XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-VÍRUS DA DIARREIA
VIRAL BOVINA-1 EM AMOSTRAS DE SOROS BOVINOS
DO ESTADO DO RIO GRANDE DO SUL
Marcelo Honorato da Silva¹, Jéssica Tatiane Sauthier ², Eduardo Furtado Flores3 e Luciana de Oliveira
Franco4
Introdução
O Vírus da Diarreia Viral Bovina (Bovine Viral Diarrhea Virus, BVDV) é considerado um dos
principais patógenos de rebanhos bovinos. Este vírus pertence à família Flaviviridae, gênero Pestivirus
(Flores et al., 2000). Está dividido em duas espécies relacionadas, genética e antigenicamente, BVDV-1 e
BVDV-2 (ICTV, 2013). A infecção por BVDV está associada a várias manifestações clínicas, como
enfermidade gastroentérica aguda ou crônica, doença respiratória em bezerros, síndrome hemorrágica
com trombocitopenia e patologias cutâneas e imunossupressão (Brownlie, 1990). Entretanto, as
manifestações clínicas mais comumente encontradas deste vírus estão relacionadas a fenômenos
reprodutivos (Brownlie, 1990). A infecção antes ou após a cobertura ou inseminação artificial pode
resultar em perdas reprodutivas, tais como infertilidade temporária, retorno ao cio, mortalidade
embrionária ou fetal, abortos ou mumificação, malformações fetais, nascimento de bezerros fracos e
inviáveis e de animais persistentemente infectados (PI) (Brownlie, 1990). Caso as infecções ocorrerem
entre 50 e 100 dias de gestação, antes do feto desenvolver competência imune, ocorre uma infecção
persistente assintomática porque os bezerros desenvolvem uma tolerância ao vírus e assim são
denominados animais PI (Tizard, 2008). O teste de soroneutralização viral (SN), um dos métodos de
diagnóstico, é rotineiramente utilizado para detectar e mensurar os anticorpos contra BVDV, sendo
considerado como teste padrão para a titulação de anticorpos (Flores et al., 2005).
O presente trabalho teve como objetivo realizar a detecção de anticorpos contra BVDV-1 em amostras
de soro de bovinos do Rio Grande do Sul, enviadas ao Setor de Virologia da Universidade Federal de
Santa Maria, período 01 de janeiro de 2013 a 31 de julho de 2013.
Material e métodos
A.
Células e vírus
Os procedimentos do teste de soroneutralização (SN) foram realizados em células de linhagem de rim
bovino (MDBK) livres de Pestivirus. As células foram cultivadas em meio essencial mínimo (MEM),
contendo penicilina (10.000 U/mL), estreptomicina (10 mg/ mL), ciprofloxacim (500 mg/50ml),
Anfotericina B (250 μg/mL) e suplementado com 10% de soro equino. A cepa padrão de BVDV-1 Singer
foi utilizada nos testes de neutralização viral.
B.
Amostras de soro
Foram testadas 1137 amostras de soros bovinos de aproximadamente 73 municípios do Rio Grande
do Sul (RS) enviadas ao Setor de Virologia da Universidade Federal de Santa Maria (SV/UFSM) durante
o período de 01 de janeiro de 2013 a 31 de julho de 2013. As amostras de soros, recém-chegadas e
refrigeradas, foram aliquotadas em microtubos e identificadas. Para a realização do teste sorológico, as
amostras foram previamente inativadas em banho-maria a 56°C durante 30 minutos. Este procedimento
inativa o sistema complemento evitando que o mesmo seja citotóxico para os cultivos celulares.
Posteriormente, as amostras permaneceram congeladas no freezer -20°C até a realização do teste de SN.
C.
Sorologia
As amostras de soro foram testadas para a presença de anticorpos neutralizantes contra BVDV-1 pela
técnica de SN. Os testes foram realizados utilizando-se diluições crescentes de soro, partindo de 1:5 até
1:320, frente a doses constantes de vírus (100 DICC50 – doses infectantes para 50% das células/cavidade)
utilizando células MDBK como indicador da replicação viral.. A leitura dos testes foi realizada após 96
horas de incubação através do monitoramento do efeito citopático.
Resultados e discussão
¹ Primeiro autor é aluno de graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE. Rua Dom
Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos - CEP: 52171-900 - Recife/PE. Email:[email protected]
² Segundo autor é estudante de graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria,
RS, Brasil. CEP: 97105-900. Email: [email protected]
3
Terceiro Autor autor é professor do Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal
de Santa Maria (UFSM), Avenida Roraima, n. 1000,Santa Maria, RS, Brasil. Email: [email protected]
4
Quarto Autor é Professora do Departamento de Microbiologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE. Rua Dom
Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos - CEP: 52171-900 - Recife/PE. E-mail: [email protected]
XIII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de dezembro.
A pesquisa de anticorpos anti-BVDV-1 em amostras de soros bovinos pelo teste de SN detectou que,
do total de 1137 amostras testadas, 629 delas apresentaram resultado positivo, ou seja, apresentavam
anticorpos contra o vírus, o que representou aproximadamente 55 % do total de amostras. As amostras
negativas somaram 453, cerca de 40 % das amostras testadas. Acrescentam-se ainda neste resultado as
amostras consideradas insuficientes para a realização do teste, as quais totalizaram 18 amostras (em torno
de 1%). As amostras foram consideradas insuficientes por apresentar volume inferior a 40 μL (volume
mínimo requisitado para realização do teste de SN). Durante leitura dos resultados foi observada a
presença de amostras tóxicas. A toxicidade é um achado frequente em amostras de soro enviadas para
diagnóstico, o que na maioria das vezes impossibilita a realização da técnica de SN por danos ao cultivo
celular. Essas amostras contabilizaram 37 sobre o valor total (cerca de 3%). Outras 17 amostras recebidas
durante esse período foram classificadas como impróprias e não obtiverem resultado através do teste, pois
não se encontravam em condições ideais para serem testadas.
O resultado positivo para anticorpos contra BVDV-1 encontrado no teste de SN indica exposição
prévia ao agente, entretanto não indica a causa desta exposição, se os anticorpos encontrados foram
induzidos através de vacinação ou de infecção natural. Frente a isso, a sorologia pareada é um método
eficaz de diagnóstico diferencial, que consiste na comparação do título de anticorpos de duas amostras do
mesmo animal, coletadas com intervalo de 14 a 20 dias e mantidas em um banco de soros individual
(Flores & Schuch, 2007). Caso algum bovino apresente sinais clínicos compatíveis com BVDV, é
possível enviar duas amostras de soro, uma coletada no momento da visualização dos sinais clínicos
juntamente com outra coletada há 14 - 20 dias (Flores & Schuch, 2007). No teste de SN, um aumento de
quatro vezes no título de anticorpos é denominado soroconversão e indica infecção (Barcellos et al.,
2009).
Os resultados obtidos neste trabalho indicam que há circulação do BVDV-1no rebanho do Rio Grande
do Sul, visto que parte das amostras enviadas com sintomatologia clínica e não vacinados obtiveram
sorologia positiva. Os animais vacinados apresentaram sorologia positiva, porém variaram os títulos
encontrados, desde títulos considerados baixos (1:5 a 1:20) até altos títulos ( acima de 1:80), sendo estes
últimos indicativos de eficácia na vacinação.
Referências Bibliográficas
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Disponível em: http://www.lume.ufrgs.br/bitstream/handle/10183/17458/000719137.pdf?sequence=1.
Brownlie, J. The pathogenesis of bovine viral diarrhea virus infections. Revue Scientifique et Technique
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v.
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Disponível
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p.129-135, 2000. Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/cr/v30n1/a21v30n1.pdf. DOI: 10.1590/S010384782000000100021.
Flores E.F., Weiblen R., Vogel F.S.F., Roehe P.M., Alfieri A. A. & Pituco E.M. A infecção pelo vírus da
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Brasileira, v.25, p.125-134, 2005. Disponível em: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100736X2005000300002&script=sci_arttext. DOI: 10.1590/S0100-736X2005000300002.
Flores, E.F.; Schuch, L.F.D. Diarreia Viral Bovina. In: Riet-correa, F.; Lemos, R. A.A.; Mendez, M. D.
C.; Schild, A. L. Doenças de ruminantes e equídeos. Santa Maria: Pallotti, p. 81-93, 2007.
ICTV: International Committee on Taxonomy
http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp.
of
Viruses,
2013.
Disponível
em:
Tizard, I. R. Imunologia Veterinária. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. v. 8, 587 p.
¹ Primeiro autor é aluno de graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE. Rua Dom
Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos - CEP: 52171-900 - Recife/PE. Email:[email protected]
² Segundo autor é estudante de graduação em Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria,
RS, Brasil. CEP: 97105-900. Email: [email protected]
3
Terceiro Autor autor é professor do Setor de Virologia, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Universidade Federal
de Santa Maria (UFSM), Avenida Roraima, n. 1000,Santa Maria, RS, Brasil. Email: [email protected]
4
Quarto Autor é Professora do Departamento de Microbiologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, UFRPE. Rua Dom
Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos - CEP: 52171-900 - Recife/PE. E-mail: [email protected]