Estudo genético de populações de Aedes aegypti (diptera:
culicidae) do sul do Brasil, pela técnica de RAPD-PCR
Área Biológica
Murilo Fernandes Pedroso, PIBIC (CNPq)
Curso de Ciências Biológicas, Campus Tubarão
Orientadora: Drª Onilda Santos da Silva
Introdução
Resultados
A dengue tem sido considerada a arbovirose humana de maior importância
epidemiológica, pois afeta 56 países no mundo (WHO, 2002). Segundo o
Ministério da Saúde (2008), de janeiro a março foram registrados 120.413 casos
de dengue clássica, 647 casos de febre hemorrágica da dengue e 48 óbitos.
O principal transmissor dessa arbovirose ao homem é o Aedes aegypti. A
dispersão desse mosquito ocorre através do vôo dos adultos, e no Brasil, o
transporte passivo de ovos, larvas e adultos, por via rodoviária, também propicia
a disseminação desta espécie para todas as regiões.
Um estudo sobre o fluxo gênico dessas populações de Ae. aegypti poderia
fornecer indicativos sobre uma possível variação genética da espécie. Desta
forma, seria possível predizer se há isolamento genético ocasionado pela
distância das populações do sul do Brasil em relação ao resto país, ou se são
espécimes recentemente introduzidos de regiões endêmicas de dengue, o que
possibilitaria grandes epidemias também nessa região do país. Poderia-se
discutir também se essa diferença ou semelhança genética nas populações da
região sul, em relação a outras do país, pode influenciar no modo como os
mosquitos podem ter habilidade de transmitir a arbovirose.
Assim, este estudo visa contribuir para um melhor entendimento sobre
fluxo gênico em populações de Ae. aegypti da região sul do país, bem como
servir de base para futuros estudos com esta ou outras técnicas de biologia
molecular.
Os resultados obtidos na pesquisa não contemplaram na sua totalidade
os objetivos propostos, o que, entretanto, não invalida os dados obtidos e as
soluções apontadas.
Inicialmente, as larvas obtidas das Secretarias de Saúde foram
identificadas com o auxílio da chave de identificação proposta por Oliveira &
Consoli (1994), o que revelou a existência de espécies de Aedes albopictus
presentes entre os Ae. aegypti.
Durante o processo de extração do DNA, o protocolo sugerido no projeto
não se apresentou eficiente, o que de imediato não revelou a presença de
material genético ao final do processo de extração. Sendo assim, várias
modificações foram realizadas na tentativa de estabelecer um protocolo de
extração eficiente.
Finalmente, após manutenção do transiluminador UV, troca de reagentes
e novos testes, obteve-se um extração com o protocolo supracitado. No
entanto, algumas das amostras não apresentaram arraste de banda e sim brilho
na poli – o que pode ser explicado pela ausência de proteinase K no processo
de extração.
Objetivos
Geral: Estudar diferenciações genéticas em populações de Aedes aegypti de
diferentes regiões do sul do Brasil, usando marcadores genéticos pela técnica de
RAPD-PCR.
Específicos:
- Comparar geneticamente as populações da região sul do Brasil;
- Comparar geneticamente as populações da região sul com outras de zonas
endêmicas do país, como Rio de Janeiro e Recife;
- Descrever os padrões de diferenciação ou similaridade das populações de Ae.
aegypti das diferentes regiões do Brasil;
- Entender os padrões de infestação desses mosquitos nas diferentes regiões do
sul do Brasil.
Fig.1 – Preparação de alíquotas de DNA
Fig.2 – Cuba de eletroforese
Metodologia
Conclusões
Para a realização do estudo, utilizou-se larvas de Aedes aegypti obtidas
através das Secretarias de Saúde dos estados de Santa Catarina, Rio Grande do
Sul e Paraná.
A metodologia para extração de DNA baseou-se no protocolo de extração
de DNA de mosquito (Cheung et al., 1993 modificado por Roseli Wassen). Sendo
assim, macerou-se uma larva de cada cidade em microtubo de 1,5 mL contendo
160μL de tampão de extração (Tris-HCl 200mM pH8,0, NaCl 2M, EDTA 70mM.
Em seguida, adicionou-se 20μL de SDS 10% e submeteu-se o macerado a
incubação por uma hora, a 60ºC.
Após resfriamento a temperatura ambiente, foram adiconados 50μL de
clorofórimio: álcool isoamílico (24:1) e o produto foi centrifugado por quinze
minutos, a 13.000 rpm. Transferiu-se o sobrenadante para um novo microtubo,
ao qual adicionou-se 80μL de acetato de amônio 7,5M e 300μL de etanol 96%,
homogeinizando as amostras por inversão.
A solução foi novamente encubada, por duas horas a -20ºC, e em seguida
centrifugada a 13.000 rpm por vinte minutos. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado lavado com etanol 70%.
Finalmente o DNA foi submetido a spin de quinze segundos em centrífuga
e encubado em estufa a 37ºC para secagem. Em seguida, o DNA foi
ressuspenso em 20μL de água MiliQ estéril e armazenado em freezer a -20ºC.
Para a verificação da presença de DNA, as amostras (sem amplificação)
foram submetidas à eletroforese à 60 V, em agarose gel 1,2%, corados em
solução de brometo de etidio (1/ml) para visualização em transiluminador UV.
Os objetivos propostos no projeto não foram alcançados. Entretanto,
apesar dos resultados obtidos diferirem dos esperados, os mesmos apontam
novos caminhos para a busca de soluções e assim reafirmam o caráter
permanente de constante busca em pesquisa. Sendo assim, novos estudos se
fazem necessários para a o estabelecimento de protocolos eficientes.
Bibliografia
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WHO - World Health Organization. Dengue prevention and control. Wkly Epidemiol Rec. 2002; 76:
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