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AVALIAÇÃO DA FOTOTOXICIDADE
RELATÓRIO FINAL
Nome do Produto
Suplemento Mineral Itajiporã
Lote
Fab: 02/05/2012
Validade
Exp: 02/05/2013
CÓDIGO DO PRODUTO: 12-36036-01
CÓDIGO DO ESTUDO: TRI-S-FOTO-36036-01-31-01-13
CÓDIGO DO RELATÓRIO: TRI-S-FOTO-36036-01-31-01-13_PT-BR
DATA DO RELATÓRIO: 07/02/2013
PATROCINADOR: Empresa Mineradora Itajiporã Ltda. - ME
Sítio Santo Antônio s/n
Bairro Itaiporâ
Ouro Fino – MG
CNPJ: 06.205.733/00041-49
Telefone: +55 (19) 3044-4616
INVESTIGADOR: TRIDSKIN Laboratórios Ltda.
Av. Dr. Romeu Tórtima, nº 452/466 – Barão Geraldo
13084-791 – Campinas – SP – Brasil
Telefone: +55 (19) 3789-8600
RELATÓRIO PRINCIPAL
TRIDSKIN Laboratórios Ltda.
Av. Dr. Romeu Tórtima, 452/466, Barão Geraldo
Telefone: +55 (19) 3789-8600 – Fax: +55 (19) 3289-3956
13084-791 – Campinas – São Paulo – Brasil
e-mail: [email protected]
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1. INTRODUÇÃO
A fototoxicidade é definida como uma resposta tóxica de uma substância aplicada ao corpo, o qual é
aumentada após exposições subsequentes à luz; ou que seja induzida pela irradiação da pele depois da ad ministração sistêmica de uma substância. O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU é usado para identificar o potencial fototóxico de uma substância teste induzido pelo químico excitado após exposição à luz. O
teste avalia a foto-citotoxicidade pela redução relativa da viabilidade das células expostas à amostra teste
na presença versus a ausência de luz. As substâncias com respostas positivas a este teste são identificadas
como fototóxicas in vivo, seguindo aplicação sistêmica com subsequente distribuição pela pele, ou depois
de uma aplicação tópica.
O ensaio de fototoxicidade in vitro 3T3 NRU é baseado na comparação da citotoxicidade de uma
amostra teste quando testada na ausência e na presença de exposição a doses não-citotóxicas de irradia ção UVA. O ensaio de citotoxicidade por captação do vermelho neutro (NRU, “Neutral Red Uptake”) é um
ensaio quimiosensitivo de sobrevivência/viabilidade celular baseado na habilidade de células viáveis em incorporar e ligar vermelho neutro (NR), um corante supravital. Vermelho neutro é um corante catiônico que
penetra a membrana celular por difusão não-iônica e acumula intracelularmente nos lisossomos. Alterações
na membrana lisossomal leva a fragilidade lisossomal e outras mudanças que gradualmente começam a ser
irreverssíveis. Estas alterações resultam na diminuição da capacidade de captação do vermelho neutro.
Este resultado possibilita distinguir entre viabilidade, dano e morte celular, o qual é a base deste ensaio. Cé lulas Balb/C 3T3 saudáveis, quando mantidas em cultura, continuamente se dividem e se multiplicam com o
tempo. Uma substância química ou mistura destas substâncias, de acordo com o sítio ou mecanismo de
ação, irá interferir com este processo e resultará na redução do crescimento. Citotoxicidade é expressa com
uma concentração dependente da redução na captação do corante vermelho neutro (NRU) após um dia (=
um ciclo celular) da exposição à amostra teste.
Princípio: Células Balb/C 3T3 são mantidas em cultura por 24 horas a temperatura 37ºC e 5% CO2.
Duas placas de 96 poços para cada amostra teste são pre-incubadas com 8 diferentes concentrações desta
amostra por 1 hora. Após este tempo, uma placa é exposta a 5J/cm2 de UVA, enquanto a outra é mantida
no escuro. Ambas as placas são então lavadas e adicionado meio de cultura e deixadas incubar por mais 24
horas. Após este período, a viabilidade celular é determinada pela captação do vermelho neutro (“Neutral
Red Uptake”, NRU). A viabilidade celular é expressa como porcentagem em relação às células não tratadas.
Para predizer o potencial fototóxico, as respostas das concentrações obtidas na presença e na ausência da
irradiação são comparadas e calculada a concentração que inibiu em 50% a viabilidade celular (IC50).
2. OBJETIVO
Avaliar o potencial fototóxico da amostra teste pelo método Balb/C 3T3 NRU, de acordo com protoco lo descrito pela OECD 432.
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3. PRODUTO INVESTIGACIONAL
As informações do produto, conforme declaradas pelo Patrocinador, estão descritas no Anexo 1. Uma
amostra do produto será catalogada e encontrar-se-á em nossos arquivos, onde será mantida por um período de um ano.
Identificação
Código do Pro-
Nome do Produto
Lote
Validade
Suplemento Mineral Itajiporã
Fab: 02/05/2012
Exp: 02/05/2013
duto
12-36036-01
amento
O produto fornecido pelo patrocinador foi armazenado na sala de amostra do centro de pesquisa com tem peratura controlada e acesso restrito.
4. PERÍODO DO ESTUDO
A duração total da pesquisa foi de 32 dias.
• Início: 17/12/2012
• Final: 18/01/2013
5. METODOLOGIA
5.1. Materiais e Equipamentos
• Estufa – 37,5ºC, umidade, 5% CO2
• Banho maria, 37,5ºC
• Microscópio de contraste de fase
• Centrífuga
• Balança analítica
• Simulador Solar
• Agitador orbital
• Hemocitômetro
• Micropipetas
• Frascos de cultura
• Placas de 96 poços
• Meio de cultura DMEM
• Glutamina 200mM
• Soro Fetal Bovino
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• Solução Tripsina/EDTA
• Solução tampão PBS com e sem cálcio
• Solução penicilina/streptomicina
• Corante Vermelho Neutro
• Etanol
• Tetraciclina
• Ácido Acético glacial
• Leitora de Placas SpectraMax M5 (Molecular Devices)
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5.2. Procedimento
Tempo (h)
0h
Procedimento
4
Foi feito plaqueamento das células 3T3 a uma densidade de 1x10 cel/poço, em placas de
96 poços, em meio de cultura contendo 10% soro fetal bovino (SFB). As células foram
Incubadas a 37,5ºC e 5% CO , ambiente úmido por 24 horas.
2
24hs
Após o período de incubação, as células foram lavadas com PBS-Ca+2 e tratadas com 100ul
de várias concentrações da amostra em PBS-Ca+2 por poço. Quatro placas de 96 poços
foram utilizadas: duas tratadas com várias concentrações de Tetraciclina como controle
positivo e duas com várias concentrações da amostra. Uma placa do controle foi exposta à
UVA 5J/cm2 e outra deixada no escuro. O mesmo foi feito para a amostra. As células foram
incubadas por mais 24 horas a 37,5ºC e 5% CO , ambiente úmido.
2
48hs
Após o período de tratamento, as células foram lavadas com PBS-Ca+2 e incubadas por 3
horas (37ºC, 5%CO2) com vermelho neutro. Depois, as células foram lavadas novamente
com PBS e feito a liberação do vermelho neutro utilizando uma solução de dessorção. A
absorbância de cada poço contendo esta solução é lida a 540nm. É feito o cálculo do IC50
através da curva dose-resposta obtida.
5.3. Análise dos Resultados
O cálculo da viabilidade celular expressa em NRU é feito para cada concentração da amostra teste
pelo uso da média de NRU de seis valores de replicatas por concentração teste. Este valor é comparado
com a média NRU de todos os valores do Controle Negativo (CN). A viabilidade celular relativa é então ex pressa como porcentagem do controle não tratado. As oito concentrações da amostra teste podem obter va lores desde concentrações sem efeito até concentração com total efeito sobre a inibição da viabilidade celular.
5.3.1.Cálculo
Para aplicar as regras para predizer o potencial fototóxico de uma substância (PM, “Prediction Model”) é necessária a análise da concentração fototóxica em curva dose resposta obtida na presença e na ausência de irradiação UV. Existem duas versões de PM, uma baseada na comparação de simples concentrações (PIF) e outra baseada na comparação de duas curvas (MPE). Para aplicar o modelo PIF, qualquer procedimento apropriado pode ser usado para calcular o valor de EC50. Para aplicar o modelo MPE, é necessário utilizar um programa de software especial (a TRIDSKIN está adquirindo este programa com a ZEBET).
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Determinação do EC50 por PIF
Quando foi possível, a concentração da substância teste que refletiu a inibição de 50% da viabilidade celular (EC50) foi determinada. Isto pode ser feito aplicando um simples método gráfico. Neste caso
utilizou-se escala X=log e Y=probit, que na maioria dos casos a resposta tornou-se linear.
Versão original baseado no fator de fotoirritação (PIF)
Este modelo de predição está baseado na comparação equitativa de duas concentrações citotóxicas (EC50) da substância química obtidas na presença (+UV) e na ausência de UV (-UV), os quais são usados para calcular o fator de fotoirritação (PIF):
Equação 1: PIF= {EC50 (-UV)}/{EC50 (+UV)}
Analises discriminadas de PIF obtidos em estudos de prevalidação revelaram um valor de cut-off
de PIF=5 para potencial fototoxico. A classificação resultante é:
>PIF= {Cmax (-UV)}/{EC50 (+UV)}
Se PIF < 5: potencial não fototóxico. Se PIF > 5: potencial fototóxico
O valor de PIF pode ser calculado somente se a curva dose-resposta do químico, na presença e
na ausência de UV, cair para valores menores que 50%. Se um químico for somente citotóxico na presença
de UV e não citotóxico na ausência de UV, o PIF não poderá ser calculado. Entretanto, este é um resultado
indicativo de potencial fototóxico. Neste caso, o valor >PIF pode ser calculado se o teste de citotoxicidade
na ausência de UV for realizado até a maior concentração (Cmax) e este valor é usado para calcular o valor
>PIF:
Equação 2: >PIF = {Cmax (-UV)}/{EC50 (+UV)}
Como >PIF não é um valor exato, nenhum procedimento bioestatístico pode ser aplicado para determinar o cut-off ótimo. Consequentemente, a regra para a classificação deve ser:
Se somente um “>PIF” pode ser obtido, então qualquer valor >1 prediz potencial fototóxico.
Se ambos EC50 (-UV) e EC50 (+UV) não podem ser calculados devido ao fato que a substância
química testada não mostra qualquer citotoxicidade até a concentração máxima testada, isto indica nenhum
potencial fototóxico. Neste caso um valor formal de “PIF = 1” é usado para caracterizar o resultado:
Equação 3: PIF = *1 = {Cmax (-UV)}/{Cmax (+UV)}
Um “PIF = *1” prediz não possui potencial fototóxico
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6.RESULTADOS
6.1. Controle Positivo Tetraciclina
O controle positivo Tetraciclina foi pesado e diluído diretamente em PBS-Ca +2 obtendo-se uma concentração inicial de 30 mg/ml, sendo feita várias diluições para as concentrações finais de:
3,00; 1,00; 0,30; 0,10; 0,03; 0,01; 0,003 e 0,001 mg/ml. As pesagens foram feitas em ambiente estéril, não
sendo necessário realizar a filtragem da solução de tratamento tanto para a amostra quanto para o padrão.
Foram feitas duas curvas dose-resposta para o padrão Tetraciclina (gráficos 1 e 2), uma na ausência e outra na presença de radiação UVA. Os resultados abaixo são representativos de um ensaio.
Gráfico 1. Curva Dose-Resposta para Tetraciclina em % Viabilidade Celular (NRU).
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Gráfico 2. Aplicação da Linha de Tendência para encontrar valor de EC 50 para Tetraciclina
6.2. Amostra 36036-01
A amostra foi diluída diretamente em PBS-Ca +2(solução tampão fosfato com cálcio), de forma mais estéril possível, sem passar pela fase de filtragem, a fim de eliminar possível adsorção da amostra pelo filtro
ou perda dos sólidos no filtro. A concentração final desta suspensão foi de 0,3% (correspondente a 3mg/ml)
em PBS-Ca+2. As outras concentrações testadas foram feitas a partir desta solução/dispersão mãe.
Gráfico 3. Curva dose-resposta da amostra 36036-01, em % de viabilidade celular.
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7. DISCUSSÃO
Segue na tabela 2 os valores de EC50 obtidos para as células tratadas com várias concentrações da
amostra 12-36036-01 na presença (+UV) e na ausência (-UV) de radiação UVA, os valores de PIF obtidos e
a classificação final de fototoxicidade obtidos em cada experimento e do controle positivo Tetraciclina.
Tabela 2. Valores de EC50 (-UV), EC50 (+UV), PIF e classificação.
Amostras
EC50 (- UV)
EC50 (+ UV)
PIF
Classificação
Tetraciclina
0,5049 mg/ml
0,0136 mg/ml
37,22
Fototóxico
12-36036-01
ND*
ND*
ND*
Não Fototóxico
*ND = Não determinado
Existe um ligeiro decaimento na porcentagem de viabilidade celular medido pela captação de vermelho neutro nas células tratadas com a amostra Suplemento Mineral Itajiporã e presença de UV. Entretanto,
não ocorre decaimento suficiente para determinar o valor de EC 50 (concentração que inibe em 50% a viabilidade celular). Sendo assim, através dos critérios adotados pela OECD 432, a amostra é considerada “Não
Fototóxica” nas concentrações testadas.
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8.CONCLUSÃO
Os valores de EC50 para a amostra Suplemento Mineral Itajiporão não foram determinados, indicando que a amostra tenha classificação “Não fototóxica” para o teste de Fototoxicidade.
Este relatório destina-se exclusivamente ao uso interno da Empresa Mineradora Itajiporã Ltda., não
podendo ser utilizado em quaisquer veículos de comunicação sem autorização por escrito do autor.
Os resultados e conclusões apresentados se aplicam somente às amostras recebidas para análise
não podendo ser estendidos por correlação ou similaridade. Quando necessário vincular o estudo realizado
com a fórmula do produto testada, esta estará anexada ao corpo deste documento quando autorizado e fornecida pelo solicitante da análise.
Responsável pelo Estudo
Responsável Técnico
Lucas Offenbecker Guerra
Simone Fanan Hengeltraub
07/02/2013
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9.REFERÊNCIAS
ECVAM DB-ALM (2002). “3T3 NRU Phototoxicity Assay”, INVITTOX Protocol nº 78
OECD 432 (2004).“OECD Guideline for Testing of Chemicals: In Vitro 3T3 NRU phototoxicity test”; Adopted:
13 April 2004.
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ANEXO 1 - INFORMAÇÕES DO PRODUTO
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