Objetivos Gerais
FFI0772
ADRIANO D.
D ANDRICOPULO
RAFAEL V. C. GUIDO
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
¾
Enzimas: Funções, Nomenclatura e Propriedades
Fundamentos da Cinética Enzimática
Cinética Enzimática: Michaelis-Menten
Ensaios Cinéticos: Padronização e Validação
Parâmetros Cinéticos: vo, KM, Vmax, kcat, kcat/KM
Análise Gráfica: Lineweaver-Burk e Regresão Não-Linear
Inibição Enzimática
Tipos e Mecanismos de Inibição
Determinação de IC50 e Ki
Exemplos de Inibidores Enzimáticos
BIBLIOGRAFIA
BIBLIOGRAFIA
¾ Material didático das aulas
¾ Bibliografia: livros de cinética enzimática, bioquímica,
química orgânica e química medicinal
¾ WILLIAMS,
S, D.A.,, LEMKE,, T.L. Foye's
oye s Priniples
p es of
o Medicinal
ed c a Chemistry,
C e st y, 5a edição,
ed ção,
Philadelphia, EUA: Lippincott Williams & Wilkins, 2002.
¾ PATRICK, G.L. An Introduction to Medicinal Chemistry, 2a edição, Nova Iorque,
EUA: Oxford, 2001.
¾ BARREIRO, E.J., FRAGA, C.A.M. Química
í
Medicinal. As Bases Moleculares da Ação
ã
dos Fármacos, Porto Alegre: Artmed, 2001.
¾ SOLOMONS, G., FRYHLE, C.B. Organic Chemistry, 7a edição, Nova Iorque, EUA:
John Wiley & Sons,
Sons 2000.
2000
¾ ALLINGER, N.L., CAVA, M.P., JONGH, D.C., C.R. JOHNSON, C.R., LEBEL, N.A.,
STEVENS, C.L. Química Orgânica, 2a edição, Guanabara Dois, Rio de Janeiro, 1978.
SILVERMAN,, R.B. The
e Organic
O ga c Chemistry
C e st y of
o Drug
ug Design
es g and
a d Drug
ug Action,
ct o , San
Sa Diego,
ego,
¾ S
EUA: Academic Press, 1992.
¾ LEHNINGER, A.L., Bioquímica, 2.ed., São Paulo, Editora Edgard Blücher, 1976.
¾ STRYER, L., Bioquímica, 3ªed., Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan, 1992.
¾ JENCKS, W. Catalysis in Chemistry and Enzymology –– Dover Pub.1987.
¾ FERSHT, Enzyme Structure and Mechanism. San Francisco, W. H. Freeman and
Company, 1977.
ENZIMAS
ENZIMAS E INIBIDORES ENZIMÁTICOS
Por Quê?
ALVOS MOLECULARES
1
As proteínas são fundamentais para a vida
ENZIMAS COMO
ALVOS BIOLÓGICOS
“Druggable Genome”
“Genoma com Potencial
de Fármaco”
ENTIDADES QUÍMICAS
Í
Sildenafil
O Mais
M i Vendido
V did
O QUE HÁ EM COMUM ENTRE
SÃO INIBIDORES ENZIMÁTICOS
Ÿ o fármaco mais vendido
Ÿ o fármaco mais consumido
2
Ÿ o fármaco mais “popular”
popular
da indústria farmacêutica em todos os tempos?
Atorvastatina
O Mais
M i Consumido
C
id
Ato astatina
Atorvastatina
Ácido Acetilsalicílico
Ácido Acetilsalicílico
Seletividade
ESTRUTURAS
COX-1 e COX-2
O Mais
M i Popular
P
l
Valina
(Cox-2)
Isoleucina
(Cox-1)
Sildenafila
Sild
Sildenafila
fil
ESPAÇO QUÍMICO
QUÍMICO-BIOLÓGICO
BIOLÓGICO
ENZIMAS
E
nzimas são consideradas por muitos laboratórios
farmacêuticos os alvos moleculares mais atrativos para
intervenção de doenças humanas através de moléculas
pequenas
Isso se deve ao seu papel catalítico essencial em muitos
processos fisiológicos
fi i ló i
que afetam
f
diretamente
di
estados
d
de
d
desordens, disfunções ou doenças
ENZIMAS
Os fatores determinantes para a catálise enzimática se
ENZIMAS
Projetos de descoberta de fármacos, comumente, se
aplicam apropriadamente na inibição através de moléculas
pequenas (candidatas a novos fármacos)
beneficiam da avaliação in vitro de moléculas contra enzimasalvo
O estudo da inibição enzimática passa essencialmente pelo
entendimento de parâmetros cinéticos da enzima-alvo
Parâmetros como afinidade, potência e seletividade podem ser
quantificados a partir de ensaios in vitro
ENZIMAS
ENZIMAS
A importância
i
â i d
de ensaios
i
bi
biológicos
ló i
de
d elevada
l
d qualidade
lid d é
evidente neste processo
Fase farmacodinâmica X fase farmacocinética X Atividade
Biológica X Efeito Terapêutico
Transformações metabólicas de xenobióticos, incluindo a
maioria dos fármacos, são catalisadas por enzimas
Interações com enzimas metabólicas da família do citocromo
P450 (CYP) – otimização de propriedades farmacocinéticas
essenciais
ENZIMAS
ENZIMAS
D t forma,
Desta
f
é importante
i
t t que o pesquisador
i d
tenha
t h um
conhecimento sólido da atividade enzimática e das
maneiras apropriadas de avaliar as interações entre
enzimas e inibidores
http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/
CATÁLISE ENZIMÁTICA
Reações Catalíticas
Esquema de reação química catalisada por uma enzima
CATÁLISE ENZIMÁTICA
CATÁLISE ENZIMÁTICA
Reações Catalíticas
Proximidade e Orientação
ENZIMA
¾ As moléculas devem se aproximar, estar na orientação correta, e alcançar
o patamar mínimo de energia para iniciar a reação
As enzimas não alteram a energia livre de Gibbs ('G) das reações e exercem seu poder
catalítico através da diminuição da energia de ativação dos sistemas ('G‡)
¾ As enzimas catalisam reações, eliminando o caráter randômico das
reações
CATÁLISE ENZIMÁTICA
ENZIMAS
Proximidade e Orientação
Atividade Catalítica
ENZIMA
ENZIMA
ENZIMA
ENZIMA
PRODUTO
COFATORES
PROXIMIDADE: as enzimas se ligam aos substratos de forma que seus grupos
reativos se aproximam para que a reações catalíticas possam ocorrer
ocorrer. Este
processo elimina a natureza randômica das colisões em soluções livres
ORIENTAÇÃO: mesmo que a colisão de duas moléculas ocorra de forma
randômica, seus grupos reativos podem não estar necessariamente na orientação
correta que permita a reação ocorrer
ENZIMAS
CINÉTICA
Atividade Catalítica
Controle da velocidade de reações
A atividade catalítica depende muitas vezes da presença de
moléculas pequenas denominadas cofatores
Apoenzima
+
cofator
=
holoenzima
A cinética enzimática estuda a velocidade de reações catalisadas por
enzimas
Sem Cofator
ou Ligante
Moléculas
Orgânicas
Coenzimas
Grupos
Prostéticos
As reações enzimáticas diferem das outras reações químicas em vários
aspectos
CINÉTICA
CATÁLISE ENZIMÁTICA
Controle da velocidade de reações
Reações Catalíticas
(i) As velocidades de reação são mais elevadas: uma reação catalisada por um
enzima pode ser 106 a 1017 vezes mais rápida que uma reação não catalisada, e
várias
á
ordens
d
de
d grandeza
d
mais rápida
á d que uma reação
ã catalisada
l d por um
catalisador inorgânico.
(ii) Condições de reação mais suaves: as reações catalisadas por enzimas ocorrem
em condições relativamente suaves – temperaturas baixas, pressão atmosférica,
e pH próximos da neutralidade
neutralidade.
(iii) Elevada especificidade: as enzimas têm alta especificidade nas reações
catalisadas.
Muitas reações
ç
nos sistemas biológicos
g
não ocorreriam em p
proporções
p ç
mensuráveis na
ausência de enzimas. As enzimas aceleram as reações por fatores na ordem dos milhões
CINÉTICA
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
Controle da velocidade de reações
Ação do catalisador de paládio sobre carvão
H3C
Catálise Química
H
H
H
H
H
H3C
H
Exemplo: hidrogenação com catalisador de carvão-paládio
Superfície de paládio
H3C
CH3
H3C
CH3
+
H2
Pd/C
H3 C
H 3C
H
CH3
CH3
H
H3C
H
H3C
H
Superfície de paládio
Superfície de paládio
CH3
CH3
H3C
H3C
H
Superfície de paládio
CH3
CH3
H
Superfície de paládio
CH3
CH3
CINÉTICA
CINÉTICA
Controle da velocidade de reações
Controle da velocidade de reações
Catálise Enzimática
O sítio ativo de uma enzima
Produtos
Substrato
Sítio ativo
Ligação do substrato no
sítio ativo da enzima
Aminoácidos presentes no sítio ativo podem ter dois papéis principais:
Ligação (binding): o resíduo de aminoácido está envolvido diretamente na ligação do
substrato ao sítio ativo
ENZIMA
E•S
E•P
E+P
Catalítico (catalytic): o aminoácido está envolvido diretamente no mecanismo de
reação
Lei de Beer-Lambert:
absorbância
(Ofixo)
constante
(para um Ofixo)
AO = HOc.l
distância percorrida
pelo feixe luminoso
p
através da amostra
A intensidade I do feixe diminui a
medida que passa pela amostra
Amostra em
solução
concentração
da solução
absorvente
Monocromador
A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo
constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e
demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade ótica e
concentração
Onde: H = absorbtividade molar ou coeficiente de extinção molar, uma constante
característica para uma dada substância absorvente.
Para o NADH a 340 nm, H = 6200 L mol-1 cm-1 (ou M-1 cm-1)
c = concentração de NADH em mol/L
l = comprimento da amostra em cm (usual 1 cm para cubetas padrões)
Detector
1 cm
Fonte de luz com
comprimento de onda
selecionável
Io
I
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Definições e Fundamentos
Definições e Fundamentos
1,0 unidade de atividade enzimática (enzyme unit, U ou EU) é definida
como a quantidade de enzima que causa a transformação de 1 μmol (10-6
M) de substrato por minuto (250C, condições padrões de ensaio) (U = μmol
min-1). A atividade se refere ao total de unidades de enzima em solução.
A atividade específica
p
é o número de unidades de enzima p
por mg
g total de
proteína. A atividade específica é uma medida da pureza da enzima, e
aumenta de acordo com a evolução do processo de purificação de uma
enzima e torna
torna-se
se máximo e constante quando a enzima está
completamente pura.
¾ Atividade
d d enzimática
á
= unidades
d d d
de enzima / volume
l
d
de solução
l ã
(e.g., units / mL)
¾ Atividade
Ati id d Específica
E
ífi
= unidades
id d de
d enzima
i
/ mg total
t t l de
d proteína
t í
¾ A atividade específica de uma solução de enzima depende diretamente da
sua pureza
A atividade específica aumenta durante o processo de purificação,
purificação alcançando um
máximo quando a enzima estiver totalmente pura e ativa
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Atividade Enzimática versus Atividade Específica
Atividade Enzimática versus Atividade Específica
Mesma atividade total da enzima (em vermelho)
66 KDa
45 KDa
30 KDa
Proteína Pura
Maior especificidade (em vermelho)
22 KDa
Atividade Específica = atividade enzimática / total de proteína. Ou seja, mols convertidos por
unidade de tempo por massa de proteína.
13 KDa
A atividade
ti id d específica
ífi aumenta
t d
durante
t o processo de
d purificação,
ifi
ã alcançando
l
d seu máximo
á i
quando E = 100% pura e ativa
Atividade enzimática = mols convertidos por unidade de tempo
É a própria atividade catalítica da enzima, em geral expressa em unidades de velocidade, ou
seja, massa transformada por unidade de tempo (μmol min-1)
Sucessivas etapas de purificação geralmente diminuem o total de proteína. Uma
proteína p
p
pode ser considerada p
pura q
quando etapas
p adicionais de p
purificação
ç
não
melhoram a atividade específica e quando somente uma espécie de proteína pura
pode ser detectada.
ATIVIDADE ENZIMÁTICA
Definições
A atividade enzimática é uma função da quantidade de enzima
(unidade prática,
á
1 EU = 1 μmol min-1) (SI, 1 katal = mol s-1)
Atividade Específica = atividade enzimática / massa total de enzima presente
(unidade prática
prática, μmol mg-11 min-11 ou μmol μg-11 min-11)
A atividade enzimática é uma medida da eficiência, usualmente constante para um
enzima pura. Se a atividade específica de uma enzima pura é conhecida, uma amostra
impura da enzima deverá apresentar atividade específica menor, permitindo o cálculo da
pureza
% pureza = 100% x atividade específica
í
da amostra de enzima / atividade específica
í
da
enzima pura