Área de concentração: Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos
Laboratório de Desenvolvimento
de Processos Biotecnológicos
Defesa de dissertação de mestrado
Influência de Peptonas Vegetais no Cultivo
de Streptococcus zooepidemicus para a
Produção de Ácido Hialurônico
Aluno: Leandro Junqueira Benedini
Orientadora: Profa Dra. Maria Helena Andrade Santana
Sumário
 Introdução
 Artigo 1: Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção
Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico.
 Artigo 2: Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de
Placas Petri e Produção de Ácido Hialurônico.
Ácido Hialurônico
Propriedades Físico-Químicas
Estrutura altamente hidratada
Ácidos D-Glicurônico e N-acetilglicosamina
H - Face hidrofóbica
Moléculas pequenas difundem no domínio aquoso
Moléculas grandes são excluídas
Propriedades
viscoelásticas
Ácido Hialurônico
Fontes de obtenção
Fonte
Massa molar (Da)
Fluido sinovial
1,0 - 8,0 × 106
Cordão umbilical
3,6 - 4,5 × 106
Crista de galo
12 - 14 × 106
Humor vítreo bovino
0,38-2,08 × 106
(Adam e Ghosh, 2001; Iqbal et al., 1997.)
(Kogan et al., 2007 e Pires, 2009)
Ácido Hialurônico
Aplicações
 Oftalmologia;
 Ortopedia;
 Proteses;
 Cura de feridas;
Dermatologia.
 Liberação controlada
de fármacos
Azari et. Al (2011),
Ácido Hialurônico
Os recursos animais e microbianos
Recursos animais
Complexo processo de purificação
Riscos de infecções virais
Riscos de reações alérgicas
Produção microbiana
Início em 1980
Microorganismos do gênero Streptococcus
Mesma estrutura química
Massa molar: 2,4-3,4 × 106 Da
Melhor qualidade do produto
Streptococcus zooepidemicus
 Microorganismos gram-positivos e
anaeróbicos
 Bactérias láticas nutricionalmente
fastidiosas
 Requerem meio de cultivo rico para
crescimento
 Produção de AH
 AH sintases
 Cápsula de proteção
 Ocultação de sistemas imunológicos
Chong et. al (2005)
Caminhos metabólicos de
Streptococcus zooepidemicus: De glicose a AH
Biopolímero
Extracelular
(a)
(b)
(a) Metabolismos homolático e (b) misto
HAS,hyaluronate synthase; NOX, NADH oxidase; LDH, lactate dehydrogenase; PFL,pyruvate formate lyase;
PDH, pyruvate dehydrogenase; ADH, alcohol dehydrogenase; AK, acetate kinase
Condições operacionais
 pH
 Entre 6,5 e 7,5 (Akasaka, 1998)
 Choques de pH: Maior
produção de células e AH
(Pires, 2009)
 Aeração
 Maior crescimento (Chong e
Nielsen, 2003)
 AH com maior massa molar
(Akasaka et al., 1989)
 Maior concentração de AH
(Chong & Nielsen, 2003)
 Agitação
 Relação com transferência de
oxigênio
 Tensão mecânica: Danos à
cadeia polimérica
Fontes de energia
 Fontes de carbono
 Produção dependente de AH (Pires, 2009)
 Maior produção de AH (1,21 g.L-1) em cultivo com 25 g.L-1
glicose (Pires, 2009)
 Fontes de nitrogênio
 Hidrolisados de caseína, aminoácidos, peptonas e extrato
de leveduras (Batistote, 2006 e Pires, 2009)
 Responsáveis por crescimento microbiano e produção de
metabólitos de interesse
Preparação de inóculos
Streptococcus equi subsp. zooepidemicus ATCC 39920,.
I
Remoção de células
II
Adição de células
Inóculo líquido, 12 h
III
Componentes das placas Petri: BHI (Brain Heart Infusion)
Sangue de carneiro
Fermentações em batelada
-Fontes de carbono
- Fontes de nitrogênio
- Sem controle de pH
- Sem alimentação de oxigênio
- Menor turbulência
- Fontes de carbono
- Fontes de nitrogênio
- Controle de pH
- Alimentação de oxigênio
- Maior turbulência
Recuperação de Ácido Hialurônico
As impurezas no AH recuperado
 Extrato de leveduras (EL)
 Fonte microbiana
 Grande quantidade de
aminoácidos essenciais
 Meio com muitas
proteínas
 Peptonas vegetais (PVs)
 Fonte vegetal
 Quantidade relevante de
aminoácidos essenciais
 Muitos peptídeos
Table 1 – Total and free amino acids contents in
soy (SP) wheat (WP) and potato (PP) peptones. Data
from the manufacturer Organotechnie (France). Pg 34.
Fonte: Organotechnie
Objetivos:
 Substituição de extrat0 de leveduras por PVs
em fermentações
 Produção de AH
 Proteínas ou peptídeos
associados
 Substitução de BHI e sangue de carneiro por PS
em placas Petri.
 Adaptação celular
 Produção de AH
Artigo 1
Influência de Peptonas Vegetais Sobre a Produção
Microbiana e Pureza do Ácido Hialurônico.
Objetivos
 Substituição de extrato de leveduras por peptonas
vegetais
 Peptona de soja (SP)
 Peptona de batata (PP)
 Peptona de trigo (WP)
 Mistura de PVs (MPV)
 Quantificação de proteínas ou peptídeos retidos em
AH produzido
 Estudo cinético de fermentações.
Procedimento experimental
 Quantificação de nitrogênio e glicose nas peptonas:
 Método de Kjeldahl
 Kit de determinação de glicose Laborlab.
Table 2 - Total nitrogen (TN), total protein and peptides (TPP) and glucose (G) in the vegetable
peptones and in the yeast extract in the fermentation media at the starting of the fermentations
Métodos e Análises
 Crescimento celular
 Método gravimétrico
 Quantificação de
proteínas ou petídeos
 Método de Lowry
 Purificação de AH
 Precipitação com
etanol
 Ressuspensão em NaCl
 Quantificação de AH
 Método do carbazol
modificado
 Ácidos orgânicos
 HPLC
 Massa molar
 HPLC
Table 3 - Performance of the vegetable peptones and yeast extract on the production of HA from Streptococcus
zooepidemicus (ATCC 39920) during 24h fermentation and its purity after three precipitations with ethanol.
HA – Hyaluronic acid; YP/X - HA production per cell growth; YP/S - HA production per glucose consumption; YX/S - Cell growth
per glucose consumption; YLactate/S - Lactate production per glucose consumption; YAcetate/S - Acetate production per glucose
consumption; FE – Free essential amino acids; TE – Total essential amino acids; TPP - Total proteins and peptides; MW – Average
molecular weight.
Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar
weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■)
media.
Figure 1 – Kinetic profiles of (a) cell growth (b) nitrogen (c) glucose (d) HA concentration (e) HA molar
weight and (f) lactate concentration along cultivations of Streptococcus zooepidemicus in SP (♦) and WP (■)
media.
Conclusões
 SP é a peptona vegetal mais promissora
 Fermentação com SP: 0,28 g.L-1 de AH
 Fermentação com YE: 0,21 g.L-1 de AH
 Fermentações com SP produzem AH com menor quantidade de
proteínas e peptídeos (TPP) e com mesma massa molar
 Fermentação com SP: 1,4 g.g-1
 Fermentação com YE: 4,1 g.g-1
 Tempo recomendável para fermentação: 5 horas.
Artigo 2
Efeitos da Peptona de Soja sobre Preparação de
Placas Petri e Produção de Ácido Hialurônico.
Objetivos
 Utilização de SP em placas Petri
 Definição de composição mais apropriada.
 Validação com fermentações
Procedimento experimental
 Preparação de placas Petri
 BHI e sangue de carneiro
 SP e sangue de carneiro
 SP
 Meios de cultivo
 SP e glicose
 Relação glicose/N = 7.8
Métodos e Análises
 Crescimento celular
 Método gravimétrico
 Ácidos orgânicos
 HPLC
 Purificação de AH
 Precipitação com
etanol
 Ressuspensão em NaCl
 Quantificação de AH
 Método do carbazol
modificado
 Massa molar
 HPLC
Table 1 - Performance of the fermentations with substitutions of the animal nutrient
sources, Brain Heart Infusion and sheep blood, by soy protein in the first seed culture medium
Streptococus zooepidemicus (ATCC 39920) in Petri plates.
Conclusões
 A substituição de sangue de carneiro e BHI por SP em
inóculos sólidos levou a produção similar de AH
 Sem substituição: 0,29 g.L-1
 Com substituição: 0,30 g.L-1
 A utilização de SP em inóculos sólidos levou a
produção de AH com massas molares semelhantes
Sugestões
 Planejamento experimental para estimativa da ótima
relação C6H12O6/N.
 Planejamento experimental em reatores, para
estimar a ótima rotação e vazão de alimentação de
oxigênio do fermentador.
 Utilização de peptona de soja em fermentações com
choque ácido.
 Desenvolvimento de novos métodos para purificação
do AH.
Bibliografia

ARMSTRONG, D.C. The molecular weight properties of hyaluronic acid produced Streptococcus zooepidemicus. Queensland:
University of Queensland, 1997. (PhD. Thesis).

BLANK, L.M., MCLAUGHLIN, R.L., NIELSEN, L.K. Stable production of hyaluronic acid in Streptococcus zooepidemicus
chemostats operated at high dilution rate. Biotechnol. Bioeng., v.90

CHONG, B.F.; BLANK, L.M.; MCLAUGHLIN, R.; NIELSEN, L.K. Microbial hyaluronic acid production. Appl. Microbiol.
Biotechnol., v.66, n.4, p.341-351, 2005.

HELDIN, P. (2003) Importance of hyaluronan biosynthesis and degradation in cell differentiation and tumor formation.
Brazilian Journal of Medical and Biological Research. Brasil, pp. 967-973.

IZAWA, N.; HANAMIZU, T.; SONE, T.; CHIBA, K. (2010) Effects of fermentation conditions and soybean peptide
supplementation on hyaluronic acid production by Streptococcus thermophilus strain YIT 2084 in milk. Journal of Bioscience
and Bioengineering. Pp. 356-360.

JOHNS, M.R.; GOH, L.T.; OEGGERLI, A. Effect of pH, agitation and aeration on hyaluronic acid production by Streptococcus
zooepidemicus. Biotechnol. Lett., v.16, n.5, p.507-512, 1994.

PIRES, A., MACEDO, A.C., EGUCHI, S.Y., SANTANA, M.H.A. Microbial production of hyaluronic acid from agricultural
resource derivatives. Bioresource Technology 101, 6506-6509, 2010.

PIRES, A., SANTANA, M.H.A. Metabolic Effects of the Initial Glucose Concentration on Microbial Production of Hyaluronic
Acid. Appl Biochem Biotechnol (2010) 162, 1751–1761, 2010.

ZISU, B.; SHAH, N. (2003) Effects of PH, temperature, suplementation with whey protein concentrate, and adjunct cultures on
the production of Exopolysacharides by Streptococcus thermophylus 1275. Journal of Dairy Science. Pp 3405-3415.