UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA
ECOFISIOLOGIA DE PLANTAS DA CAATINGA
Introdução
O Espectrofotômetro e os medidores de sais
• Exames
–
Colesterol, triglicerídeos,
glicose, ácido úrico, etc.
AULA 1
Introdução a Espectroscopia,
Lei de Lambert Beer
• Exames
Marcelo Francisco Pompelli
Tipos de Espectrofotômetro
–
Como eles são analisados?
Tipos de Espectrofotômetro
Tipos de Espectrofotômetro
amostra
tela de cristal
líquido
teclado para entrada de
informações
tela de cristal líquido ou PC?
entrada para pen drive
3
1
Lâmpada de xenon,
emissora de fonte de luz
Detector de referência,
funciona para calibração
do aparelho e desconto
do “zero” de referência
Funcionamento dos Espectrofotômetros
1 – bacterioclorofila a
2 – clorofila a
3 – clorofila b
4 – ficoeritrbilina
5 – β-caroteno
2
Intensidade de
luz incidente I0
Monocromador, funciona
como um prisma,
selecionando o
comprimento de onda
adequado
Mocrocromador
Detector ou tela
lâmpada
emissora de luz
4
5
Intensidade de
luz transmida I
Detector, mostrará
um valor, dependendo
da absorvância
Vai depender do
comprimento de onda
escolhido
Carrossel automático
para até seis
cubetas, seis leituras
ao mesmo tempo
Funcionamento dos Espectrofotômetros
• Ao passar pela cubeta é comum que a
luz seja transmitida com características
distintas da luz emitida (ex. maior
comprimento de onda, menor energia)
Cubeta com a
amostra a ser
analisada
Lei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer
• Absorção de luz pelas moléculas
• A fração de luz incidente absorvida por uma solução num
determinado comprimento de onda é relacionada com a
espessura do caminho óptico e a concentração da
amostra.
–
uma ampla faixa de biomoléculas absorvem luz num determinado
comprimento de onda
•
–
–
Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm
Coeficiente de extinção Molar
(M-1 L-1 cm-1) próprio de cada
substância a ser analisada
a medição da luz absorvida por uma biomolécula através do
espectrofotômetro é usada para detectar, identificar e quantificar
moléculas num determinado material biológico
Para tanto deve-se levar em consideração a Lei de Lambert-Beer
A=εcL
Absorbância ou
absorvância
Concentração(M)
Caminho ótico (cm),
profundidade da
cubeta, geralmente 1
cm
Lei de Lambert-Beer
Lei de Lambert-Beer
Coeficiente de extinção molar
• Quanto maior a concentração (c) ou maior o caminho
óptico (L) maior será a absorbância da amostra, por isso
geralmente o L é padronizado em 1 cm
• Como vimos a profundidade do caminho óptico interfere
na absorbância da solução
• O coeficiente de extinção molar varia
• Exemplo:
–
com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbância de uma solução
com concentração 0,002 mol L-1 de uma substância com absortividade
molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma célula com 2,00 cm de
caminho óptico.
ε
–
A=
–
A = 313 L mol-1 cm-1 x 0,002 mol L-1 x 2 cm
–
A = 1,252
–
Como visto a aborbância não tem unidade
C
L
Pico máximo de absorção de luz
• Porém, quando o caminho óptico é fixado (geralmente
1 cm) a absorbância é diretamente proporcional a
concentração da amostra
• Sendo assim, deve-se ter consciência que todo e qualquer
objeto que interrompa o caminho óptico vai “atrapalhar” a
leitura, podendo dar uma falsa impressão de aumento da
concentração
Pico máximo de absorção de luz
0,8
• Mas como determinar isso para uma substância
desconhecida?
0,6
• Simples
–
varre-se a solução com diferentes comprimentos de onda
–
quando se desconhece completamente a natureza da
substância pode-se usar comprimentos de onda que vão
desde o UV até o ultravioleta.
Absorbância
• Como vimos toda biomolécula apresenta um comprimento
de onda específico onde a absorção de luz é máxima
com a natureza da substância analisada
–
com o tipo de solvente utilizado
–
com o comprimento de onda utilizado
–
com o pH da solução
Como se calcula o coeficiente de absorção molar
• Uma vez que se tenha o pico de absorção máxima da
molécula, basta fazer uma sequência de diferentes
concentrações e medir a absorbância respectiva.
• De posse dos valores de absorbância, você pode calcular
o coeficiente de extiñção molar através da fórmula A = ε c
L
0,4
• Exemplo:
0,2
580 nm
0
300
–
400
500
600
700
Comprimentos de onda (nm)
–
800
900
1000
A = 0,351 e C = 0,01563 mM L-1, qual será o ε?
–
0,351 = ε x 0,01563 mM L-1 x 1cm
–
ε = 0,351 / 0,01563
–
ε = 22,46 mM L-1 cm-1
Como se calcula o coeficiente de absorção molar
0,8
Absorvância (nm)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,005
0,01
0,015
0,02
-1
Concentração (g L)
0,025
0,03