg/mL a 87,3 % na concentração de 500 µg/mL. Desta forma, as cristas de
frangos podem ser aproveitadas como fonte de ácido hialurônico pelas indústrias de
processamento de frangos.
Palavras-chave: cristas de frangos, ácido hialurônico, extração
7
ABSTRACT
ROSA, Claudia Severo da. Estudo do ácido hialurônico proveniente da crista de
frango: extração, purificação, caracterização e atividade antioxidante. 2008.
106 p. Tese (Doutorado em Ciência dos Alimentos) Programa de Pós-Graduação em
Ciência dos Alimentos, UFSC, 2008.
Hyaluronic acid (HA) is an important macromolecule in medical pharmaceutical and
cosmetic industries. HA is used in the treatment of degenerative and inflammatory
diseases of the joints and to replace synovial fluid. The umbilical cord and the
chicken crest are two of the richest tissues in this polysaccharide. As Brazil is one of
the main exporters of chicken in the world, the utilization of chicken crests from
slaughtered animals to obtain HA is a viable option. This study aimed to investigate
the extraction, purification, characterization and antioxidant activity of HA from
chicken crest. Dry and delipidated samples underwent proteolytic digestion followed
by precipitation with cetylpyridinium chloride (CPC). The glycosaminoglycane
concentration in the chicken crest was 14.9 µg of hexuronic acid/mg of dry tissue.
Fractioning within an ion exchange column and subsequent identification of peaks by
electrophoresis in agarose gel showed that HA corresponded to 90% of the total
glycosaminoglycane extracted. The remaining 10% migrated as dermatan sulphate
and chondroitin sulphate chains in the electrophoresis in agarose gel. The molar
mass of the hyaluronic acid extracted was 1.27 x 106 Da.
13
C NMR spectoscopy of
the HA fraction showed that the sample had a reasonable degree of purity.
Hyaluronic acid presented excellent electron withdrawing activity for the DPPH
radical, varying between 83.9 % in the concentration of 10 µg/mL to 87.3 % in the
concentration of 500 µg/mL. Thus, chicken crests could be utilized by the poultry
industry as a source of hyaluronic acid.
Keywords: Chicken crest, hyaluronic acid, extraction
8
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................18
1.2 Objetivos .......................................
21
1.2.1 Geral ............................................................................................
21
1.2.2 Específicos ................................................................................
21
1.3 Estrutura do trabalho ...................................................................................22
2 REVISÃO DA LITERATURA ...............................................................................24
2.1 Subprodutos de frango ...............................................................................24
2.2 Matriz extracelular .......................................................................................26
2.2.1 Glicosaminoglicanos.... ....................................................................... .....26
2.2.1.1 Ácido hialurônico ..................................................................................27
2.3 Fontes do ácido hialurônico .......................................................................29
2.3.1 Crista de galo ...........................................................................................29
2.3.2 Fermentação do ácido hialurônico por Streptococcus..............................31
2.3.3 Síntese do ácido hialurônico pelo sistema Chlorella-virus .......................32
2.4 Propriedades físico-químicas do ácido hialurônico ..................................33
2.4.1 Enzimas que causam hidrólise no ácido hialurônico ................................33
2.4.2
Destruição do ácido hialurônico
através
de
reação
de
oxidação-
redução ..............................................................................................................34
2.4.3 Hidrólise ácida do ácido hialurônico ........................................................35
2.5 Principais métodos de extração usados para isolar o ácido hialurônico. 35
2.5.1 Extração do ácido hialurônico da crista de galo com acetato de sódio .... 36
2.5.2 Extração do ácido hialurônico com água e enzimas da crista de galo ..... 36
2.5.3 Extração enzimática do ácido hialurônico da crista de galo ......................37
9
2.5.4 Extrações enzimáticas do ácido hialurônico de outras fontes ..................37
2.5.4.1 Ratos.....................................................................................................37
2.5.4.2 Moluscos ...............................................................................................38
2.6 Aplicações médicas do ácido hialurônico.................................................38
2.6.1 Oftalmologia .............................................................................................38
2.6.2 Osteoartrite ..............................................................................................39
2.6.3 Cartilagem................................................................................................41
2.6.4 Aplicações dérmicas ................................................................................42
2.7 Requerimentos para o ácido hialurônico ser usado na medicina ............44
2.8 Envelhecimento humano ............................................................................45
2.8.1 Cartilagem articular humana ...................................................................47
2.8.2 Osteoartrite .............................................................................................50
2.9 Caracterização do ácido hialurônico ...........................................................52
2.9.1 Massa Molar.............................................................................................52
2.10 Função biológica ........................................................................................55
2.10.1 Antioxidante ...........................................................................................55
2.10.2 Formação de radicais livres ...................................................................57
3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................59
3.1 Composição química da crista de frango....................................................59
3.2 Extração dos glicosaminoglicanos totais das cristas de frango .............60
3.3 Fracionamento dos glicosaminoglicanos na coluna Mono Q-FPLC ........ 62
3.3.1 Dosagem de ácido hexurônico (método de Carbazol) .............................64
3.4 Infravermelho ................................................................................................65
3.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN).....................65
3.6 Eletroforese em gel de agarose...................................................................66
10
3.7 Viscosidade intrínseca .................................................................................66
3.8 Massa molar ..................................................................................................67
3.9 Determinação da atividade antioxidante ....................................................68
3.9.1 Método de captação do radical DPPH (2,2 - difenil 1-picrilhidrazil)........... 68
3.10 Análise estatística.......................................................................................68
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES .........................................................................69
4.1 Composição química da crista de frango...................................................69
4.2
Precipitação dos GAGs totais com etanol, cloreto de cetilpiridínio e
metodologias testadas ........................................................................................70
4.2.1 Etanol ........................................................................................................70
4.2.2 Cloreto de cetilpiridínio.............................................................................71
4.2.3 Metodologias testadas no experimento....................................................72
4.4 Caracterização do ácido hialurônico .........................................................77
4.4.1 Identificação molecular do produto...........................................................77
4.4.2 Espectro de RMN 13C ..............................................................................80
4.4.3 Fracionamento dos GAGs extraídos por cromatografia de troca iônica .... 81
4.4.4 Eletroforese em gel de agarose ..............................................................85
4.4.5 Viscosidade intrínseca .............................................................................87
4.3.6 Massa Molar.............................................................................................89
4.5
Otimização
do método de extração de ácido hialurônico em escala
piloto .....................................................................................................................89
4.5.1 Processo de extração...............................................................................90
4.5.2 Evidências................................................................................................90
4.6 Atividade antioxidante..................................................................................91
11
5 CONCLUSÕES
5.1 Sugestões para trabalhos futuros
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
94
95
96
12
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estruturação do texto. ...............................................................................22
Figura 2 - Fórmula molecular da unidade repetitiva dissacarídica do ácido
hialurônico, formada por ácido D-glicurônico (GlcUA) e N-acetilglicosamina
(GlcNAc). Polímero linear formado por N-unidades repetitivas dissacarídicas
(OGRODOWSKI, 2006, p. 6). ............................................................................28
Figura 3 - Biossíntese do ácido hialurônico por Streptococcus (YAMADA;
KAWASAKI, 2005). ............................................................................................32
Figura 4 - Processo de extração de GAGs (Desenho: Jardel Thalhofer, 2007). .......62
Figura 5 - Fracionamento e quantificação de GAGs (Desenho: Jardel Thalhofer,
2007). .................................................................................................................63
Figura 6 - Perfil eletroforético em gel de agarose de extratos de ácido hialurônico de
cristas de frangos: (P) padrão de AH; (1) ppt. Inicial etanol + CPC tecido fresco;
(2) ppt. CPC pó cetônico; (3) ppt. Inicial tecido fresco; (4) CPC tecido fresco; (5)
CPC tecido fresco ppt. após diluição 3x.............................................................73
Figura 7 - Perfil eletroforético em gel de agarose de extratos de ácido hialurônico de
cristas de frangos: (P) padrão de AH; (1) ppt. Inicial etanol + CPC tecido fresco;
(2) ppt. CPC pó cetônico; (3) ppt. Inicial tecido fresco; (4) CPC tecido fresco; (5)
CPC tecido fresco ppt. após diluição 3x.............................................................74
Figura 8 - Espectro de infravermelho do (a) ácido hialurônico padrão, (b) ácido
hialurônico extraído – transmitância versus número de onda (cm-1). .................79
Figura 9 - Numeração adotada para atribuição dos sinais de RMN de 13C...............80
Figura 10 - Espectro de RMN 13C {H} a 100 MHz do ácido hialurônico em D-2O......82
13
Figura 11 - Espectro de RMN
13
C {H} a 100 MHz mostrando a expansão do ácido
hialurônico em D-2O. ..........................................................................................83
Figura 12 - Fracionamento dos GAGs extraídos da crista de frango por cromatografia
de troca-iônica. Amostra de GAG total ( ~ 500 µg em ácido hexurônico) foi
aplicada em coluna Mono Q-FPLC, previamente equilibrada com tampão TrisHCl 20 mM, pH 8,0. A coluna foi submetida a um gradiente linear de NaCl (0 a
1,5 M), com fluxo de 1 mL/min, e coletadas alíquotas de 0,5 mL. As frações
foram
analisadas
quanto à metacromasia (•) e conteúdo de ácido
hexurônico(ο) ...................................................................................................84
Figura 13 - Eletroforese em gel de agarose do GAG total e das frações obtidas na
cromatografia de troca iônica. Coloração com azul de toluidina. P- Padrão, A1 GAG total, A2 - Fração I, A3 - Fração II da coluna de troca iônica, sulfato de
condroitina , sulfato de dermatana. ....................................................................86
Figura 14 - Eletroforese em gel de agarose do GAG total e das frações obtidas na
cromatografia de troca iônica. Coloração com azul de toluidina e Stains-All. P Padrão, A1 - GAG total, A2 - Fração I, A3 - Fração II da coluna de troca iônica,
sulfato de condroitina, sulfato de dermatana......................................................87
Figura 15 - Viscosidade reduzida versus a concentração de AH extraído da crista de
frango. ................................................................................................................88
Figura 16 - Capacidade de seqüestrar radicais livres do ácido hialurônico, extraído
da crista de frango e do ácido hialurônico padrão.............................................92
14
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Métodos, etanol e cloreto de cetilpiridínio, testados para precipitar os
GAGs e rendimento em ácido hexurônico ................................................................72
15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Equações para construção do gráfico da viscosidade intrínseca ............67
Tabela 2 - Composição química da crista de frango .................................................69
Tabela 3 - Rendimento e concentração de ácido hexurônico na crista de frango
obtidos a partir de duas metodologias testadas .................................................75
Tabela 4 - Viscosidade reduzida para solução de AH extraída da crista de frango .. 87
16
LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS
ABEF - Associação Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frangos
AFA - Associação Fluminense de Avicultura
cm - centímetro
CPC - cloreto de cetilpiridínio
CV - coeficiente de variação
E - constante dielétrica
Da - Dalton
DMB - azul de dimetilmetileno
FAO - Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação
FDA - Food and Drug Administration
g – grama ou força da gravidade
GAGs - glicosaminoglicanos
h - hora
AH - ácido hialurônico
Hz - Hertz
l - litro
M - molar
mA - mili Ampère
MDa – milhões de Dalton
mg - miligrama
MHz - megahertz
min - minuto
mL - mililitro
17
mM - milimolar
nm - nanômetro
ONU - Organização das Nações Unidas
ppm - parte por milhão
RMN - Ressonância Magnética Nuclear
rpm - rotações por minuto
s - segundo
SC – sulfato de condroitina
SD – sulfato de dermatana
UBA - União Brasileira de Avicultura
V - volt
µg - micrograma
µs - microsegundo
1 INTRODUÇÃO
A avicultura industrial é uma das atividades agrícolas mais desenvolvidas no
mundo. Impulsionada, sobretudo pela necessidade de utilização de proteína de
origem animal na dieta humana, a produção avícola no Brasil representa uma das
mais importantes cadeias produtivas. Em 2002, a produção brasileira de carne de
frango foi de 7,449 milhões de toneladas, o que representa um crescimento de 13,5
% em relação a 2001 (NUNES et al., 2005). Em 2007 foram produzidos 8,988
milhões de toneladas de carne de frango (IBGE, 2008).
Entre os países que se destacam no setor, o Brasil ocupa o terceiro lugar no
mercado mundial de produção de carne de frango. Para que o setor mantenha o
sucesso, é preciso investir em produtividade a baixo custo. Além disso, é necessária
atenção
especial
à
questão
ambiental,
destacando-se
a
importância
do
aproveitamento dos resíduos da indústria avícola.
Duas classes de subprodutos são gerados antes e durante o abate: os
sólidos e os líquidos. Na primeira classe encontram-se: penas, vísceras e órgãos
crus, cabeças, pés, peles, gorduras, ossos, resíduos de cama de aviário, restos de
carcaças reprovados para o consumo. Na classe dos resíduos líquidos listam-se:
sangue, e efluentes líquidos. Os grandes frigoríficos, em geral, possuem unidades
industriais que recebem esses subprodutos e os transformam em farinhas. Desde
que se tornaram proibidas a adição de matéria-prima animal na composição de
rações, devido aos riscos de transmissão de doenças ao homem, as farinhas dos
resíduos do abate de aves e suínos passam a destinar-se prioritariamente à
produção de rações para cães e gatos (pet-food) (VEGRO; ROCHA, 2007).
19
A crista de frango é rica em ácido hialurônico e sendo
um resíduo
é
desprezada juntamente com a cabeça para a graxaria. O ácido hialurônico possui
importantes aplicações nas áreas médico-farmacêutica e cosmética. É usado no
tratamento de doenças degenerativas e inflamatórias das articulações dos ossos, na
reposição do fluído sinovial, na liberação de agentes quimioterápicos em implantes
cirúrgicos, como meio hidratante e como sistema para encapsulação e liberação
controlada de fármacos e cosméticos.
A osteoartrite é uma doença degenerativa inflamatória das articulações
móveis
caracterizadas
pela
deterioração
da
cartilagem
articular
e
pela
neoformação óssea nas superfícies e margens articulares, inabilitando a reparação
e a manutenção das juntas. Como conseqüência, ocorre uma degradação da
cartilagem, erosão dos ligamentos e eventual perda das funções mecânicas,
envolvendo nestes casos dores crônicas. Esta desordem também é conhecida
como doença articular degenerativa. A osteoartrite atinge praticamente todo
indivíduo com idade superior a 60 anos, embora algumas vezes os sintomas sejam
bastante moderados, a ponto de serem quase imperceptíveis.
O fenômeno da longevidade, tanto no Brasil como nos demais países do
mundo, foi alavancado pelas mudanças nos estilos de vida. A participação de
fatores ambientais, os processos tecnológicos e científicos desenvolvidos na
medicina, associados à melhora nas condições socioeconômicas mesmo nos
países em desenvolvimento, foram e permanecem sendo os fatores determinantes
de aumento de expectativa de vida.
O aumento acentuado do número de idosos, particularmente nos países
em desenvolvimento, como o Brasil, trouxe diversas conseqüências para a
sociedade. A população idosa brasileira está mais sujeita à problemas de saúde,
20
com o surgimento de enfermidades crônicas que acarretam baixa letalidade e, às
vezes alto grau de incapacidade como é o caso da osteoartrite.
O uso da viscosuplementação através da injeção de ácido hialurônico com
o intuito de restaurar ou de aumentar as propriedades reológicas do líquido
sinovial, amenizar os sintomas da osteoartrite e pode inibir a degeneração da
cartilagem articular, pela via anabólica dos condrócitos e pela lavagem da
articulação de radicais livres.
A injeção intra-articular de ácido hialurônico demonstrou eficácia e
segurança no tratamento da osteoartrose do joelho. Entretanto, cada ácido
hialurônico presente no mercado é distinto conforme a forma de fabricação, massa
molar, concentração e método de tratamento.
O Brasil sendo um dos principais produtores e exportadores de frangos, gera
um grande número de resíduos. As principais fontes comerciais do AH são o cordão
umbilical e a de crista de galo. O produto extraído dessas fontes necessita de
purificação laboriosa para a sua utilização nas áreas médico-farmacêutica. O grande
número de cristas que são desprezadas e os vários métodos de extração que
diminuem a massa molar do ácido hialurônico aliado ao aumento da expectativa de
vida pelos idosos que possuem osteoartrite, motivaram a realização deste trabalho.
A massa molar do AH tem sido considerada a propriedade mais importante
nas aplicações médicas que envolvem principalmente implantes ósseos, para as
quais não só são requeridos os efeitos de amortecimento devidos à viscosidade.
Ressalta-se que o AH de alta massa molar, da ordem de 106 Da, possui alto valor
agregado (US$ 65,00/100mL), e não é produzido comercialmente no Brasil
(OGRODOWSKI, 2006).
21
1.2 Objetivos
1.2.1 Geral
Extrair e caracterizar o ácido hialurônico da crista de frango
1.2.2 Específicos
a) Aproveitar resíduos das indústrias de abate e processamento de aves;
b) Extrair o ácido hialurônico do meio através de precipitação;
c) Testar metodologias de extração para o ácido hialurônico;
d) Caracterizar o ácido hialurônico extraído da crista de frango;
e) Adequar à metodologia de extração em escala piloto;
f) Determinar a atividade antioxidante do ácido hialurônico extraído da crista de
frango.
22
1.3 Estrutura do trabalho
Este texto foi estruturado em cinco capítulos, conforme expõe a Figura 1.
INTRODUÇÃO
Proposta de estudo
Justificativa
Objetivos
REVISÃO
BIBLIOGRÁFICA
Subprodutos de frango
Ácido hialurônico
Fontes de ácido hialurônico
Envelhecimento humano
Usos na medicina
Função biológica
MATERIAL E
MÉTODOS
Amostra
Metodologias de extração
Metodologias para caracterização
RESULTADOS E
DISCUSSÕES
Análises dos dados
Otimização do método em escala piloto
CONCLUSÕES
Resultados
Sugestões para novos trabalhos
REFERÊNCIAS
Figura 1 - Estruturação do texto.
23
Neste primeiro capítulo são apresentadas as considerações introdutórias,
que envolvem a caracterização da proposta de estudo, a justificativa e os objetivos
da pesquisa.
No segundo capítulo é apresentada uma revisão bibliográfica, expondo as
bases teóricas da pesquisa, englobando uma explanação a cerca dos subprodutos
da industrialização do frango, a caracterização do ácido hialurônico e suas fontes, o
processo de envelhecimento humano, usos na medicina e função biológica do ácido
hialurônico.
O terceiro capítulo apresenta considerações sobre a metodologia usada para
o desenvolvimento da pesquisa, caracterização da amostra, metodologias para
extração e caracterização.
O quarto capítulo trata na íntegra dos resultados e discussões, onde são
apresentados a análise dos dados obtidos e uma otimização do método usado em
escala piloto.
O quinto e último capítulo, apresenta as conclusões sobre a pesquisa, além
de sugestões para novos trabalhos. Ao final, é listado o referencial bibliográfico
consultado.
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Subprodutos de frango
A carne de frango é a segunda mais consumida no mundo e a que mais
cresce em produção e consumo. Segundo a FAO (Organização das Nações Unidas
para Agricultura e Alimentação), o consumo médio mundial é de 11 kg/hab/ano,
sendo Hong Kong o maior consumidor per capita de carne de frango (50,4
kg/habitante em 2003). O Brasil é o quarto colocado, com um consumo per capita de
35 kg/ano quase se igualando à quantidade consumida de carne bovina, superando
o consumo de países como o Canadá, com renda per capita maior que a do Brasil
(GIROTTO; MIELE, 2004).
Nos últimos vinte e cinco anos, seu índice de crescimento foi superior a 200
%, muito acima das demais carnes. O Brasil é o terceiro produtor mundial de carne
de frango. Até 1998, Santa Catarina era o estado que mais produzia, mas
atualmente o Paraná é o maior produtor. A avicultura brasileira tem crescido muito,
com destaque para o Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e São Paulo
(OLIVO; OLIVO, 2006).
As exportações de carne de frango ganham espaço a cada ano. Em 2004, o
Brasil ultrapassou os Estados Unidos, assumindo a condição de maior exportador.
Mais de 60 % desse volume exportado são cortes, que demandam mão-de-obra,
com isso exportando-se mais serviços. Segundo dados da UBA (União Brasileira de
Avicultura) e ABEF (Associação Brasileira dos Produtores e Exportadores de
Frangos), no ano de 2005 foram abatidos 17.566.405 cabeças/dia de frangos no
25
Brasil os quais geram um número muito grande de subprodutos e resíduos de
abatedouro (OLIVO; OLIVO, 2006).
A indústria cárnea norte americana considera que qualquer produto de um
animal que não seja estritamente a carcaça limpa é um subproduto. O rendimento
dos subprodutos comestíveis oscila entre 20 e 30 % do peso vivo para bovinos,
suínos e ovinos e de 5 a 6 % para aves (OCKERMAN; HANSEN,1994).
Existem vários subprodutos que são considerados resíduos e que na maioria
dos casos são usados para a fabricação de farinha para a alimentação animal. Mas
parte deste resíduo pode ser usado para recuperação de proteína, para elaboração
de concentrados protéicos, para incorporação na alimentação humana e também
para outros fins inclusive na indústria de medicamentos (ROQUE, 1996).
O surgimento das graxarias ocorreu com a finalidade de favorecer o
aproveitamento dos subprodutos gerados no abate de animais (penas, vísceras e
demais resíduos), que anteriormente eram simplesmente jogados em rios ou
enterrados, fabricando farinhas que são incorporadas a outros farelos na produção
de rações para alimentação animal. Neste caso ganham as empresas, a economia e
a sociedade, considerando o respeito ao meio ambiente e ao crescimento
sustentável. No Brasil, a farinha obtida nas graxarias tem seu principal uso na
produção de rações para aves. No início de 2006, a gripe aviária trouxe
preocupação ao setor de graxarias devido à redução do consumo de seus produtos
no uso da produção de ração para alimentação de frangos. Isto gerou uma elevação
nos estoques, principalmente das farinhas, gerando uma indesejável retenção
adicional de materiais gerados pelos abatedouros e frigoríficos. Pesquisas têm
buscado formas alternativas de aproveitamento destes subprodutos e resíduos
(PACHECO, 2006).
26
2.2 Matriz extracelular
A matriz extracelular é composta por uma complexa rede de macromoléculas
que ocupa um considerável volume no espaço extracelular. Essa matriz é composta
por várias proteínas versáteis e polissacarídeos que são secretados e montados em
uma rede organizada associada à superfície celular que os produz. As
macromoléculas que compõem a matriz extracelular são principalmente produzidas
localmente pelas células da matriz. Na maioria dos tecidos conjuntivos, as
macromoléculas da matriz são secretadas nos fibroblastos. As classes principais de
macromoléculas extracelulares que formam a matriz são: (1) cadeias de
polissacarídeos da classe chamados glicosaminoglicanos (GAGs), e (2) proteínas
fibrosas de dois tipos funcionais: predominantemente estruturais (colágeno e
elastina) e predominantemente adesivas (fibronectina e laminina) (ALBERTS, et al.,
1997).
2.2.1 Glicosaminoglicanos
Os glicosaminoglicanos são cadeias polissacarídicas não-ramificadas,
compostas de unidades repetidas de dissacarídeos. São chamados GAGs porque
um dos dois açúcares do dissacarídeo repetido sempre é um açúcar aminado (Nacetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina) e normalmente sulfatado. O segundo
açúcar, normalmente é um ácido urônico (glicurônico ou idurônico). Devido aos
grupos sulfato e carboxila, os GAGs são carregados negativamente. Estão divididos
em quatro grupos principais de acordo com a molécula do açúcar, o tipo de ligação
27
entre eles e o número e a localização dos grupos sulfato: (1) ácido hialurônico, (2)
sulfato de condroitina e sulfato de dermatana, (3) sulfato de heparana e (4) sulfato
de queratana (GARTNER; HIATT, 2003).
2.2.1.1 Ácido hialurônico
O ácido hialurônico é um membro da família dos glicosaminoglicanos, e está
presente na substância fundamental ou cimento intercelular dos tecidos animais e
nas cápsulas de certas bactérias (OGRODOWSKI, 2006).
O ácido hialurônico é um copolímero de N-acetilglicosamina e ácido
glicurônico, mas diferentemente dos outros quatro tipos de glicosaminoglicanos. Não
é
sulfatado,
não
está
ligado
covalentemente
à
proteína
e
é
o
único
glicosaminoglicano não limitado a tecidos animais. É classificado como um
glicosaminoglicano devido as suas similaridades estruturais com os demais
polímeros, uma vez que é constituído exclusivamente por unidades dissacarídicas
repetidas contendo N-acetilglicosamina e ácido D-glicurônico (Figura 2). Embora o
ácido hialurônico tenha a estrutura química menos complexa de todos os
glicosaminoglicanos, as cadeias podem atingir massas molares de 105 – 107 Da. A
alta massa molar, o caráter polieletrolítico e o grande volume que ocupa em solução
contribuem para as propriedades do ácido hialurônico como lubrificante e para
absorver choques. O ácido hialurônico é um polissacarídeo polianiônico e quando
incorporado em uma solução aquosa neutra ocorrem ligações por pontes de
hidrogênio entre as moléculas de água e os grupos carboxila e N-acetil, conferindo
ao polímero capacidade de absorver água e dureza conformacional, que limita sua
flexibilidade (CHONG; BLANK, 1998).
28
A
solução
de
ácido
hialurônico
tem
consistência
gelatinosa,
alta
viscoelasticidade e alto grau de hidratação devido às características estruturais da
molécula. Este ácido está presente em vários tecidos conectivos de animais,
preenchendo os espaços intercelulares, tais como a pele e a cartilagem com
importante função de flexibilidade e manutenção da estrutura dos tecidos. Na pele e
em cartilagens, a sua função é ligar-se à água e reter a tonicidade e elasticidade dos
tecidos. Nos fluídos das articulações, serve como lubrificante proporcionando um
meio protetor para as células (KIM et al., 1996).
CH2OH
O
CH2OH
GlcNAc
COO
O
O
GlcNAc
COO
O
4
GlcUA
O
1
O
4
3
O
1
GlcUA
1
1
O
3
NHCOCH3
NHCOCH3
ÁCIDO HIALURÔNICO
Figura 2 – Fórmula molecular da unidade repetitiva dissacarídica do ácido
hialurônico, formada por ácido D-glicurônico (GlcUA) e N-acetilglicosamina (GlcNAc).
Polímero linear formado por N-unidades repetitivas dissacarídicas (OGRODOWSKI,
2006, p. 6).
29
2.3 Fontes do ácido hialurônico
O ácido hialurônico foi isolado primeiramente na forma de ácido, mas em
condições fisiológicas se comporta como um sal. O nome do ácido deriva de hialóide
(vitreous) mais ácido urônico (YAMADA; KAWASAKI, 2005).
O termo hialuronana foi introduzido em 1986 para ficar em conformidade
com a nomenclatura internacional de polissacarídeos (LAURENT, 2002). Encontrado
naturalmente nos tecidos conjuntivos de mamíferos, o ácido hialurônico pode ser
extraído do fluído sinovial, pele, tendões e particularmente do corpo vítreo dos olhos,
e
do cordão umbilical, outra fonte rica é a
crista de galo. O ácido hialurônico
disponível comercialmente é suprido prioritariamente pelas duas últimas fontes. No
entanto, a obtenção do ácido puro a partir dessas fontes naturais apresenta algumas
desvantagens: necessidade de purificação laboriosa, uma vez que esse produto
encontra-se usualmente misturado com outros mucopolissacarídeos e proteínas, e
redução da sua massa molar, devido à degradação das suas cadeias nos
procedimentos complexos requeridos para a purificação (OGRODOWSKI, 2006).
2.3.1 Crista de galo
Estudos mostram que o ácido hialurônico está presente na crista de galo em
quantidades significativas. Os polissacarídeos isolados das cristas sem o epitélio,
consistem de ácido hialurônico e sulfato de condroitina na proporção de 15:1. Em
1958, Balazs e Szirmai encontraram em polissacarídeos isolados da camada
mucóide da crista quase que somente ácido hialurônico. A galactosamina estava
presente em sua extensão em quantidade menor que 0,1 % do total de hexosamina.
30
Pesquisas mostram que o ácido hialurônico e polissacarídeos sulfatados não estão
distribuídos homogeneamente entre as diferentes estruturas anatômicas da crista.
Evidências histoquímicas indicam que os mucopolissacarídeos estão presentes na
derme, camada mucóide da crista, camada reticular e epitélio (SZIRMAI, 1956;
DOYLE; SZIRMAI, 1961; SWANN, 1968a).
O tecido conectivo da crista é um dos tecidos em que a característica da
substância amorfa depende da presença de hormônios. O tamanho e a estrutura da
crista são controlados por hormônios. O intumescimento da derme do tecido
conectivo da crista e a acumulação do material interfibrilar podem ser observados
com a administração de hormônio em pintos ou galos. Em um estudo de distribuição
do C14 em cristas de galo juntamente com administração de testosterona mostrou
que o tratamento com hormônio teve um significativo aumento na incorporação do
C14 em várias partes da crista. A atividade específica do carbono na crista, fígado e
córnea diferem, e é dependente de qual precursor é administrado: glicose-6-C14,
glicose-1-C14 ou glicuronolactona U-C14. Altos valores foram obtidos após a
administração de glicose-6-C14. O ensaio mostra que a atividade foi maior na
camada mucóide. Trabalhos anteriores sugerem que o tratamento com hormônio
aumenta a taxa de formação de ácido hialurônico no tecido da crista (BALAZS et al.,
1958).
Mais de 90 % do ácido hialurônico presente na crista possui massa molar de
1,2 x 106 Da e quando extraído da camada mucóide, livre de outros tecidos e
sangue, possui alta viscosidade. A crista de galo é uma parte especializada da pele
e possui grande quantidade de ácido hialurônico (acima de 7,5 mg/mL). A produção
industrial do ácido provém da extração da crista de galo. O ácido presente em
31
tecidos animais está complexado com proteoglicanas e isso dificulta a obtenção de
um material de alto grau de pureza (YAMADA; KAWASAKI, 2005).
2.3.2 Fermentação do ácido hialurônico por Streptococcus
Com o crescente estudo da produção do ácido hialurônico a partir de
bactérias e a desvantagem do processo industrial, o segmento industrial tem
investido na fermentação bacteriana, pois neste processo o ácido hialurônico obtido
é um polissacarídeo extracelular. É secretado no meio de cultivo possibilitando o
controle das características do polímero e do rendimento do produto (CHONG;
BLANK, 1998, OGRODOWSKI, 2006).
Para a síntese do ácido hialurônico capsular no Streptococcus, as células
bacterianas
mobilizam
três
diferentes
enzimas:
HAS
(has
A),
UDP-Glc
desidrogenase (has B) e UDP-Glc pirofosforilase (has C). Essas três enzimas são
envolvidas por 3 diferentes genes: has A, has B, has C respectivamente, todos os
quais estão organizados na operação. A UDP-Glc desidrogenase é requerida para
fazer UDP-Glc A, um dos dois substratos requeridos para a síntese da hialuronana.
A UDP-Glc pirofosforilase é uma enzima que produz UDP-Glc de UTP e Glc-1fosfato, Yamada e Kawasaki, (2005), conforme pode ser visto na Figura 3.
32
Glicólise
PENTOSE
FOSFATO
Glicose
Fosfoglicoimerase
Glicoquidase
Glc-6-P
Fosfoglicomutase
ATP ADP
Polissacarídeos da
parede celular
Glc-1-P
PPi
UDP-Glc
2 NAD + H
+
Mutase
GlcNAc-1-P
UDP-GlcA
UDP
Acetil-CoA
Acetiltransferase
CoASH
GlcNAc-6-P
UDP-glicose
desidrogenase
hasB
+
2NAD
Glutamina
Amidotransferase
Glutamato
GlcN-6-P
UDP-glicose
pirofosforilase
hasC
UTP
Ácido
Teicoico
Frc-6-P
Hialuronato
sintetase hasA
ÁCIDO HIALURÔNICO
UTP
Pirofoforilase
PPi
UDP-GlcNAc
UDP
PEPTÍDIOGLICANO
Figura 3 -
Biossíntese do ácido hialurônico por Streptococcus (YAMADA;
KAWASAKI, 2005).
2.3.3 Síntese do ácido hialurônico pelo sistema Chlorella-vírus
O sistema chlorella-vírus é um novo sistema de síntese de ácido hialurônico
recentemente descoberto por (DeANGELIS et al., 1997). Foi descoberto um gen do
vírus PBCV-1 (ORFs A100R) capaz de expressar as enzimas HAS, UDP-Glc
desidrogenase e a GFAT (glutamina frutose-6-fosfato aminotransferase) requeridas
para a síntese do ácido hialurônico em células animais. O gen do vírus PBCV-1
replica o material genético na clorela (alga verde rica em proteínas e minerais) e o
AH é sintetizado na parede da alga infectada após 30 min da infecção viral e
continua a acumulação até 4 horas.
33
A síntese do AH pelo sistema clorela-vírus inicia-se com a infecção viral onde
os genes do HAS bem como GFAT e UDP-Glc desidrogenase são expressos e
aparecem as fibras de AH na superfície da clorela infectada. No final do estágio da
infecção viral as células infectadas são mortas e o AH deve ser retirado. Segundo
Yamada e Kawasaki, (2005), aproximadamente 0,5 – 1 g de hialuronana pode ser
recuperado de 1 litro de cultura de células de Chlorella infectadas com o chlorovirus.
O rendimento é baixo quando comparado com a fermentação por Streptococcus
(usualmente mais de 5 -10 g/l).
2.4 Propriedades físico-químicas do ácido hialurônico
2.4.1 Enzimas que causam hidrólise no ácido hialurônico
A quebra das ligações no ácido hialurônico ocorre por ação de
hialuronidases que estão presentes na membrana de bactérias patogênicas,
secreções salivares de sanguessugas, esperma, toxina de cobra. Dependendo do
mecanismo de ação, três tipos de hialuronidases são descritas. A do tipo I
compreende as hialuronidases testiculares (do esperma, toxina de escorpião e
cobra) quebram o ácido hialurônico hidrolisando a ligação β – (1-4), liberando uma
série de oligossacarídeos, razão pela qual ocorre a diminuição da reação com
decréscimo do comprimento da cadeia do ácido. A do tipo II compreende a
hialuronidase bacteriana que também quebra a ligação β – (1-4) do ácido, ocorre a
hidrólise intramolecular com a separação de água, como resultado ocorre a
formação de dissacarídeos insaturados. A hialuronidase do tipo III provém de
sanguessugas esta enzima quebra a ligação β – (1-3) como resultado ocorre a
34
formação de tetrassacarídeos com ácido glicurônico e o fim da cadeia. Para evitar a
hidrólise descontrolada é recomendado que o ácido hialurônico deva ser isolado em
presença de clorofórmio a baixa temperatura (GIBIAN, 1966; IGNATOVA; GUROV,
1990).
2.4.2 Destruição do ácido hialurônico através de reação de oxidação-redução
O ácido hialurônico é degradado sob a influência de um sistema de
oxidação-redução. No corpo vítreo o ácido é decomposto por ação de ácido
ascórbico, os oligossacarídeos formados não são reconvertidos assim como no caso
da ação das hialuronidases. A reação se dá em alta velocidade em presença do
peróxido de hidrogênio ou traços de cobre e somente ocorre em presença de
oxigênio. O peróxido de hidrogênio causa a diminuição da massa molecular do ácido
hialurônico, causando também a diminuição da viscosidade da solução (IGNATOVA;
GUROV, 1990).
A quebra do ácido por ação de oxidação-redução em um sistema continua
pelo mecanismo de radical livre. Os radicais livres são formados do ácido ascórbico
na reação com ácido hialurônico e peróxido de hidrogênio na presença de
peroxidase, bem como na reação com oxigênio na presença de ácido ascórbico
oxidase. Verificou-se também que o ácido hialurônico é decomposto por ação de
íons Fe2+ ou Fe3+ na presença de agentes redutores. A destruição do ácido
hialurônico por oxidação-redução pode ocorrer no isolamento do polissacarídeo. O
ácido quando preparado em atmosfera de nitrogênio possui alta viscosidade ao
contrário do preparado em presença de oxigênio. A despolimerização por oxidaçãoredução catalisada por metais também pode ocorrer no processo de isolamento do
35
ácido hialurônico. Quando o ácido for purificado de proteínas usando a tripsina
contendo íons Fe3+ pode-se inibir a diminuição da viscosidade da solução usando a
8 – hidroxiquinolina. Quando for usada a papaína na purificação do ácido, devido a
quebra dos complexos com proteínas esses também diminuem a viscosidade, uma
vez que a SH- enzima papaína é um agente redutor e induz a quebra do ácido
(SUNDBLAD; BALAZS, 1966; IGNATOVA; GUROV,1990).
2.4.3 Hidrólise ácida do ácido hialurônico
O ácido hialurônico é uma macromolécula muito sensível ao pH do meio.
Uma acidificação fraca do extrato com ácido acético causa uma diminuição
irreversível na viscosidade. O ácido hialurônico é completamente hidrolisado por
ácidos minerais com formação de glicosaminas, ácido acético, dióxido de carbono e
ácido glicurônico (IGNATOVA; GUROV, 1990).
2.5 Principais métodos de extração usados para isolar o ácido hialurônico
O ácido hialurônico foi isolado pela primeira vez, em 1934 por Karl Meyer e
John Palmer trabalhando no laboratório de bioquímica do departamento de
oftalmologia da Universidade de Columbia, do corpo vítreo dos bovinos com uma
extração aquosa - acetona (MEYER; PALMER, 1934). No mesmo ano foi isolado do
cordão umbilical com uma extração aquosa - clorofórmio. Kendall (1937) foi o
primeiro a isolar o ácido hialurônico de Streptococcus hemolitico dos grupos A e B. O
ácido hialurônico foi isolado pela primeira vez da crista de galo por Boas (1949) a
extração foi feita com acetato de sódio. Até o presente momento diferentes métodos,
36
com várias formas de extração, hidrólise enzimática, fracionamento, dentre outros,
são aplicados.
A quebra, diminuindo as estruturas dos tecidos, é alcançada por
aglomeração, homogeneização e outros procedimentos para garantir o máximo
contato com a solução extratora. A quebra, diminuindo a estrutura celular, é
usualmente conseguida com o uso de enzimas e solventes orgânicos. A liberação do
ácido hialurônico do complexo com outros polissacarídeos e proteínas são
conseguidos com o uso de enzimas e detergentes (IGNATOVA; GUROV, 1990).
As metodologias a seguir são apresentadas resumidamente.
2.5.1 Extração do ácido hialurônico da crista de galo com acetato de sódio
Boas (1949) trabalhou com cristas de galos obtidas após 4 horas do
sacrifício. As cristas foram trituradas, desidratadas e delipidadas com acetona. O
material seco foi extraído com solução de acetato de sódio a 5 % (1L) várias vezes
em intervalos de 24 h. O resíduo das cristas foi descartado e adicionado 1,5 volumes
de álcool etílico ao sobrenadante, o precipitado formado foi redissolvido em solução
de acetato de sódio a 5 % e a proteína retirada com clorofórmio-álcool amílico. A
solução final foi acidificada e precipitada com álcool etílico, e o material foi seco.
2.5.2 Extração do ácido hialurônico com água e enzima da crista de galo
Swann (1968a) também trabalhou com cristas obtidas logo após o abate. As
cristas foram delipidadas e secas, primeiramente foram trituradas e imersas em água
por 48 h, após centrifugadas e o sobrenadante foi precipitado com 3 volumes de
37
etanol a 95 % para precipitar o AH (fração I). Seguiu-se uma nova trituração e
imersão em água novamente por 3 dias nesta etapa não houve precipitação do AH
(fração II). O resíduo obtido das extrações anteriores foi suspenso em tampão Tris,
pH 8,0 e digerido com pronase. Três volumes de etanol foram adicionados ao
sobrenadante e o precipitado recolhido (fração III). Porções destes materiais foram
coletadas para purificação.
2.5.3 Extração enzimática do ácido hialurônico da crista de galo
Nakano, Nakano e Sim (1994) trabalharam com cristas de animais de 52
semanas. As cristas foram desidratadas, delipidadas e secas. O material seco foi
digerido com papaína (4µg/mg de tecido seco) em solução tampão fosfato a pH 6,5
por 4 h. O sobrenadante foi dialisado por 24 h, e após precipitado com 4 volumes de
etanol.
2.5.4 Extrações enzimáticas do ácido hialurônico de outras fontes
2.5.4.1 Ratos
Volpi;
Maccari
e
Titze
(2005)
obtiveram
AH
de
pele
de
ratos.
Aproximadamente 1 g de pele de ratos (14 semanas) foi triturada e digerida com
pronase K em solução tampão Tris por 12 h. Após a centrifugação a precipitação do
AH foi feita com adição de acetona ao sobrenadante.
38
2.5.4.2 Moluscos
Volpi e Maccari (2003) extraíram AH de moluscos usando extração
enzimática. Partiram de 28 g de moluscos triturados, desidratados e delipidados com
acetona, o material seco foi hidratado em solução tampão de acetato de sódio
contendo EDTA e cisteína e foi juntado a esta solução 100 mg/g de tecido seco de
papaína, a digestão foi realizada a 60oC / 24 h. Após a mistura foi centrifugada e 3
volumes de etanol saturado com acetato de sódio foi adicionado ao sobrenadante. O
precipitado foi recuperado e seco a 60oC por 6 h.
2.6 Aplicações médicas do ácido hialurônico
A fisiologia, a massa molar e a concentração do ácido hialurônico
determinam as propriedades reológicas de alta viscosidade. Esses atributos são
responsáveis pela função estrutural do ácido hialurônico como um constituinte
macromolecular primário do tecido conectivo da matriz extracelular, lubrificante com
propriedade de amortecer o fluído sinovial no sistema músculo esquelético e do
corpo vítreo (GOA; BENFIELD, 1994).
2.6.1 Oftalmologia
No homem, o ácido hialurônico representa 10 % do peso vítreo. A
concentração desse ácido varia com a distribuição topográfica (menor na parte
anterior que na posterior) e com a idade. No adulto, a concentração é calculada
aproximadamente em 240 µg/mL, e na criança em 33 µg/mL. A molécula do ácido
39
hialurônico forma uma rede tridimensional e adota uma configuração em mola,
impedindo desse modo, a penetração de outras moléculas grandes no vítreo e
mantendo sua transparência (NASSARALLA JUNIOR, 2004).
O ácido hialurônico (polianiônico) apresenta-se numa configuração aleatória
em pH fisiológico. Quando possui alta massa molar essas cadeias ao acaso podem
se entrelaçar para formar um gel viscoelástico. A alta viscosidade do ácido
hialurônico com baixa taxa de cisalhamento, permite a manipulação em tecidos
oftalmológicos, a manutenção da profundidade e formação do espaço anterior.
Entretanto a baixa viscosidade e alta força de cisalhamento facilitam a injeção. A
elasticidade do ácido hialurônico, que se intensifica com o aumento da massa molar,
protege as células oculares do dano causado pelo contato com instrumentos
cirúrgicos e implantes. Essas propriedades são vistas para ambas as massas
molares e concentrações de formulações (GOA; BENFIELD, 1994).
O ácido hialurônico sintetizado endogicamente na membrana da córnea
intraocular no espaço anterior ou posterior do olho é um importante componente não
aquoso do fluído ocular. Experimentos in vitro mostram o efeito protetor do ácido
hialurônico exógeno de 1 a 3 % sobre o tecido endotelial da córnea animal. Em
humanos a proteção do ácido hialurônico no tecido endotelial da córnea é também
evidente após a implantação de lentes intraoculares (Miller; Stegmann apud GOA;
BENFIELD, 1994).
2.6.2 Osteoartrite
Em condições fisiológicas normais, o ácido hiaurônico ocupa a camada
superficial do tecido articular, difundindo-se para o interior do espaço sinovial para
40
lubrificar juntas à baixa tensão e para prevenir o dano mecânico por atuar como
absorvedor de choques a alta tensão. No entanto, a viscoelasticidade é responsável
por proteger, lubrificar e estabilizar células e tecidos da camada durante o
movimento (BALAZS; DELINGER, 1993).
Durante o processo inflamatório da artrite, essas propriedades reológicas do
ácido hialurônico endógeno são diminuídas pela redução na dimensão da molécula
e concentração no fluído sinovial do joelho (BALAZS et al., 1967). Em parte essas
mudanças são atribuídas à despolimerização da longa cadeia de polissacarídeos por
reações com oxigênio, radicais gerados pelos leucócitos e pela diluição da
concentração do ácido hialurônico devido à artrite (GOA; BENFIELD, 1994).
O uso das preparações de ácido hialurônico intra-articular baseia-se na
capacidade desta substância de aumentar a viscosidade do líquido sinovial, que está
reduzida nos pacientes com osteoartrose, resultante das reduções no peso
molecular e concentração do ácido hialurônico endógeno sintetizado pelos
condrócitos e fibroblastos na membrana sinovial. O ácido hialurônico exógeno
estimula a síntese de ácido hialurônico in vitro pelos sinoviócitos de articulações com
osteoartrose. O ácido hialurônico também apresenta efeitos anti-inflamatórios nas
articulações com osteoartrose. O ácido hialurônico intra-articular geralmente é bem
tolerado, e os efeitos adversos mais comuns são discretas reações nos locais das
injeções. Na prática atual, o ácido hialurônico intra-articular parece ser útil como
monoterapia em osteoartrose de joelho, ou como complemento do tratamento
farmacológico. Também pode ser utilizado como tratamento para doença avançada,
como uma alternativa à cirurgia, ou outros tratamentos invasivos (PEREIRA, 2002).
Um aumento na viscosidade do fluído sinovial na concentração ou no peso
molecular do ácido hialurônico pode após a injeção intra-articular de ácido
41
hialurônico exógeno, em torno de 1 % ser significativo em alguns pacientes com
osteoartrite ou artrite reumatóide. Repetidas injeções de ácido hialurônico intraarticular reduz o tecido conectivo e promove a cura da artrite quando comparado
com articulações de macacos (GOA; BENFIELD, 1994).
Sob a forma de hialuronato sódico, o ácido hialurônico tem efeito benéfico.
Acredita-se que cubra e lubrifique as superfícies articulares, de modo a prevenir a
perda de proteoglicanas a partir da matriz cartilaginosa e aumentar a produção,
pelas
células
sinoviais,
de
ácido
hialurônico
ou
hialuronato.
O
termo
viscosuplementação tem sido usado para descrever o efeito do ácido hialurônico, de
alta massa molar, injetado na articulação com osteoartrite. Quando comparado às
articulações normais, as articulações artrósicas contêm concentrações menores de
ácido hialurônico (0,8 a 2,0 mg/mL versus 3,5 mg/mL) e de menor massa molar (0,5
a 4,0 MDa versus 4,0 a 5,0 MDa) avaliadas no Japão, Itália e Alemanha foram
efetivas em 6 a 80 % dos pacientes com osteoartrose de joelho. Três a cinco
injeções de 25 mg induziram melhora na dor quando comparado com placebo. Após
a série de aplicações, foi detectado no líquido sinovial maior quantidade de ácido
hialurônico de alta massa molar o que sugere produção aumentada pelas células
sinoviais (FERNANDEZ et al., 1997).
2.6.3 Cartilagem
Na cartilagem, o ácido hialurônico é a espinha dorsal dos agregados de
proteoglicanas responsáveis pela integridade da matriz intercelular. O dano da
cartilagem durante o processo de osteoartrite causa mudança na matriz devido à
perda de ácido, colapso enzimático de proteoglicanas e outras substituições por
42
moléculas com composição alterada. Além disso, componentes fragmentados da
matriz distribuídos no fluído sinovial podem provocar uma reação inflamatória. A
expectativa de que o ácido hialurônico exógeno pode reparar ou proteger a
cartilagem tem sido objeto de muito estudo em modelos animais (GOA; BENFIELD,
1994).
2.6.4 Aplicações dérmicas
O colágeno bovino foi o primeiro produto aprovado pelo FDA (Food and Drug
Administration) para ser injetado na pele. O colágeno bovino foi utilizado como
referência, mas o ácido hialurônico assim como o colágeno também é um dos
componentes da pele, tendo um papel importante na hidratação do espaço
extracelular e constituindo uma matriz de suporte para o funcionamento normal das
células (PIERRE, 2004).
A principal aplicação dermatológica dos derivados do ácido hialurônico é no
aumento de tecidos moles, através de injeções intradérmicas. Os derivados do ácido
hialurônico são injetados no tecido dérmico para fornecer um suplemento
viscoelástico para a matriz extracelular do tecido conectivo. Isto pode resultar na
correção de problemas da pele causados por rugas, cicatrizes, para aumento de
lábios ou outros defeitos. Dependendo do tipo de pele e lesão, melhores resultados
são obtidos em áreas onde a correção pode ser visualizada pelo esticamento
manual da pele (MANNA et al., 1999).
O ácido hialurônico tem sido extraído principalmente de crista de galo e
vários artigos abordam aplicações clínicas do ácido desta fonte. Mais recentemente
o ácido hialurônico tem sido produzido por bactérias Streptococcus, porém dispõe-se
43
de pouca informação científica sobre o procedimento de extração e características
químicas do ácido (MANNA et al., 1999).
Estima-se um total de ácido hialurônico em humanos ao redor de 12 g. No
cordão umbilical, líquido sinovial (3500 mg/l) e no vítreo (200 mg/l). A pele contém ao
redor de 7 g de ácido hialurônico onde é produzido e mantido na membrana da
célula e liberado para o espaço extracelular. O catabolismo na pele é muito rápido. A
meia-vida é de menos de 24 horas. A degradação do ácido é influenciada pelo efeito
térmico, enzimático e interações com radicais livres. O volume a ser injetado para
uma boa correção depende da profundidade dos sulcos das rugas e também da
viscosidade do ácido injetado. A longevidade do produto depende do processo de
estabilização e da quantidade de ácido injetado (PIERRE, 2004).
Estudos recentes, mostram o ácido hialurônico não somente como fluido
lubrificante, aplicações dérmicas e oftalmologia, mas também, como sistema de
liberação controlada de fármacos, tais como no prolongamento da anestesia em
articulações de ossos e cavidades (GODENHEIN et al., 2001), no tratamento de
artropatia (SUZUKI et al., 2001), liberação de agentes quimioterápicos em implantes
cirúrgicos (AEBISCHER et al., 2001), implantes de fármacos em cáries dentárias
(SUHONEN; SCHUG, 2000), e sistema de liberação controlada de antígenos para
imunoterapia (PARDOLL et al., 2001), aplicações em lentes de contato (BEEK;
JONES; SHEARDOWN, 2008), como um copolímero com propriedades antitrombóticas para uso em aplicações vasculares (XU et al., 2008).
44
2.7 Requerimentos para o ácido hialurônico ser usado na medicina
O ácido hialurônico para aplicações médicas deve em todos os casos ter um
elevado grau de pureza e apresentar-se em faixa de massa molar mais adequada
para a aplicação específica. O ácido hialurônico encontrado no fluído sinovial tem
massa molar de 1 – 8 MDa, o do cordão umbilical em torno de 3,6 – 4,5 MDa, e da
crista de galo deve atingir valores maiores, tais como 12 – 14 MDa. No entanto, os
procedimentos de purificação e esterilização para as aplicações reduzem muito a
massa molar do produto. A composição do ácido é a mesma, independente da fonte
(OGRODOWSKI, 2006).
Produtos como Orthovisc (Anika Therapeutcs Inc., EUA), Hyalgan (Fidia
Pharmaceutical, Itália), Supartz (Seikagaku Corp., Tókyo) e Synvisct (Philadelphia)
são usados como lubrificantes e amortecedor, melhorando a mobilidade e a dor.
Possuem alta massa molar e produzem excelentes resultados nos estudos da
terapia da Osteoartrite (BRANDT et al., 1999; ALTMAN; ROLAND, 1999).
Produtos como Healon, Ial, Amvisc, Opegan e Vitrax todos obtidos de crista
de galo, de alto peso molecular são usados em oftalmologia para proteger as células
oculares de danos causados por instrumentos ou implantes (GOA; BENFIELD,
1994).
Produtos com massas molares menores, na faixa dos produtos comerciais
de 3 a 5 MDa são adequados para redução de adesões em períodos pósoperatórios e implantes (BRANDT et al., 1999; MANNA et al., 1999; PARDOLL et al.,
2001).
Quando o ácido hialurônico é usado em aplicações na pele com o objetivo
de diminuir os sulcos de rugas, é importante que o ácido hialurônico esteja
45
estabilizado para não ocorrer reação alérgica. O processo de estabilização é feito
com a introdução de ligações cruzadas no gel. Existem hoje no mercado alguns
produtos como: Restylane (Q Méd AB, Suíça) de Streptococcus, Juvederm (LEADerm, França) de crista de galo e Hylaform (Genzime Corp., USA) de crista de galo.
Esses produtos variam sua concentração de 20 mg/mL, 24 mg/mL e 5,5 mg/mL
respectivamente (MANNA et al., 1999; PIERRE, 2004).
Os ácidos hialurônicos de maiores massas molares atualmente encontrados
no mercado têm como fonte a crista de galo, e são designados como: Healton.RTM.
e Healton.RTM.GV, ambos produzidos pela Pharmacia AB (Suécia), os quais
possuem massas molares em torno de 3,5 a 5 MDa respectivamente. Esses valores
se referem aos produtos esterilizados, o que significa que anteriormente a esse
processo as massas molares eram na ordem de 5 a 7 MDa (OGRODOWSKI, 2006).
Os ácidos hialurônicos com massas molares menores que os da crista são
os obtidos de sistemas bacterianos e situam-se na faixa de 4 MDa antes do
processo de esterilização e estão registrados nas várias patentes da Fermentech (1 3 MDa), Chisso Corp. (2 - 3 MDa), Denki Kagaku Kogyo KK (2 - 4 MDa) (ST. ANG.
HL, 2000).
2.8 Envelhecimento humano
Em 1982, a Organização das Nações Unidas (ONU) promoveu a
I Assembléia Mundial sobre o Envelhecimento e aprovou o Plano de Ação
Internacional de Viena elaborado durante a Assembléia, definindo a população idosa
como o grupo de pessoas com 60 anos ou mais. No entanto, em 1985, a
Organização das Nações Unidas, segundo Paschoal (1999), adotou a idade de 65
46
anos como marco cronológico para estudos populacionais de idosos, somente nos
países desenvolvidos, enquanto para os países em desenvolvimento, onde a
expectativa média de vida é menor, instituiu a idade de 60 anos (MOI, 2004).
Por volta do ano 1900, menos de 5 % da população chegava aos 65 anos de
idade. Atualmente as pessoas idosas com mais de 65 anos contabilizam mais de 12
% da população dos EUA (ROACH, 2001). Atualmente, a população brasileira com
idade igual ou superior a 60 anos é da ordem de 15 milhões de habitantes. A sua
participação no total da população nacional dobrou nos últimos 100 anos, passando
de 4 %, em 1900 para 9 % no ano 2000. Projeções recentes indicam que esse
segmento poderá ser responsável por 15 % da população brasileira no ano 2020
(CAMARANO et al., 1997). O último censo populacional (2001) mostrou que os
idosos no Brasil, correspondem a 9,1 % da população do país, pois do total de
160.336.471 brasileiros identificados em 1999, 14.512.803 tinham 60 anos ou mais.
Segundo Ramos et al. (1993), em 2025, o Brasil terá a sexta maior população de
idosos do mundo.
A grande questão atualmente, é fazer com que o prolongamento da vida seja
acompanhado de melhoria de sua qualidade, autonomia e independência,
associados à sabedoria, indicadores essenciais para um viver saudável e feliz
(NÉRI, 2001).
A população idosa brasileira está sujeita à problemas de saúde, com o
surgimento de enfermidades crônicas que acarretam baixa letalidade e, às vezes,
alto grau de incapacidade, onerando os orçamentos na área da saúde, tão carente
ainda de recursos (VERAS, 1994).
47
2.8.1 Cartilagem articular humana
A cartilagem articular é um tecido conjuntivo especializado com grande
quantidade de matriz extracelular. Essa matriz é composta por uma densa rede de
fibras colágenas, proteoglicanas agregadas e não-agregadas, água, sais inorgânicos
e pequena quantidade de outras proteínas, glicoproteínas e lipídios. A principal
macromolécula encontrada na matriz é o colágeno (60 %), tipos IX e XI, mas
predominantemente do tipo II. Este colágeno fica embebido em um firme gel
hidratado de proteoglicanas. A proteoglicana é formada por um núcleo protéico
central e possui glicosaminoglicanos sulfatados (GAGs) ligados a esse núcleo.
Essas proteoglicanas podem ser encontradas como monômeros e também na forma
agregada. O agregado de proteoglicanas é composto de uma cadeia de ácido
hialurônico central (GAG não sulfatado) com múltiplos monômeros de proteoglicana
ligados a ele (Vanwanseele et al., 2002 apud CINTRA NETO, 2006).
De uma forma geral, as funções principais da cartilagem articular são
absorver o choque, distribuir a carga ao longo da superfície articular durante a
descarga de peso e permitir o deslizamento livre e suave dos movimentos. O que
permite que isso ocorra é a composição, a organização, o sistema de expansão e o
contrabalanço existente em sua matriz extracelular e sua superfície lisa deslizante
com baixo coeficiente de fricção (FELICE et al., 2002).
Os GAGs são fortemente hidrofílicos e por isso formam géis mesmo em
baixas concentrações.
Possuem múltiplas cargas negativas que atraem cátions
(como Na+) que são osmoticamente ativos e fazem com que grandes quantidades de
água sejam sugadas para o interior da matriz. Além disso, os monômeros de
proteoglicanas repelem-se por terem a mesma carga. Essas duas situações criam
48
uma pressão e edema que é balanceada pela tensão das fibras colágenas. Por suas
características, o colágeno fornece resistência a essa expansão. As proteoglicanas,
além de preencherem o espaço da matriz, resistem à compressão. Sendo assim, a
grande quantidade de GAGs, e o colágeno permitem, respectivamente, grande
pressão interna e tensão de contrabalanço, o que dá à cartilagem sua rigidez e
resistência (NARMONEVA et al., 2002; ALBERTS et al., 2004).
Distribuída em lacunas entre essa matriz, existe uma esparsa população de
células, os condrócitos. São eles os responsáveis pela síntese e manutenção destes
componentes da matriz. Produzem e degradam glicosaminoglicanos, baseados nas
citocinas anabólicas e catabólicas enviados e recebidos pela própria matriz
(Goldring, 2000 apud RENNER, 2005).
Os fatores de crescimento insulínico-1 (IGF-1) e transformador β (TGF-β)
são, talvez, as citocinas anabólicas mais importantes. Entretanto, sob condições
diferentes eles parecem diferenciar seus processos. IGF-1 é o maior contribuinte
para a homeostase da cartilagem sob condições normais. Sob lesão ou condição de
osteoartrite os condrócitos expressam, em grande quantidade, uma proteína que se
liga ao IGF-1 que aos poucos diminui sua efetividade. Por outro lado, TGF-β só
aumenta a síntese de proteoglicana quando a cartilagem está osteoartrítica. Outro
fator de crescimento, a proteína morfogênica óssea-2 (BMP-2), também é muito
importante na síntese de proteoglicanas em cartilagens saudáveis (ANGEL et al.,
2003).
Para degradação, os condrócitos são capazes de sintetizar uma variedade
de enzimas proteolíticas como, por exemplo, as metaloproteases da matriz. A
cascata
proteolítica,
responsável
pela
degradação,
envolve
colagenases,
gelatinases e estromelisinas. Suas ações são controladas pelos inibidores teciduais
49
de metaloproteases (TIMPs), também sintetizados pelos condrócitos. Eles inibem os
efeitos catabólicos das metaloproteases. Acredita-se que a relação entre as
metaloproteases e os inibidores das mesmas é rigidamente controlada pelos
condrócitos para garantir a homeostasia tecidual (Vanwanseele et al., 2002 apud
RENNER, 2005).
A cartilagem articular apresenta diferentes características conforme passa
da superfície à zonas mais profundas. Estas diferenças estão relacionadas com a
quantidade e organização dos componentes da matriz e dos condrócitos, o que dá
às camadas características biomecânicas conforme a região. Em função destas
variações, divide-se a cartilagem em quatro camadas: superficial, média, profunda e
calcificada (RENNER, 2005).
A
superfície
da
cartilagem
articular,
perde
mais
rapidamente
glicosaminoglicanos que as regiões mais profundas do tecido, exibindo assim, menor
pressão de edema, pois essa é determinada pelo equilíbrio entre a pressão osmótica
dos glicosaminoglicanos e a força restritiva da rede de fibrilas colágenas. A
composição da cartilagem articular adulta se altera com o envelhecimento, mas as
modificações observadas são pequenas quando comparadas com as que ocorrem
durante o processo de maturação esquelética que em humanos se estende até a
terceira década. As alterações observadas na matriz extracelular refletem
modificações condrocitárias. Na cartilagem articular de animais maduros (após o
fechamento epifisário) tem-se menor concentração celular do que a observada nos
tecidos imaturos, sobretudo na zona superficial. No processo de envelhecimento
ocorre uma diminuição na atividade sintética dos condrócitos (EGRI, BATISTELA;
YOSHINARI, 1999).
50
Smalc et al., (1995) estudaram a cartilagem articular de joelhos de ratos
Wistar de seis meses (jovens) e vinte e quatro meses (senis) de idade, por
microscopia ótica. Evidenciaram que no grupo jovem não havia alterações
degenerativas evidenciáveis, com o tecido apresentando superfície uniforme,
elevada concentração de proteoglicanas e condrócitos normais. No grupo senil,
cerca de 68 % dos animais avaliados apresentavam algum grau de alteração
degenerativa, sendo a mais freqüentemente observada (50 % dos animais desse
grupo) a perda de proteoglicanas da zona superficial, acompanhada da diminuição
de condrócitos.
2.8.2 Osteoartrite
A osteoartrite é, essencialmente, uma condição degenerativa da cartilagem
articular com formação subseqüente de osteófitos marginais, alterações no osso
subcondral e medula óssea, reação inflamatória da membrana sinovial e danos na
estrutura intra-articular (Gould, 1993 apud CINTRA NETO, 2006).
A osteoartrite é associada à perda do equilíbrio entre a síntese e degradação
de macromoléculas que proporcionam a cartilagem articular suas propriedades
funcionais e biomecânicas (LOHMANDER, 1994).
O processo é iniciado pela perda das proteoglicanas da matriz extracelular e
uma ruptura na rede fibrilar colagenosa, seguido de migração dos condrócitos
através dessa matriz. Os condrócitos ficam expostos a estímulos que alteram o seu
comportamento metabólico. Essas células, sem a proteção da matriz, multiplicam-se
no local da lesão e aumentam seus mecanismos de síntese, tentando uma
regeneração. Essa tentativa é transitória, pois logo predomina a ação de proteases
51
que iniciam de modo progressivo, a degeneração da cartilagem e morte celular. Com
a degradação, fragmentos de proteoglicanas e de colágeno caem no líquido sinovial,
indo alcançar a sinóvia. Esses fragmentos passam a agir como neo-antígenos a
partir da exposição de determinadas seqüências de peptídeos. Eles geram efeito
irritativo estimulando sinoviócitos que passam a sintetizar citocinas catabólicas (IL1α, IL-1β e TNFα). Essas vão interagir com condrócitos, estimulando ainda mais a
produção
de
proteases.
Há
um
aumento
da
degradação
e
cresce,
proporcionalmente, a quantidade de fragmentos, que voltam a estimular as células
sinoviais, fechando um ciclo que pode perpetuar o processo ostoartrítico (RENNER,
2005).
O diagnóstico da osteoartrite só é realizado quando o paciente apresenta
dor, disfunção, efusão e diminuição do espaço articular na radiografia, porém
quando isto ocorre a lesão condral já esta evoluída. Para facilitar o diagnóstico
precoce, monitorar a progressão da lesão e avaliar os tratamentos cirúrgicos e
farmacológicos precisa-se aprimorar as ferramentas utilizadas para os diagnósticos
(LOHMANDER, 1991; LOHMANDER, 1994). Com o envelhecimento da população a
prevalência da doença continuará a crescer. A osteoartrite consome uma proporção
significativa dos recursos da saúde. A National Health Interview Survey, de 1900 –
1992 nos Estados Unidos, evidenciaram que as doenças músculo-esqueléticas são
responsáveis por 30 % das consultas médicas, 33 % das internações hospitalares e
46 % de todas as pessoas com limitações em suas atividades diárias. O impacto
pessoal dos problemas músculo-esqueléticos supera os aspectos econômicos já que
influencia
negativamente
BACHMEIER, 1996).
o
status
psicológico
dos
pacientes
(BROOKS;
52
As terapias atuais da osteoartrite são amplamente sintomáticas e focadas na
diminuição da dor e melhora da função com analgésicos, anti inflamatórios não
hormonais, ou artroplastia. No entanto, novas intervenções estão sendo propostas
para o tratamento desta afecção que podem diminuir a taxa de degeneração
articular (Lohmander, 1994 apud, CINTRA NETO, 2006).
2.9 Caracterização do ácido hialurônico
2.9.1 Massa Molar
A massa molar do ácido hialurônico pode ser determinada por cromatografia
de permeação em gel (KIM et al., 1996) ou por estimação indireta através da sua
viscosidade intrínseca (ARMSTRONG et al., 1997).
A relação entre viscosidade intrínseca de uma solução polimérica com a
massa molar viscosimétrica média é dada através da equação 2.1 de Mark-HouwinkKuhn-Sakurada (MHKS) (ARMSTRONG; JOHNS, 1995; ARMSTRONG et al., 1997).
η= k (Mv)a
(2.1)
Onde: k e a são constantes que dependem do polímero, do solvente e da
temperatura.
η é a viscosidade intrínseca
Mv é a massa molar do polímero
53
Quando o valor da viscosidade intrínseca for maior do que 2960 mL/g,
multiplica-se este valor por um fator igual a 1,247 para corrigir o zero de
cisalhamento (ARMSTRONG et al., 1997).
2.9.2 Viscosidade intrínseca
A viscosidade intrínseca [η] é uma medida do volume hidrodinâmico
ocupado por uma macromolécula em solução é, portanto uma reflexão do seu
tamanho. O valor de [η] pode ser obtido de ηred. quando a concentração é
extrapolada para zero,
a viscosidade intrínseca varia muito e depende da Mv.
Fazendo comparação com dados obtidos em outros trabalhos Gura, Hückel e Müller
(1998), estes mostram boa correlação de amostras com massa molar similar em
solventes de força iônica similares.
A viscosidade intrínseca pode em teoria ser usada para determinar a massa
molar de macromoléculas através da relação (MHKS), entretanto a validade do valor
da massa molar obtido depende dos parâmetros k e a os quais necessitam ser
obtidos usando condições idênticas de solvente e temperatura para a amostra
(HOKPUTSA et al., 2003).
Analises de regressão forneceram valores de K = 5,075 x 10-2 e a = 0,716
para viscosímetro Ubbelohde. Em oposição a esses resultados, os valores por
viscosímetro Zimm-Crothers medidos são K = 3,023 x 10-2 e a = 0,770 em
concordância com outros valores publicados por outros autores (GURA; HÜCKEL;
MÜLLER, 1988)
O parâmetro a sozinho dá informação da conformação de uma molécula e
pode ser visto em vários trabalhos bem como a comparação entre seus valores.
54
Bothner et al., (1988) sugere que o parâmetro a do AH é dependente da massa
molar do AH.
Bothner et al., (1988) apresentou duas zonas de cálculo para a (MHKS): a
primeira zona com massa molar menor que 106 g mol-1 com valor de a publicado em
vários trabalhos. Por outro lado a segunda zona com valores acima de 106 g. mol-1
com menores valores de a (0,601). Existe uma regra importante para a taxa de
cisalhamento para a relação (MHKS) para amostras com massa molar maior. Com
massa molar maior, o início da taxa de cisalhamento depende da substituição para a
taxa de cisalhamento menor devido a uma forte atração dos domínios
intermoleculares do AH. No ácido hialurônico a atração é muito forte devido ao alto
volume molecular, conseqüentemente, uma taxa de cisalhamento mais alta em um
viscosímetro Ubbelohde pode ser a razão para o baixo valor de a e a correlação não
linear acima de 1,4 x 106 g. mol-1 em comparação a determinação em viscosímetro
Zimm-Crothers.
A influência da taxa de cisalhamento é a razão para a baixa medida em
viscosímetro Ubbelohde. Para resultados precisos a medição deve sempre ser
realizada numa faixa de comportamento de fluxo newtoniano. Contudo o tempo
rápido a taxa de cisalhamento de uma medição no viscosímetro Ubbelohde depende
da concentração e do peso molecular do AH. Mesmo assim a viscosidade intrínseca
de baixa massa molar do AH pode ser determinada corretamente devido sua grande
faixa de comportamento de fluxo newtoniano. Contudo para amostras com massas
molares acima de 106 g. mol-1 os coeficientes de (MHKS) publicados baseados na
medida do Ubbelohde mostram que podem ser usados, mas com cuidado para
calcular a massa molar. Para medidas de alto peso molecular do AH o uso de
55
viscosímetro com baixíssima taxa de cisalhamento é recomendado como o ZimmCrothers.
2.10 Função biológica
2.10.1 Antioxidante
Considera-se como uma definição ampla de antioxidante “qualquer
substância que, presente em baixas concentrações quando comparada a do
substrato oxidável, atrasa ou inibe a oxidação deste substrato de maneira eficaz”
(Sies; Sthal apud BIANCHI et al., 1999). Esses agentes que protegem as células
contra os efeitos dos radicais livres podem ser classificados em antioxidantes
enzimáticos ou não-enzimáticos. Entre os antioxidantes não-enzimáticos estão o αtocoferol, β-caroteno, ácido ascórbico, flavonóides, proteínas do plasma, selênio,
clorofila, L-cisteína, curcumina. Os antioxidantes enzimáticos são superóxido
dismutase, catalase, NADPH-quinona oxiredutase, glutationa peroxidase e enzimas
de reparo (BIANCHI et al., 1999).
Os antioxidantes atuam no organismo de maneiras diferentes na defesa
contra os radicais livres. O primeiro mecanismo de defesa consiste em impedir sua
formação, principalmente pela inibição das reações com o ferro e o cobre (BIANCHI
et al., 1999).
O estudo sobre os mecanismos de lesão oxidativa tem confirmado a ação
catalítica dos metais. O papel dos metais na formação in vivo das espécies
oxidativas
do
oxigênio
é
confirmado
pelas
reações
de
Fenton
56
(Fe++ + O2 → Fe+++ + O2-) e de Haber-Weiss, que promove o acúmulo de radicais
livres, dentre eles o OH- (FERREIRA et al., 1997).
Outro mecanismo dos antioxidantes refere-se à capacidade de interceptar os
radicais livres gerados pelo metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo
o ataque sobre os lipídios, aminoácidos, ácidos graxos e DNA. Os antioxidantes da
dieta, tais como; vitaminas C, E e A, os flavonóides e carotenóides são agentes
importantes na intercepção desses radicais livres. Também pode ocorrer o reparo
das lesões causadas pelos radicais, adaptação do organismo em resposta a
geração desses radicais com o aumento da síntese de enzimas antioxidantes
(BIANCHI et al., 1999).
Os glicosaminoglicanos são polissacarídeos heterogêneos e compõem a
matriz extracelular. Várias descobertas mostram que durante a progressão da injúria
do fígado o nível de GAG no sangue aumenta, principalmente de AH. Os GAGs são
capazes de ligar proteínas devido os grupos sulfato e grupos carboxílicos. O
principal GAG no sangue é o sulfato de condroitina seguido pelo sulfato de
queratana, sulfato de heparana e ácido hialurônico. O aumento no plasma dos níveis
de AH foi observado em várias doenças, incluindo cirrose e fibrose hepática em
humanos e em modelos experimentais em ratos (CAMPO et al., 2004).
Entretanto uma hipótese recente para explicar o aumento dos GAGs no
plasma pode ser explicado porque alguns GAGs apresentam a propriedade de
serem antioxidantes capazes de inibir a peroxidação lipídica. O aumento dos níveis
de GAGs podem representar uma resposta biológica para produção de radicais
livres. O uso desses componentes como agentes terapêuticos mostram resultados
positivos em modelos animais experimentais (FRASER; LAURENT; LAURENT,
1997)
57
Recentemente, vários autores sugerem que alguns GAGs possuem
propriedade antioxidante como o AH e SC eles inibem a peroxidação lipídica por
quelarem metais de transição como o Cu2+ e Fe2+ (ALBERTINE et al., 2000).
Estudos mostram que animais com CCl4 – induzidos com injúrias no fígado e
tratados com agentes capazes de quelar esses íons metálicos, produzem uma
significante proteção por reduzir a oxidação e a peroxidação lipídica (CAMPO et al.,
2004).
2.10.2 Formação de radicais livres
O termo radical livre refere-se ao átomo ou molécula, que contém número
ímpar em sua última camada eletrônica (FERREIRA et al., 1997), estando assim
disponíveis para reações com outras moléculas ou átomos. Duram milisegundos,
sendo esse tempo suficiente para a ação oxidativa, tóxica para as células e
microrganismos agressores (SCHANAIDER, 2000).
Na sua maioria os radicais livres são originados a partir do metabolismo do
oxigênio (O2) (FERREIRA et al., 1997). Os radicais livres podem ser gerados no
citoplasma, nas mitocôndrias ou nas membranas (proteínas, lipídios, carboidratos e
DNA), surgindo durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem no
metabolismo celular (BIANCHI et al., 1999).
Os oxiradicais degradam os microfilamentos do citoplasma, que compõe o
“esqueleto” das células, interferindo nos mecanismos reguladores das membranas
celulares. Alteram também lipídios, danificando estruturas onde estão presentes,
como as membranas celulares, inativam enzimas, quebram carboidratos e, nos
58
ácidos nucléicos oxidam as bases nitrogenadas, fragilizando as cadeias do DNA e
facilitando as mutações (SCHANAIDER, 2000).
Entre as principais formas reativas do oxigênio, o radical superóxido (O2)
apresenta uma baixa capacidade de oxidação, o radical hidroxila (OH) mostra uma
pequena capacidade de difusão, porém é o mais reativo na indução de lesões nas
moléculas celulares. O peróxido de hidrogênio (H2O2) não é considerado um radical
livre verdadeiro, mas é capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos na
molécula de DNA por meio de reações enzimáticas, porque participa da reação que
produz o OH - (FERREIRA, 1997).
Em condições fisiológicas, de todo o oxigênio molecular captado nas
mitocôndrias e processado na cadeia respiratória, só 1 % a 5 % escapam e formam
oxiradicais. Esses radicais são formados através de sucessivas reduções
monovalentes, onde os intermediários, o radical superóxido, peróxido de hidrogênio
e hidroxila, podem ser convertidos em água, tornando-se inofensivos, por um
mecanismo de proteção normalmente existente nas células, composto por enzimas
superóxido-dismutase, catalase e sistema glutationa (SCHANAIDER, 2000).
3 MATERIAL E MÉTODOS
As cristas usadas neste experimento foram fornecidas pelo frigorífico
Penasul de Caxias do Sul – RS, no primeiro semestre de 2007. Foram coletadas na
linha de abate, sendo 50 % das cristas de frangos machos e 50 % de fêmeas com
idade de 48 dias. As cristas foram transportadas congeladas até Santa Maria e
permaneceram congeladas a –18oC até o início do experimento.
A extração, purificação, quantificação e eletroforese foram realizadas no
Laboratório de Tecido Conjuntivo da Universidade Federal do Rio de Janeiro O
infravermelho e a atividade antioxidante foram realizadas na UNIFRA em Santa
Maria. A massa molar na Universidade Federal de Santa Catarina e o RMN na
Universidade Federal de Santa Maria.
3.1 Composição química da crista de frango
A composição química da crista de frango foi determinada de acordo com a
AOAC (1995).
3.1.1 Umidade
Fundamentou-se na perda de umidade e substâncias voláteis a 105oC.
60
3.1.2 Proteína bruta
Essa análise baseou-se na determinação do nitrogênio total. A proteína foi
determinada pelo método de Kjeldahl. O fator de conversão usado foi de 6,25.
3.1.3 Lipídios
Foi utilizado a extração dos lipídios com éter de petróleo pelo método de
Soxhlet com uma prévia hidrólise ácida da amostra com ácido clorídrico.
3.1.4 Cinzas
Fundamentou-se na perda de peso que ocorre quando o produto é
incinerado a 500-550oC, com destruição da matéria orgânica.
3.1.5 Carboidratos
Foram determinados por cálculos, pela diferença das demais frações.
3.2 Extração dos glicosaminoglicanos totais das cristas de frango
As cristas foram trituradas e colocadas em acetona para desidratação e
delipidação. Posteriormente foram secas, pesadas e agrupadas sendo utilizado
cerca de 100 g para cada extração (n = 3). Seguiu-se delipidação em solução
clorofórmio / metanol (2:1, v/v) por 24 h a 25ºC. Os tecidos foram secos e hidratados
em tampão de digestão (acetato de sódio 100 mM pH = 5,0; cisteína 5,0 mM; EDTA
61
dissódico 5,0 mM) na proporção de 2,0 mL de tampão para 100 mg de tecido seco.
Após hidratação por 24 h a 4ºC foi adicionada solução de papaína (20 mg/mL),
preparada na solução tampão de digestão descrita anteriormente, numa proporção
de 0,5 mL para 100 mg de tecido seco. Seguiu-se incubação por 24 h a 60ºC,
centrifugação a 3200 rpm por 30 min e retirada do sobrenadante. O precipitado foi
submetido à nova incubação com papaína, sob as mesmas condições descritas
anteriormente. Posteriormente, foi adicionado ao sobrenadante CPC (cloreto de
cetilpiridínio) 10 % numa proporção de 0,2 mL para 100 mg de tecido seco e deixado
em repouso por 24 h à 25oC. A amostra foi centrifugada, o sobrenadante descartado
e o pellet lavado com 3,0 mL de solução de NaCl 2,0 M e etanol absoluto (100:15,
v/v). Adicionou-se então 2 volumes de álcool etílico absoluto e deixou-se em repouso
por 24 h a -16oC. Seguiu-se centrifugação, descarte do sobrenadante e lavagem do
pellet uma vez com 10 mL de etanol 80 %. Seguiu-se nova centrifugação e secagem
do pellet por 24 h a 25oC (CARDOSO et al., 1992) Este processo está ilustrado na
Figura 4.
62
Figura 4 - Processo de extração de GAGs (Desenho: Jardel Thalhofer, 2007).
3.3 Fracionamento dos glicosaminoglicanos na coluna Mono Q-FPLC
O
processo
descrito
a
seguir
está
ilustrado
na
Figura
5.
Os
glicosaminoglicanos da crista de frango (~ 500 µg em ácido hexurônico) foram
aplicados na coluna de troca-iônica Mono Q (HR 5/5) acoplada ao sistema de FPLC
(Fast Protein Liquid Chromatography) (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada
em tampão Tris-HCl 20 mM (pH 8,0). A coluna foi eluída com um gradiente linear de
1,5 M NaCl em mesmo tampão. O fluxo da coluna foi de 1 mL/min e coletadas
frações de 0,5 mL. As frações obtidas foram analisadas quanto ao conteúdo de
63
ácido hexurônico e à presença de metacromasia, com o intuito de distinguir os GAGs
sulfatados daqueles não-sulfatados. A dosagem de ácido hexurônico foi realizada
pelo método do carbazol usando 200 µL de amostra e como referência a
glicuronolactona.
As
frações
contendo
os
glicosaminoglicanos,
exibindo
comportamento diferente quanto à propriedade metacromática, foram agrupadas e
precipitadas com 3 volumes de etanol absoluto. A dosagem de metacromasia,
específica para GAGs sulfatados, foi realizada misturando 50 µL de amostra com 1,0
mL de DMB (azul de dimetilmetileno), seguida da leitura a A525
nm
(adaptação de
FARNDALE et al., 1986).
Mono
Q-FPLC
Figura 5 – Fracionamento e quantificação de GAGs (Desenho: Jardel Thalhofer,
2007).
64
3.3.1 Dosagem de ácido hexurônico (método de Carbazol)
A concentração de ácido hexurônico foi determinada através de método
químico, utilizando o reagente colorimétrico Carbazol (DISCHE, 1946). Esse método
baseia-se no desenvolvimento de cor pela ação de compostos orgânicos como o
reagente Carbazol. A dosagem de ácido hexurônico foi realizada com 200 µL de
amostra, aos quais se adicionou 1,0 mL de ácido sulfúrico com borato. Seguiu-se
aquecimento por 10 min a 100oC, resfriamento, adição de 40 µL de carbazol,
aquecimento por 12 min a 100oC e resfriamento. A leitura foi realizada no
espectrofotômetro em comprimento de onda de 525 nm (Ultrapesc 3100 pro –
Amersham Biosciences). A concentração do AH foi determinada através de uma
curva de calibração previamente construída com o AH padrão (Vinovo Biochemistry)
tomado como referência. A curva padrão foi feita com diferentes concentrações de
glicuronolactona [0,5 mg/mL]: 5,0 – 15 µg.
Para se obter o perfil de eluição desses dois grupos de GAGs, a
condutividade de cada fração foi medida. Foi utilizado 50 µL da amostra e 5,0 mL de
água destilada (Figura 5).
As frações que eluiram até 0,4 M de NaCl, correspondentes ao ácido
hialurônico e ao sulfato de dermatana, e aquelas que eluiram depois de 0,4 M de
NaCl, correspondem aos demais GAGs sulfatados.
A concentração relativa de GAGs sulfatados (sulfato de condroitina, sulfato
de dermatana) foi determinada por densitometria das bandas no gel, coradas pelo
azul de toluidina, usando o programa Scion Image 4.0.2 (Scion Corporation, USA).
A concentração total de ácido hialurônico foi calculada a partir da
concentração de ácido hexurônico x 1,95 (SWANN, 1968a).
65
3.4 Infravermelho
O equipamento utilizado foi o espectrofotômetro Bomem MB Séries,
(Hartamann & Braun-Michelson), com uma resolução de 4 cm-1 e comprimento de
onda variando de 4000,07 a 399,24 cm-1.
3.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os espectros de RMN de
13
C foram obtidos em espectrômetros BRUKER
DPX 400 MHz. Para a aquisição do espectro de RMN de
13
C foi utilizado o solvente
deuterado D-2O, tendo como referência para δ = 0 ppm 4,4-dimetil-4-silapentano-1sulfonato de sódio interno.
Os parâmetros experimentais do equipamento para aquisição do espectro do
composto obtido, em geral foram:
Espectrômetro BRUKER DPX-400: SF 400,13 MHz para 1H e 100,23 MHz para
13
C;
largura de pulso 90°, 8.0 µs (1H) e 13,7 µs (13C); tempo de aquisição 6,5 s (1H) e
7,6 s (13C); janela espectral 965 Hz (1H) e 5000 Hz (13C); número de varreduras 8-32
para 1H e 2000-20000 para 13C, dependendo do composto; número de pontos 65536
com resolução digital Hz/ponto1H igual a 0,677065 (1H) e 0,371260 (13C);
temperatura de 50 ºC.
66
3.6 Eletroforese em gel de agarose
As amostras de glicosaminoglicanos totais de crista de frango e as frações
das mesmas, obtidas na cromatografia de troca iônica, foram aplicadas (~ 5 µg em
ácido hexurônico) em um gel de agarose 0,5 %, em tampão propilenodiamino 50 mM
pH = 9,0 (4,3 mL 1,3-diaminopropano; 4,4 mL ácido acético; água destilada q.s.p.
1,0 L), submetida a 110 V / 200 mA por aproximadamente 1 h (DIETRICH;
DIETRICH, 1976). Após a corrida, os GAGs no gel foram precipitados com cetavlon
0,1 % (1,0 g brometo de cetiltrimetilamônio; água destilada q.s.p. 1,0 L) por 24 h.
Posteriormente, a lâmina foi seca, corada com azul de toluidina 0,1 % (0,1 g azul de
toluidina; 2,0 mL ácido acético; 49 mL etanol; 49 mL água destilada) e descorada
com solução descorante para agarose (20 mL ácido acético; 490 mL etanol; água
destilada q.s.p. 1,0 L). Em seguida, a lâmina foi corada com Stains-All (25 mg
Stains-All; 500 mL etanol 50 %) e descorado com água destilada (VOLPI; MACCARI;
TITZE, 2005). Foram utilizados como padrões GAGs de aorta torácica humana e
ácido hialurônico (Vinovo Biochemistry).
3.7 Viscosidade intrínseca
A viscosidade intrínseca foi realizada com solução de AH extraída de crista de
frango. As análises foram conduzidas em Viscosímetro de Bolas do tipo Hoepler
(massa da bola 4,60050 g e densidade de 2,226 g/cm-3), acoplado a um banho
termoestatizado, com controle de temperatura de (20oC), utilizando água como
solvente.
A viscosidade intrínseca foi determinada a partir do cálculo das viscosidades
relativa e reduzida, conforme mostrado na Tabela 1,
plotando a viscosidade
67
reduzida versus a concentração da amostra e extrapolando as retas para uma
concentração igual a zero.
Tabela 1 - Equações para construção do gráfico da viscosidade intrínseca
Viscosidades
Viscosidade relativa
Viscosidade reduzida
Viscosidade intrínseca
Equações
÷rel.= t/to
÷red.= (÷rel.-1)/c
÷int.= limc→0 (÷red.)
Onde: t = tempo de efluxo da solução polimérica
to = tempo de efluxo do solvente
c = concentração da solução polimérica
3.8 Massa molar
A massa molar viscosimétrica média foi estimada através da relação com a
viscosidade intrínseca, descrita pela equação 2.1.
÷η = k (Mv)a
(2.1)
Onde: k = constante dependente da geometria da ligação entre resíduos internos de
cadeia polimérica
a = constante dependente do solvente utilizado
η = viscosidade intrínseca
As constantes de (MHKS) adotadas foram k = 5,075 x 10-2 e a = 0,716 sendo
estas indicadas para soluções aquosas (GURA; HÜCKEL; MÜLLER, 1998).
68
3.9 Determinação da atividade antioxidante
3.9.1 Método de captação do radical DPPH (2,2 - difenil 1-picrilhidrazil)
A atividade antioxidante foi determinada pela redução do radical estável
DPPH (2,2 – difenil 1-picrilhidrazil) pelos antioxidantes presentes na amostra,
utilizando-se concentrações finais de 500, 250, 100, 50, 10 µg/mL em solução
aquosa. Em um tubo de ensaio foram adicionadas um volume de 2,5 mL das
amostras, em seguida adicionou-se 1,0 mL de solução de DPPH 0,3 mM em etanol.
Após 30 minutos foram realizadas as leituras das amostras em absorbância de
518nm. A solução de DPPH (1,0 mL; 0,3 mM) mais etanol (2,5 mL) foi usada como
controle (KANATT; CHANDER; SHARMA, 2008). A atividade antioxidante foi
determinada com o auxílio da equação (2.2).
% seqüestro de radicais livres = 100 - [ (AA – AC) / AC ] x 100
(2.2)
Onde: AA = absorbância da amostra
AC = absorbância do controle
3.10 Análise estatística
Para uma análise comparativa, da atividade antioxidante do ácido hialurônico
extraído de cristas de frango e do ácido hialurônico usado como padrão (item 4.6),
aplicou-se Análise de Variância a um nível de significância de 1 %, com auxílio do
software Microsoft Office Excel (BRAULE, 2001).
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Composição química da crista de frango
A composição da crista de frango usada para a obtenção do ácido hialurônico
é mostrada na Tabela 2.
Tabela 2 - Composição química da crista de frango
Fração
Média (b.u.) g % Desvio-padrão
CV %
Média (b.s.) g %
Umidade
73,20
0,14
0,19
-
Cinzas
0,28
0,01
2,57
1,00
Lipídios
11,10
0,15
1,34
41,41
Proteína
14,87
0,05
0,33
55,48
0,55
0,35
64,28
2,09
Carboidratos
n = 3,
b.u = base úmida
b.s = base seca
A crista de frango apresenta um teor de umidade de 73,20 %, semelhante ao
encontrado por Szirmai (1956) de 75,0 %.
Swann (1968b) trabalhou com cristas de galo em base seca antes de fazer a
extração do AH e encontrou 54,55 % de proteína, dados também semelhantes ao
encontrado neste experimento. Em termos de aminoácidos o ácido aspártico, serina,
ácido glutâmico, glicina e alanina estão em maior quantidade na proteína.
Pode-se observar também que a crista é um material rico em lipídios e por
isso a importância de delipidar antes da extração dos glicosaminoglicanos.
70
A crista de frango, sendo um subproduto de abatedouro, é desprezada
juntamente com as vísceras, penas para autoclaves e digestores. Após extração do
óleo seguem para o cozimento onde são transformadas em farinha animal (NETO,
1994). A crista por ser fonte de ácido hialurônico, importante para a área
farmacêutica, médica e cosmética poderia ser aproveitada.
4.2 Precipitação dos GAGs totais com etanol e cloreto de cetilpiridínio e
metodologias testadas
Inicialmente foram estabelecidas algumas condições de precipitação a fim de
verificar qual o melhor agente para precipitar o ácido hialurônico e testar duas
metodologias de extração.
4.2.1 Etanol
O tecido fresco precipitado com etanol após a quantificação do ácido
hexurônico apresentou um baixo rendimento (Quadro 1).
O etanol é um solvente de baixa polaridade, pois possui baixa constante
dielétrica (ε = 1,69) quando comparada a da água que possui (εE= 78) por essa
razão a água é um solvente bastante polar.
O etanol tendo baixa polaridade faz com que o ácido hialurônico precipite em
contato com ele, mas não é o solvente mais indicado, pois precipitam também outros
compostos como ácidos nucléicos que podem interferir no rendimento de ácido
hexurônico e também apresentar uma solução opalescente.
71
Os solventes orgânicos possuem diferentes capacidades para precipitar
glicosaminoglicanos. Volpi (1996) testou diferentes solventes orgânicos (etanol,
metanol e propanol) para separar glicosaminoglicanos de misturas por precipitação
seqüencial e verificou que a precipitação dos glicosaminoglicanos está relacionada
com a porcentagem de solvente e o tipo de solvente usado.
As diferenças nos resultados obtidos no fracionamento das misturas dos
glicosaminoglicanos podem estar relacionadas com as diferentes estruturas dos
GAGs, peso molecular, densidade das cargas e propriedades físico-químicas. Volpi
(1996) verificou que o etanol é mais indicado para precipitar sulfato de condroitina,
sulfato de heparana e sulfato de dermatana.
4.2.2 Cloreto de cetilpiridínio
Uma parte do tecido fresco foi desidratado e delipidado com clorofórmio /
metanol (2:1) e obtido um pó cetônico. Esse pó foi digerido com papaína e
precipitado com CPC a 10 %. Este método foi o que obteve um rendimento maior
em ácido hexurônico conforme pode ser observado no Quadro 1.
O cloreto de cetilpiridínio é um detergente catiônico (HN(CH2)15CH3Cl) e o
ácido hialurônico um composto polianiônico. O AH está na forma de ácido, sendo
mais fácil de ser precipitado por CPC porque forma um sal. O fracionamento com
detergentes catiônicos permite a eliminação de diversos contaminantes que podem
interferir na dosagem de ácido hexurônico.
Segundo Maccari e Volpi (2002), o cloreto de cetilpiridínio é um detergente
catiônico hidrofílico que possui alta capacidade para ligar GAGs. Por essa razão o
ácido hialurônico, sendo uma macromolécula carregada negativamente e altamente
72
hidrofílica pode ser mais facilmente precipitada por CPC, o que converge com os
resultados obtidos neste experimento. Além disso, quando se deseja obter o ácido
hialurônico para aplicações médicas, os ácidos nucléicos devem ser removidos da
solução, e essa remoção pode ser feita com cloreto de cetilpiridínio (ELLWOOD,
1995).
Segundo Swann (1968a), quando soluções de AH são purificadas com CPC
apresentam soluções perfeitamente claras, ao contrário de soluções tratadas com
clorofórmio ou outros solventes que podem apresentar opalescência.
O tecido fresco precipitado com CPC a 10 % e a amostra diluída 3x quase
não apresentaram diferença. Essa diluição foi feita porque o CPC, muitas vezes, em
soluções muito concentradas não tem capacidade para precipitar todo o ácido
hexurônico.
Quadro 1 - Métodos, etanol e cloreto de cetilpiridínio, testados para precipitar os
GAGs e rendimento em ácido hexurônico
Métodos, etanol e CPC testados para
Rendimento em ácido hexurônico
precipitar os GAGs
Ppt. etanol - tecido fresco
0,51 µg/mg tecido úmido
Ppt. CPC - tecido fresco
0,32 µg/mg tecido úmido
Ppt. CPC - diluição 3x – tecido fresco
0,34 µg/mg tecido úmido
Ppt. CPC - pó cetônico
2,00 µg/mg tecido úmido
Ppt. Inicial etanol + CPC tecido fresco
0,11 µg/mg tecido úmido
Analisando a Figura 6 pode-se perceber que em todos os métodos e
solventes usados, a composição é bastante semelhante. Com exceção do padrão de
73
AH, todos os extratos apresentam bandas correspondentes ao SD (sulfato de
dermatana) e SC (sulfato de condroitina) na coloração com azul de toluidina.
SC
SD
P
1
2
3
4
5
Figura 6 - Perfil eletroforético em gel de agarose de extratos de ácido hialurônico de
cristas de frangos: (P) padrão de AH; (1) ppt. Inicial etanol + CPC tecido fresco; (2)
ppt. CPC pó cetônico; (3) ppt. Inicial tecido fresco; (4) CPC tecido fresco; (5) CPC
tecido fresco ppt. após diluição 3x.
Na Figura 7, após a coloração pelo Stains-All fica nítida a predominância do
AH. Todos os extratos obtidos sob diferentes condições apresentam o AH como
maior GAG. Segundo Ng Kwai e Anastassiadis (1980); Nakano e Sim, (1989), as
aves domésticas apresentam o AH como GAG predominante juntamente com
pequenas quantidades de sulfato de dermatana e sulfato de condroitina, o que
também pode ser visto na Figura 6 antes de ser corada com Stains-All.
74
SC
SD
AH
P
1
2
3
4
5
Figura 7 - Perfil eletroforético em gel de agarose de extratos de ácido hialurônico de
cristas de frangos: (P) padrão de AH; (1) ppt. Inicial etanol + CPC tecido fresco; (2)
ppt. CPC pó cetônico; (3) ppt. Inicial tecido fresco; (4) CPC tecido fresco; (5) CPC
tecido fresco ppt. após diluição 3x.
75
4.2.3 Metodologias testadas no experimento
Foram testadas duas metodologias. Uma sem fazer digestão com enzimas
proteolíticas, seguindo a metodologia de Boas (1949) (item 2.5.1) que foi a primeira
metodologia a ser usada para extrair ácido hialurônico da crista de galo e a utilizada
neste experimento por Cardoso et al., (1992), com digestão enzimática.
O rendimento de GAGs recuperados após digestão com papaína e
precipitados com CPC foi grande na crista de frango (Tabela 3). Esse resultado é
similar ao encontrado por Nakano e Sim (1989) que encontraram 14,6 %. Esse alto
rendimento deve-se ao fato da concentração de ácido hexurônico no tecido da crista
ser alto. Já na metodologia de Boas (1949) o rendimento também foi alto, mas não é
devido somente ao ácido hexurônico e sim a outros grupamentos, como proteínas
etc.
Tabela 3 - Rendimento e concentração de ácido hexurônico na crista de frango
obtidos a partir de duas metodologias testadas
Amostra
Crista de
frango
Crista de
frango
Metodologia
BOAS (1949)
CARDOSO et
al., (1992)
Rendimento em
pó cetônico
16 %
µg de ácido hexurônico/mg
tecido seco
0,14
16 %
14,9
Como se pode observar na Tabela 3, a quantidade de ácido hexurônico
encontrada foi muito baixa na metodologia utilizada por Boas (1949). Segundo
Swann, (1968a) o ácido hialurônico pode ser extraído de várias maneiras. Mas a
extração com enzimas proteolíticas é a mais indicada, pois como o AH está presente
em mais de uma forma na crista, uma parte pode ser extraída por acetato de sódio,
76
ou outros procedimentos, mas uma parte, em torno de 7 %, só pode ser liberada do
tecido por enzimas proteolíticas. Este método também pode degradar o AH extraído
por enzimas lisossomais ou degradação não enzimática durante o processo de
extração do tecido, o que provavelmente deve ter acontecido nesta metodologia,
resultando no baixo rendimento.
Segundo Albano e Mourão (1986), Volpi e Maccari (2003), os métodos
utilizando enzimas para extração e purificação são comumente usados para purificar
glicosaminoglicanos de vários tecidos e fontes, isso exclui a possibilidade do AH
extraído da crista ser degradado durante o processo de purificação.
Segundo Schiller, Slover e Dorfman (1961), estudos mostram que a análise
direta desses polissacarídeos em tecidos não é possível. A extração desses tecidos
depende primeiramente da eliminação da maior parte da proteína por digestão com
papaína ou tripsina. Esses procedimentos permitem a recuperação quantitativa dos
polissacarídeos que não estão quimicamente degradados. A maior vantagem deste
método sobre os demais é a precipitação de todos os mucopolissacarídeos em
solução diluída de sal conseguindo-se realizar uma boa purificação. Podem restar
até 90 % da proteína ou produtos proteolíticos do tecido no sobrenadante. Em
tecidos como a pele, composta na maior parte por proteína e de aproximadamente
0,5 % de mucopolissacarídeos, a eliminação da proteína é o principal problema.
Sendo a crista de frango um tecido especializado da pele, composta em
grande parte por proteína, a remoção com clorofórmio e álcool amílico na
metodologia de Boas (1949) não foi suficiente para remover toda a proteína, fato
este que levou a um baixo rendimento em ácido hexurônico.
A concentração dos glicosaminoglicanos totais foi de 14,9 µg de ácido
hexurônico/mg de tecido seco. Esse valor é bem inferior ao relatado por Nakano e
77
Sim (1989; 1991), de 42,1 µg ácido hexurônico/mg tecido seco. Entretanto, neste
relato os glicosaminoglicanos totais das cristas foram extraídos de animais de 52
semanas (364 dias), enquanto nos dados aqui apresentados a idade dos animais
era de 48 dias, portanto de animais bem mais jovens. Nakano et al., (1994),
reportaram que o teor de ácido hexurônico no tecido vermelho situado abaixo do
bico de galos de 52 semanas é de 19,1 µg/mg de tecido seco, valor próximo ao que
obtivemos nas cristas de frangos.
Segundo Nakano e Sim (1991), as cristas de animais mais velhos e animais
machos possuem quantidades maiores de ácido hialurônico. Além disso, o
escaldamento das cristas pode diminuir sua concentração em AH e o método de
extração também pode influenciar na sua obtenção (SZIRMAI, 1956; BALAZS et al.,
1958; SWANN, 1968a). Mesmo assim, em função da quantidade de frangos abatidos
nos frigoríficos, à extração do AH pode vir a ser compensadora.
Comparando os dois métodos de extração verifica-se que o método de
extração, usando enzimas proteolíticas foi o que apresentou um rendimento maior
em ácido hexurônico, razão pela qual direcionamos a discussão a partir deste ponto
apenas ao método de extração enzimática.
4.4 Caracterização do ácido hialurônico
4.4.1 Identificação molecular do produto
Foram analisadas duas amostras por espectrofotômetro de infravermelho: AH
padrão, e AH extraído, para identificação e verificação da estrutura do composto
extraído, uma vez que nesta análise são identificados os grupos que estão
presentes ou ausentes na molécula. A partir das Figuras 8 (a) e (b) pode-se
78
caracterizar os grupos atômicos das moléculas com as bandas de absorção que são
específicas.
Alguns pontos a serem considerados para análise do espectro e freqüências
de alguns grupos dos compostos anteriormente referidos:
δ C-O: álcool, éter, éster e ácido carboxílico de 1300 a 1000 cm-1;
δ C-N: aminas de 1350 a 1000 cm-1;
υ C-H: alcanos com C sp3 de 3000 a 2850 cm-1;
υ N-H: 3460 a 3420 cm-‘,
Onde δ: deformação
υ: estiramento
Observa-se na Figura 8 (b), a intensidade da transmitância do ácido extraído
é menor que no caso da amostra padrão, significando que existem grupos externos
na molécula do ácido extraído que estão interagindo com outros compostos do meio,
fato justificado pela incompleta purificação da amostra analisada. O AH produzido
apresenta-se na forma de hialuronato de sódio, uma vez que foi homogeneizado em
solução de cloreto de sódio.
79
87,487,4
%T
85
85
80
80
75
75
70
70
65
65
611,24
%T
60
55
611,24
1412,33
1412,33
60
55
1618,56
50
45
40
1618,56
50
1043,75
1043,75
45
3435,43
3435,43
40
37,3
4000,0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
1600
1400
1200
1000
37,3
4000,0 3600
3200
2800
2400
2000
1800 cm-1
1600
1400
1200
1000
cm
800
800
600
600
450,0
450,0
-1
(a)
70,870,8
65
65
C–N
60
60
55
55
50
50
45
%T
45
40
40
35
35
1377,42
N–H
OH
Região de
hidratação
1377,42
%T
2925,95
1416,07
1237,01
1416,07
2925,95
C–O
1051,31
1051,31
1645,58
1645,58
30
C–C
1237,01
30
C–O
C=O
25
25
3435,85
3435,85
18,918,9
4000,0
4000,0 3600
3600
3200
3200
2800
2800
2400
2400
2000
2000
1800
1800
1600
cm-1
cm
1600
1400
1400
1200
1200
1000
1000
800
800
600
600
450,0
450,0
-1
(b)
Figura 8 - Espectro de infravermelho do (a) ácido hialurônico padrão, (b) ácido
hialurônico extraído – transmitância versus número de onda (cm-1).
80
4.4.2 Espectro de RMN 13C
O GAG extraído de crista de frango foi identificado através da espectroscopia
de RMN de
13
C. O espectro de RMN
13
C foi adquirido a 100,23 MHz em um
espectrômetro Bruker DPX400 a 50ºC, a amostra, sem nenhum tratamento após o
isolamento. Foi preparada diluindo-se 5 mg do sólido em 0,5 mL de D-2O, obtendose uma solução com pH 6,0. Os deslocamentos químicos foram calibrados em
relação ao 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfonato de sódio interno.
A numeração para atribuição dos sinais de carbono para o ácido hialurônico
está representada na Figura 9.
6
-O
O
3
2
O
CH3 2-acetamido-deoxi-β-Dglucopiranosideo
N
O
H
OH
glicopiranosideuronato (tradução livre)
1
5
O 4
1
5
HO 4
O
O
O
HO
3
2
OH
Figura 9 - Numeração adotada para atribuição dos sinais de RMN de 13C.
No espectro de RMN
13
C desta amostra foram observados os sinais do
polímero glicosaminoglicano, esses dados já haviam sido publicados por Bociek et
al., (1980); Volpi e Maccari (2003) em condições similares de pH, para ácidos
hialurônicos obtidos de outras fontes, confirmando a atribuição desta amostra de
ácido hialurônico.
81
No espectro de RMN
13
C (Figuras 10 e 11) foram determinados os
deslocamentos químicos para os carbonos das unidades β-Dglicopiranosideuronato,
onde foi observado um sinal em 176,96 ppm relativo ao CO2-. Em 106,06 ppm um
sinal para C-1, em 83,0 ppm um sinal correspondente ao C-4 e para C-5 foi
observado um sinal em 79,41 ppm. Um sinal correspondente ao C-3 em 76,70 ppm e
para C-2 foi observado um sinal em 75,59 ppm. Para a unidade 2-acetamido-deoxiβ-Dglucopiranosideo foi observado um sinal em 177,87 ppm relativo à carbonila (C2). Em 103,44; 85,68; 78,45; 71,62; 63,73 e 57,33 ppm sinais correspondentes aos
carbonos C-1, C-3, C-5, C-4, C-6 e C-2 respectivamente. Em 25,56 ppm observa-se
o deslocamento característico do carbono metílico. Os demais sinais observados no
espectro foram atribuídos a impurezas da matriz.
4.4.3 Fracionamento dos GAGs extraídos por cromatografia de troca iônica
O extrato de GAG total das cristas de frango foi fracionado em uma coluna
Mono-Q, sendo os resultados mostrados na Figura 12. Pode-se observar um pico
majoritário, correspondendo a 90 % do total de ácido hexurônico da amostra, eluindo
com ~ 0,4 M de NaCl, não exibindo metacromasia significativa. Essas propriedades
são características do AH quando aplicado nesta coluna. Pode-se também observar
um pico exibindo propriedade metacromática eluindo com concentração de NaCl
superior a 1 M, indicando a presença de GAGs sulfatados na amostra analisada.
82
Figura 10 - Espectro de RMN 13C {H} a 100 MHz do ácido hialurônico em D-2O.
83
Figura 11 - Espectro de RMN
13
C {H} a 100 MHz mostrando a expansão do ácido
hialurônico em D-2O.
Os glicosaminoglicanos não sulfatados como o AH não mudam de cor em
presença de DMB devido à desprotonação dos grupos carboxil, isso mostra que
outros fatores específicos além da densidade de carga do polímero, como grupos
sulfatados são requeridos para metacromasia com DMB. Em soluções com equilíbrio
entre corantes monômeros e dímeros a posição de equilíbrio não afeta a presença
de glicosaminoglicanos sulfatados, mas a interação com corantes monômeros ou
dímeros com poliânions produz uma nova espécie de absorção e remove a cor da
solução. O AH interage com corante dímero, formando uma nova espécie de
84
absorção ou a extinção de ambos monômeros e dímeros, criando de um novo
equilíbrio não apresentando metacromasia com DMB (TEMPLETON, 1988).
2000
1,4
DMB
carbazol
NaCl
1,2
90%
1500
0,8
1000
0,6
0,4
NaCl (mM)
Abs 525 nm
1,0
500
10%
0,2
0,0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
tubos
Figura 12 - Fracionamento dos GAGs extraídos da crista de frango por cromatografia
de troca-iônica. Amostra de GAG total ( ~ 500 µg em ácido hexurônico) foi aplicada
em coluna Mono Q-FPLC, previamente equilibrada com tampão Tris-HCl 20 mM, pH
8,0. A coluna foi submetida a um gradiente linear de NaCl (0 a 1,5 M), com fluxo de 1
mL/min, e coletadas alíquotas de 0,5 mL. As frações foram analisadas quanto à
metacromasia (•) e conteúdo de ácido hexurônico (ο).
85
4.4.4 Eletroforese em gel de agarose
Para identificar-se as espécies de GAGs presentes nas frações obtidas na
cromatografia de troca iônica, as mesmas foram agrupadas e submetidas a uma
eletroforese em gel de agarose, juntamente com o extrato total. A Figura 13 mostra o
gel corado com azul de toluidina, indicando a presença das espécies sulfatadas. Na
aplicação correspondente ao extrato total pode-se constatar a presença de duas
bandas,
exibindo
coloração
metacromática
com
mobilidades
eletroforéticas
semelhantes às de sulfato de dermatana e sulfato de condroitina. Também pode-se
observar uma banda não metacromática migrando entre os padrões de sulfato de
dermatana e sulfato de heparana. Esta última banda exibe intensa coloração azul
quando a lâmina é submetida à coloração com o corante Stains All (Figura 14),
indicando tratar-se de ácido hialurônico. Ao analisar-se as frações obtidas na
cromatografia de troca iônica, confirmou-se a presença majoritária de ácido
hialurônico como o GAG eluindo com ~ 0,4 M de NaCl, sendo os 10 % restantes
constituídos principalmente por cadeias de sulfato de dermatana e sulfato de
condroitina.
86
SC
SD
SH
Figura 13 - Eletroforese em gel de agarose do GAG total e das frações obtidas na
cromatografia de troca iônica. Coloração com azul de toluidina. P- Padrão, A1 - GAG
total, A2 - Fração I, A3 - Fração II da coluna de troca iônica, sulfato de condroitina,
sulfato de dermatana.
87
SC
SD
AH
SH
Figura 14 - Eletroforese em gel de agarose do GAG total e das frações obtidas na
cromatografia de troca iônica. Coloração com azul de toluidina e Stains-All. P Padrão, A1 - GAG total, A2 - Fração I, A3 - Fração II da coluna de troca iônica, sulfato
de condroitina, sulfato de dermatana.
4.4.5 Viscosidade intrínseca
A viscosidade intrínseca foi determinada em viscosímetro de bolas a partir
dos valores da viscosidade reduzida, calculados pelas relações apresentadas na
Tabela 1. Estes valores são mostrados na Tabela 4.
Tabela 4 Viscosidade reduzida para solução de AH extraída da crista de frango
Viscosidade reduzida mL/g
Concentração da solução extraída (g/mL)
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
11,39
10,19
9,13
8,71
8,11
88
Plotando os dados da Tabela 4 obtém-se a Figura 15, a partir das quais a
viscosidade intrínseca foi determinada mediante extrapolação da reta para zero. A
viscosidade intrínseca foi determinada como sendo de 1.190,6 mL/g.
Swann (1968b) trabalhando com crista de galo realizou a extração de AH com
água e purificação com clorofórmio e CPC. Inicialmente a solução extraída com água
apresentou viscosidade intrínseca de 4250 mL.g-1, quando purificou com clorofórmio
a viscosidade diminuiu para 3000 mL.g-1 e quando usou CPC a viscosidade caiu
para 2200 mL.g-1 dados um pouco superiores ao encontrado neste trabalho.
15,0
14,5
14,0
Viscosidade reduzida (mL/g)
13,5
13,0
12,5
[n] = 1190,6 mL/g
12,0
11,5
11,0
10,5
10,0
9,5
9,0
8,5
8,0
7,5
7,0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
C oncentração (g/m L)
Figura 15 - Viscosidade reduzida versus a concentração de AH extraído da crista de
frango.
89
4.3.6 Massa Molar
Como a viscosidade intrínseca de uma solução polimérica está relacionada
com a massa molar viscosimétrica média, calculou-se a massa molar do AH
aplicando a equação de Mark-Houwink-Kuhn-Sakurada. Quando o valor da
viscosidade intrínseca for maior do que 2960 mL/g, multiplica-se pelo fator 1,247
para corrigir o zero de cisalhamento (ARMSTRONG; JOHNS 1995; ARMSTRONG et
al., 1997). Sendo assim não foi preciso multiplicar por esse fator, pois o valor da
viscosidade intrínseca foi menor.
Massa Molar do AH extraído da crista de frango
η = K. (Mv) a
1190,6 mL/g = 5,075 . 10 –2 g/mL . Mv 0,716
Mv = 1,27 x 10 6 Da
A massa molar encontrada é similar à encontrada na literatura. Swann
(1968a, 1969) realizou a extração de ácido hialurônico da crista de galo com água e
encontrou massa molar de 1,2 x 106 Da, esse valor também é similar ao encontrado
por Yamada e Kawasaki (2005).
4.5 Otimização do método de extração de ácido hialurônico em escala piloto
Em função dos resultados obtidos nesta pesquisa e do método de extração
ter se mostrado viável, sugere-se uma otimização do método usado, no sentido de
reduzir o tempo gasto no processo de extração, tornando-o atrativo para a indústria
avícola.
90
4.5.1 Processo de extração
As cristas foram trituradas e colocadas em acetona para desidratação e
delipidação. Os tecidos foram secos e hidratados em tampão de digestão acetato de
sódio 100 mM, pH = 5,0, contendo cisteína 5,0 mM e EDTA dissódico 5,0 mM, na
proporção de 2,0 mL de tampão:100 mg de tecido seco. Posteriormente foi
adicionada solução de papaína [20 mg/mL], preparada na solução de acetato de
sódio descrita anteriormente, numa proporção de 0,5 mL:100 mg de tecido seco.
Segue-se incubação por 24 h a 60oC, centrifugação a 3200 rpm por 30 min e retirada
do sobrenadante. A seguir, foi adicionado ao sobrenadante CPC 10 % numa
proporção de 0,2 mL:100 mg de tecido seco e deixado em repouso por 24 h à 25oC.
A amostra foi centrifugada, o sobrenadante descartado e o pellet lavado com 3,0 mL
de solução de NaCl 2,0 M/etanol absoluto (100:15,v/v). Foram adicionados 2
volumes de etanol absoluto e deixado em repouso por 24 h a -16oC. Segue-se
centrifugação, descarte do sobrenadante e lavagem do pellet uma vez com 10 mL
de etanol 80 %. E nova centrifugação e secagem do pellet por 24 h a 25oC.
4.5.2 Evidências
Como resultado, este método proposto ofereceu um rendimento de 14,9 µg de
ácido hexurônico/mg de tecido seco. As etapas extintas não interferiram no
rendimento do ácido hexurônico.
A metodologia usada nesta pesquisa, para extração do ácido hialurônico,
consumiu aproximadamente oito dias. No método de extração de ácido hialurônico
91
em escala piloto, aqui proposto, gastou-se aproximadamente quatro dias, reduzindose os tempos consumidos em várias etapas do processo.
O custo da extração não é alto, pois foram usados somente reagentes
químicos de preço acessível e equipamentos comuns aos laboratórios de análises
químicas.
Em 2005, foram abatidas 17.566.405 cabeças/dia de frangos no Brasil,
segundo dados da ABEF (Associação Brasileira dos Produtores e Exportadores de
Frangos), UBA (União Brasileira de Avicultura), AFA (Associação Fluminense de
Avicultura) (OLIVO; OLIVO, 2006). Considerando-se que cada crista de frango
apresenta em média 3 gramas de peso úmido, são aproximadamente 52,7 toneladas
apenas deste subproduto. Neste trabalho obteve-se 2,0 µg ácido hexurônico/mg de
tecido úmido extraído das cristas de frangos, sendo que 90 % do ácido hexurônico
extraído corresponde a AH, multiplicando por 1,95 corresponde a 3,51 µg de ácido
hialurônico/mg de tecido úmido o que permite estimar-se a extração de
aproximadamente 185 kg de ácido hialurônico por dia, se todo este subproduto fosse
aproveitado com esta finalidade. Deve-se salientar que o ácido hialurônico possui
alto valor agregado (US$ 65,00/100mL), e não é produzido comercialmente no Brasil
(OGRODOWSKI, 2006). A crista de frango, subproduto da indústria avícola
destinado às graxarias, revela-se com grande potencial de uso pela indústria como
fonte do ácido hialurônico destinado à indústria médica, farmacêutica e cosmética.
4.6 Atividade antioxidante
A capacidade de seqüestrar o radical DPPH pelo AH extraído da crista de
frango foi medido e o resultado é mostrado na Figura 16.
92
Atividade seqüestrante %
100
80
60
AH extraído
AH padrão
40
20
0
10
50
100
250
500
Concentração µg/mL
Figura 16 - Capacidade de seqüestrar radicais livres do ácido hialurônico, extraído
da crista de frango e do ácido hialurônico padrão.
O ácido hialurônico extraído da crista de frango possui forte atividade para
seqüestrar o radical DPPH, não apresentando diferença significativa (p> 0,01) entre
o AH extraído e o AH padrão. O efeito seqüestrante do AH extraído variou de (83,9
% na concentração de 10 µg/mL a 87,3 % na concentração de 500 µg/mL) e o AH
padrão (77,63 % na concentração de 10 µg/mL a 85,1 % na concentração de
500 µg/mL).
Esses valores mostram que o AH extraído, pode ser usado como um
antioxidante natural para proteger o corpo humano contra radicais livres e retardar o
progresso de muitas doenças crônicas. Além de seu uso na medicina, pode ser
usado pela indústria alimentícia como um ingrediente natural com propriedade
antioxidante.
Estudos realizados por Campo et al., (2004), mostraram a atividade
antioxidante do AH e C4S em ratos induzidos com CCl4, provocando fibrinogênese.
93
O AH e C4S (4-sulfato de condroitina) em altas concentrações de (25 mg/mL) agiram
como potentes antioxidantes atenuando significativamente a peroxidação lipídica. A
provável hipótese sobre o mecanismo pelo qual o AH e o C4S reduzem radicais
livres está baseado nas suas estruturas. Os dois polímeros apresentam estruturas
com ligações cruzadas, com grupos carboxílicos em algumas posições. Esses
grupos carboxílicos podem interagir com íons metálicos como Cu2+ ou Fe2+ que são
responsáveis pela iniciação da reação de Fenton. Essas moléculas podem funcionar
como quelantes de metais.
Ai et al., (2007), determinaram a atividade antioxidante da quitosana isolada
de larvas de moscas in vitro pelo método de DPPH em várias concentrações e
verificaram que a quitosana possui capacidade de seqüestrar radicais livres. O efeito
da quitosana sobre o radical livre DPPH foi de 57,1 % na concentração de 0,5
mg/mL, valor inferior ao encontrado neste experimento pelo ácido hialurônico
extraído na menor concentração (10 µg/mL), que foi de 83,94 %.
Pesquisas recentes realizadas por Knatt, Chander e Sharma (2008)
mostraram que a combinação de quitosana e extrato de hortelã, na mesma
proporção, agem como potente antibacteriano e agente antioxidante e pode ser
usada para preservar e aumentar o shelf life de carnes e produtos cárneos. Como a
quitosana e o ácido hialurônico são polímeros com estruturas semelhantes, é
provável que o ácido hialurônico adicionado a produtos cárneos, possa também
agir como antioxidante.
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente estudo, nas condições em que foram
realizados os experimentos, permitem as seguintes conclusões:
Das duas metodologias testadas, a que utiliza digestão enzimática mostrou
um rendimento maior em ácido hexurônico.
O método de extração utilizado não diminuiu a massa molar do ácido
hialurônico.
O cloreto de cetilpiridínio foi mais seletivo para precipitar o ácido hialurônico
que o etanol, apresentando uma solução mais límpida.
O método proposto em escala piloto, reduziu o tempo de extração com o
mesmo rendimento em ácido hexurônico, favorecendo a indústria avícola.
As cristas de frangos de animais de 48 dias apresentaram 14,9 µg de ácido
hexurônico/mg de tecido seco, sendo que 90 % do ácido hexurônico corresponde a
AH o que equivale a 26,15 µg de ácido hialurônico/mg de tecido seco.
O aproveitamento das cristas de frango mostra-se viável pela indústria
avícola, devido o grande número de abates diários e o rendimento em ácido
hialurônico.
95
A alta massa molar do ácido hialurônico extraído indica que pode ser usado
nas áreas médica, farmacêutica e cosmética.
O ácido hialurônico extraído da crista de frango mostrou forte atividade
antioxidante in vitro.
5.1 Sugestões para novos trabalhos
Este trabalho, não pretende esgotar o tema, uma vez que possui algumas
limitações. Com base no estudo desenvolvido e nos resultados obtidos neste
trabalho, com a intenção de abrir perspectivas para ampliar o conhecimento
científico, sugere-se como recomendação para novos trabalhos, alguns temas:
•
Determinar a atividade antioxidante do ácido hialurônico extraído da crista de
frango in vivo.
•
Adicionar o ácido hialurônico extraído em produtos cárneos e avaliar a
atividade antioxidante do ácido.
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