UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
ANA JULIA VON BORELL DU VERNAY FRANÇA
O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS
L929
Itajaí
2015
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
ANA JULIA VON BORELL DU VERNAY FRANÇA
O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS
L929
Dissertação submetida à Universidade do Vale do
Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do
grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientadora: Profa. Dra. Nara Lins Meira Quintão
Co-orientador: Prof. Dr. José Roberto Santin
Itajaí, Maio de 2015
Dedico ao meu ao pai Helcio von Borel du Vernay
o qual me ensinou logo cedo que a vida dependia
de mim e de tudo que eu pudesse carregar comigo
mesma. Ajudou-me a entender a importância de
se criar raízes fortes para fortalecer os frutos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço profundamente às minhas filhas; Laura e Clara as quais mudaram de
escola, mudaram suas rotinas, me acompanharam e me apoiaram em todos os
momentos deste trabalho. Doaram espontaneamente o tempo e os momentos
que seriam delas para que eu pudesse chegar até o fim.
Agradeço ao meu marido, Orlando, pelo incansável apoio emocional me
mantendo no centro para que o objetivo fosse concluído. Foi pai, mãe,
conselheiro e revisor de todos os cálculos de diluição deste trabalho.
À minha mãe, irmãos e a querida Laís pelas constantes palavras de apoio.
À minha colega Gislaine “Gi” pelo companheirismo de as horas, por treinar-me
e passar todo o seu conhecimento para que eu pudesse trabalhar com o
cultivo celular.
Á técnica Viviane pela amizade, força e por cuidar para que tudo estivesse
sempre impecável no laboratório de cultivo.
Aos colegas de laboratório pelo apoio, amizade conquistada e pela constante
troca de conhecimento.
Às professoras Caroline Valente e Kathryn pelo conhecimento e ajuda
prestada.
À minha orientadora Nara por transmitir mesmo de longe a confiança e o
conhecimento necessário para que eu chegasse até aqui.
Ao meu co-orientador José Roberto, por aceitar o desafio no meio do caminho,
por ter estado sempre disponível, transmitindo o seu conhecimento e me
apoiando nos momentos mais difíceis.
O PAPEL DAS CININAS E A INFLUÊNCIA DO FATOR DE NECROSE
TUMORAL (TNF) NA PROLIFERAÇÃO IN VITRO DE FIBROBLASTOS
L929
Ana Júlia von Borell du Vernay França
Maio/2015
Orientadora: Nara Lins Meira Quintão, Doutora.
Co-orientador: José Roberto Santin, Doutor.
Área de concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas
Número de Páginas: 83
A barreira da pele desempenha um papel importante na manutenção da homeostase do ser humano e
o processo de reparo do tecido cutâneo é considerado um fator crítico. Embora o papel de cininas como
um importante mediador da inflamação seja bem descrito, o seu envolvimento no reparo tecidual ainda
não foi totalmente explorado. A proliferação de fibroblastos é um evento chave na cicatrização do
tecido, uma vez que participa diretamente na formação de tecido de granulação. Modelos in vitro para
a avaliação da cicatrização por proliferação de fibroblastos são amplamente utilizados, no entanto eles
não foram avaliados na presença de fatores inflamatórios importantes, tais como as citocinas e as
cininas. Na tentativa de aproximar o modelo in vitro das condições reais de lesão cutânea com a
evidência de um processo inflamatório, este estudo avalia a co-participação do TNF e das cininas sobre
a proliferação de fibroblastos através do modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de
fibroblastos L929 com o objetivo de propor uma nova metodologia para estudo in vitro de cicatrização
cutânea. Para este estudo realizou-se um rasgo em cultura de monocamada de fibroblastos murino
(L929), na presença ou ausência de TNF (droga utilizada para gerar o estresse celular semelhante ao
processo inflamatório inicial) e / ou agonistas do receptor de cinina B 1 e B2. Os resultados obtidos
inicialmente com TNF demonstram que esta citocina foi capaz de aumentar a proliferação celular, a
qual foi bloqueada com o co-tratamento com o respectivo anticorpo, sugerindo a importância dos
estímulos inflamatórios para o processo de regeneração tecidual. As cininas parecem potencializar este
efeito proliferativo exercido pelo TNF, principalmente através da ativação do receptor B 2. No entanto,
para confirmar esta hipótese novos experimentos são necessários para analisar a expressão dos
respectivos receptores em células tratadas ou não com TNF, BK e DABK. Os resultados obtidos no
presente trabalho em conjunto com dados da literatura, mostraram que esta estratégia é uma
ferramenta disponível para a investigação do processo de cicatrização in vitro.
Palavras-chave: Cininas. Fibroblastos. Receptor B1 e B2 para cininas. Reparo
tecidual.
THE ROLE OF A KININS AND THE INFLUENCE OF TUMOR
NECROSIS FACTOR ALFA (TNF-α) ON IN VITRO PROLIFERATION
OF L929 FIBROBLASTS
Ana Júlia von Borell du Vernay França
May /2015
Supervisor: Nara Lins Meira Quintão, PhD.
Co-Supervisor: José Roberto Santin, PhD.
Area of Concentration: Natural products and bioactive synthetic substances
Number of pages: 83
The skin barrier plays an important role in maintaining homeostasis of the human
being, and the cutaneous tissue repair process is considered a critical factor. Although
the role of kinins as important mediators of inflammation is well described, their
involvement in tissue repair has not been fully explored. Fibroblast proliferation is a
key event in healing, as it participates directly in the formation of granulation tissue. In
vitro models for the evaluation of healing by fibroblast proliferation are widely used,
however, they have not been evaluated in the presence of important inflammatory
factors, such as cytokines and kinins. Seeking to bring the in vitro model closer to the
real conditions of skin injury with the evidence of inflammatory process, this study
evaluates the effect of kinins on the proliferation of murine fibroblasts, stimulated or
not by tumor necrosis factor (TNF), with the aim of proposing a new methodology for
in vitro wound healing study. The Scratch Assay was used, in a monolayer culture of
murine fibroblasts (L929), in the presence or absence of TNF (drug used to generate
cellular stress similar to the initial inflammatory process) and/or the kinin receptor
agonists B1 and B2. Based on the results obtained with the cytokine TNF, which was
capable of increasing the cell proliferation that was successfully blocked by cotreatment with the respective antibody, the importance of inflammatory stimuli for
tissue regeneration is suggested. Kinins appear to potentiate this proliferative effect
exerted by TNF, mainly through the activation of the B2 kinin receptor. However, to
confirm this hypothesis, new experiments are necessary, to analyze the respective
receptor expression in cells treated or not with TNF, BK and DABK. These results,
together with the literature data, show this strategy as an available tool for the in vitro
healing investigation.
Keywords: kinins, fibroblasts, B1 and B2 receptors, wound healing
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Camadas da pele
19
Figura 2
Anatomia da pele humana e efetores celulares
21
Figura 3
Linha do tempo de migração de populações de células
imunitárias correlacionadas com as fases de cicatrização de
feridas
23
Figura 4
Cascata de formação das Cininas
31
Figura 5
Modelo de placa com 24 poços para cultivo celular
38
Figura 6
Modelo de Scratch wound “in vitro”
39
Figura 7
Esquema do procedimento In vitro de “Scratch model”
39
Figura 8
Esquema de tratamento das células com TNF em diferentes
tempos de contato
40
Figura 9
Esquema de tratamento das células com agonista receptor
B2 (BK) em diferentes concentrações
41
Figura 10
Esquema de tratamento das células com agonista receptor
B1 (DABK) em diferentes concentrações.
41
Figura 11
Esquema de tratamento com o agonista do receptor B2, BK,
em células pré tratadas com TNF
42
Figura 12
Esquema do tratamento com o agonista do receptor B 1,
DABK, em células pré tratadas com TNF.
43
Figura 13
Esquema do tratamento com os antagonistas do receptor B1
e B2, anticorpo anti TNF e PDTC, administrados após o pré
tratamento com TNF
44
Esquema do tratamento com os agonistas do receptor B 1 e
B2 pré tratadas ou não com o TNF e coadministradas ou 45
não com o anticorpo anti TNF
Figura 14
Figura 15
Imagens da monocamada de fibroblastos L929 antes e após
o ensaio de Scratch
47
Figura 16
Efeito do tratamento com TNF sobre a proliferação de
fibroblastos quando incubados por diferentes tempos com
TNF
48
Figura 17
Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações
na proliferação de fibroblastos, sem o estímulo do pré- 50
tratamento com o TNF
Figura 18
Efeitos do tratamento com DABK em diferentes
concentrações na proliferação de fibroblastos, sem o
estímulo do pré tratamento com o TNF
51
Figura 19
Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações
na proliferação de fibroblastos, com o estímulo do pré- 52
tratamento com o TNF
Figura 20
Efeitos do tratamento com DABK em diferentes
concentrações na proliferação de fibroblastos, com pré
estímulo do TNF
53
Figura 21
Imagem da proliferação celular com tratamento de TNF e
dos agonistas dos receptores cininérgicos , BK e DABK,
sem e com o pré estímulo do TNF
54
Figura 22
Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de
fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré
estímulo do TNF
56
Influência dos receptores cininérgicos e a participação do
TNF na proliferação de fibroblastos L929
58
Figura 23
Figura 24
Imagem do efeito do tratamento as células com o anticorpo
anti TNF em coadministração com TNF e desafiadas com
os agonistas BK e DABK com sem a presença dos
antagonistas cininérgicos HOE-140 e DALBK
59
LISTA DE ABREVIATURAS
α-SMA -
α-actina de músculo liso
AMPc -
Monofosfato cíclico de adenosina
ANOVA -
Análise de variância
APP -
Aminopeptidase P
BK -
Bradicinina
COM -
carboxipeptidases M cinenase I de membrana
CPN -
carboxipeptidases N cinenase I do plasma
DABK -
des-Arg9-Bradicinina
DALBK -
Leu8-des-Arg9-Bradicinina
DC -
Células dendrítica
DMEM -
Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DMSO -
Dimetilsulfóxido
EGF -
Fator de crescimento epidérmico
ECA -
Cininase II, enzima conversora de angiotensina I
FGF -
Fator de crescimento fibroblástico
ERK 1/2 -
Kinase regulada por sinais intracelulares
GMPC -
Monofosfato cíclico de guanosina
HMWK -
Cininogênio de alto peso molecular
IL-1α, IL-1β, IL- 10
Interleucinas
LMWK -
Cininogênio de baixo peso molecular
LPS -
Lipopolissacarídeo de membrana
Lys-BK -
Calidina
MAPK -
Proteínas quinases ativadas por mitógenos
MMP-1-13; MT1
Metalaproteinases
NF- kB -
Fator de transcrição nuclear Kappa B
NEP -
Endopeptidase neural
NO -
Óxido nítrico
RNAm -
RNA mensageiro
PAF -
Fator de agregação plaquetária
PDTC -
Pirrolidina ditiocarbamato
PBS -
Solução de tampão fosfato
PDGF -
Fator de crescimento derivado das plaquetas
PGE2
PKC -
Prostaglandina E2
Proteína quinase C
SFB –
Soro fetal bovino
TGF-β -
Fator de crescimento transformador β
TGF-α -
Fator de crescimento transformador α
TNF -
Fator de necrose tumoral
TNFRI -
Receptor I de fator de necrose tumoral
TNFRII -
Receptor II de fator de necrose tumoral
VEGF -
Fator de crescimento de células endoteliais
SUMÁRIO
DADOS DE IDENTIFICAÇÃO
1
INTRODUÇÂO..............................................................................
2
OBJETIVOS................................................................................... 17
2.1
Objetivo Geral................................................................................
17
2.2
Objetivos Específicos.....................................................................
17
3
REVISÃO DA LITERATURA.........................................................
18
3.1
Anatomia e fisiologia da pele.........................................................
18
3.2
Fisiologia e farmacologia do reparo tecidual ................................
22
3.3
Cininas ..........................................................................................
29
4
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................
37
4.1
Materiais........................................................................................
37
4.1.1
Linhagem celular ......................................................................
37
4.1.2
Condições de cultivo......................................................................
37
4.2
Métodos.......................................................................................... 37
4.2.1
Avaliação da proliferação celular ..................................................
37
4.2.1.1
Preparo da placa de cultivo...........................................................
37
4.2.2
Ensaio de Scratch in vitro..............................................................
38
4.2.3
Avaliação da proliferação celular em fibroblastos tratados com
TNF.............................................................................................
4.2.4
41
Avaliação do papel das cininas na proliferação celular em
fibroblastos pré tratados com TNF.............................................
4.2.6
40
Avaliação do papel das cininas na proliferação celular em
fibroblastos ....................................................................................
4.2.5
14
42
Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de
fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré
estímulo do TNF....................................................................
4.2.7
43
Avaliação do efeito das cininas na proliferação celular em
fibroblastos pré tratados ou não com TNF em coadministração
ou não do anticorpo anti TNF.......................
45
4.3
Análise de dados e apresentação dos resultados.........................
46
4.4
Análise estatística..........................................................................
47
5.0
RESULTADOS..............................................................................
48
5.1
Efeito do TNF na proliferação de fibroblastos ............................
48
5.2
Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na
proliferação de fibroblastos, com e sem estímulo do TNF .........
5.2.1.
5.2.2
5.2.3
Influência da administração de agonistas do receptor de cininas
na proliferação de fibroblastos L929 quando administrados
sozinhos......................................................................................
Influência da administração de agonistas do receptor de cininas
na proliferação de fibroblastos L929 quando administrados após
células pré tratadas com TNF................................................
Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de
fibroblastos L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré
estímulo do TNF
49
49
51
55
5.2.4
Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF
na proliferação de fibroblastos L929...........................................
57
6
DISCUSSÃO................................................................................
60
7
CONCLUSÕES
72
REFERÊNCIAS............................................................................
74
14
1 INTRODUÇÃO
A pele é um órgão que apresenta múltiplas funções, atuando principalmente
como barreira contra agentes patogênicos, prevenindo a desidratação e mantendo-se
como fronteira entre o meio interno e externo do organismo. A barreira cutânea
desempenha importante papel na manutenção da homeostase do organismo, desta
forma o processo de reparo tecidual cutâneo é um fator crítico relacionado à sua
sobrevivência (LAU, 2009).
Danos ao tecido epitelial desencadeiam uma série de eventos que envolvem a
quimiotaxia de células inflamatórias, divisão celular, neovascularização e síntese de
matriz extracelular. A ação coordenada destes eventos culmina com a formação e
remodelação do tecido lesado (ENOCH; LEAPER, 2008).
Muitos tipos celulares, incluindo macrófagos, neutrófilos, plaquetas, células
endoteliais, queratinócitos e fibroblastos contribuem para a cicatrização de feridas.
Tendo início imediatamente após a lesão, a resposta inflamatória leva à secreção de
uma variedade de fatores de crescimento e citocinas, que comandam os movimentos
celulares e teciduais necessários para o reparo (MONACO; LAWRENCE, 2003).
O processo de reparo tecidual é classicamente organizado em uma progressão
de etapas sobrepostas e ao avalia-lo desta forma, como uma sequência de eventos
distintos, pode-se propor que a inflamação se caracterize como uma fase circunscrita,
o que sugere o fim de seus efeitos com o início da próxima etapa. Compreensões mais
atuais, no entanto, sugerem que a inflamação persista por todas as fases da
cicatrização, estimulando e coordenando as funções essenciais do processo, através
da produção e controle de seus mediadores. Embora a inflamação seja reconhecida
como um dos primeiros eventos, a compreensão de sua importância e seu papel
regulador neste processo ainda é gradual (HENRY; GARNER, 2003, YUSSOF et al.,
2012)
Estudos experimentais relacionam a inflamação como um processo essencial
para o restabelecimento da homeostase cutânea após uma lesão. Ao longo dos
últimos anos vários trabalhos têm demonstrado a ação de diferentes células e
mediadores químicos no mecanismo de reparo tecidual. No entanto, vários estudos
também vêm discutindo o papel da inflamação no aumento do tempo de cicatrização
e na formação de cicatrizes. Desta forma, a compreensão mais detalhada dos
15
mecanismos que controlam a resposta inflamatória e o processo de resolução da
inflamação pode ser útil para avanços na terapia de reparação de tecidos (EMING;
KRIEG; DAVIDSON, 2007, KYRITSIS et al.,2012, SATISH; KATHJU, 2010)
O início da cascata inflamatória se dá geralmente logo após a lesão tecidual
pela liberação do fator de necrose tumoral (TNF), uma citocina pró-inflamatória
produzida por macrófagos e neutrófilos ativados em resposta a patógenos e a outros
estímulos nocivos.
Esta citocina exerce funções pleiotrópicas em condições
fisiológicas e patológicas ao ligar-se aos seus receptores tipo I (TNFRI) ou tipo II
(TNFRII) (PARK; BARBUL, 2004).
O TNF tem demonstrado participar diretamente da angiogênese e induzir a
síntese do fator de crescimento transformador beta (TGF-β), podendo interferir na
proliferação de fibroblastos, um componente essencial no processo de cicatrização
normal (FAHEY et al., 1990). Além disso, induz a biossíntese de vários outros
mediadores inflamatórios, incluindo a interleucina 1 (IL-1) e as cininas, que em sinergia
podem aumentar os seus efeitos (FAHEY et al., 1990; SOUZA et al., 2013).
Schremmer-Danninger e colaboradores (2004) descreveram a ação das cininas
nos processos pró-inflamatórios e de resolução. As cininas são peptídeos que
exercem atividade mitogênica, ou seja, proliferativa em diferentes sistemas tissulares
(REGOLI; BARABÉ, 1980). Em condições normais, formas imunoreativas de
cininogênio já foram localizadas no espaço intersticial entre os queratinócitos, sendo
provável o conceito de que as cininas são produzidas por estas células (YAMAMOTO
et al., 1987).
A expressão de ambos os receptores cininérgicos B 1 e B2 já foi
evidenciada no tecido cutâneo em condições normais, bem como em biopsia de pele
humana (SCHREMMER- DANNINGER et al., 1999).
Apesar do papel das cininas como importantes mediadores da inflamação ser
amplamente descrito, seu papel no reparo tecidual cutâneo ainda não foi
completamente explorado. Tendo em vista que a migração e proliferação de
fibroblastos e remodelação tecidual são evento centrais no processo de cicatrização
e que o TNF e mediadores inflamatórios como as cininas já demonstraram atuar direta
ou indiretamentente nesta proliferação celular, este estudo teve como objetivo avaliar
a co-participação do TNF e das cininas sobre a proliferação de fibroblastos através do
modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de fibroblastos L929, afim de
aproximar o modelo “in vitro “das condições reais de lesão cutânea com presença de
um processo inflamatório.
16
17
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar a co-participação do TNF e das cininas sobre a proliferação de
fibroblastos através do modelo in vitro de estresse mecânico em monocamada de
fibroblastos L929, afim de obter um modelo “in vitro” com características próximas das
alterações inflamatórias reais de lesões cutâneas.
2.2 Objetivos Específicos:
1. Padronizar o modelo de reparo tecidual in vitro descrito como “scratch assay” em
monocamada de fibroblastos murino L929 estimulados com TNF.
2. Avaliar o envolvimento dos receptores cininérgicos na proliferação de fibroblastos
L929 induzida pelo TNF através do emprego de anatagonistas seletivos para estes
receptores.
3. Avaliar o papel dos receptores B1 e B2 das cininas na proliferação de fibroblastos
pré-tratados ou não com TNF por meio da utilização de agonistas e antagonistas
seletivos.
4. Avaliar a co-participação do TNF nos efeitos promovidos pelas cninas sobre a
proliferação de fibroblastos L929 através do emprego do anticorpo anti TNF.
18
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Anatomia e fisiologia da pele
A pele corresponde a 15% do peso corporal, sendo assim considerada o maior
órgão do ser humano. Por recobrir toda a área corporal, envolvendo-o por inteiro e
delimitando o organismo, a mesma confere proteção e interação com o meio externo.
Este órgão forma uma barreira física contra agressões do meio externo para com os
demais órgãos e constituintes do corpo humano assumindo assim a função maior e
vital, a conservação da homeostasia. Para desempenhar tal papel, apresenta
características dinâmicas, sofrendo alterações constantes, sendo dotada de
capacidade renovadora e de reparação (HARRIS, 2009).
A pele é composta por duas camadas principais; a epiderme e a derme. A
epiderme é o compartimento exterior, sendo composta por quatro diferentes camadas:
estrato basal, estrato espinhoso, estrato granuloso e estrato córneo (Figura 1). O
estrato basal é o mais profundo, responsável pela constante renovação das células
da epiderme. Contém uma linha de células indiferenciadas conhecidas como
queratinócitos basais, os quais se dividem com frequência. Estes se diferenciam e
passam para o estrato seguinte, o espinhoso, para iniciar um processo de maturação,
mas também se dividem para repor a camada basal. As células que se movem no
estrato espinhoso modificam sua morfologia e passam de colunar para a forma
poligonal e começam a sintetizar queratina. Na sequência, em direção a superfície, é
formada a camada granulosa composta de queratinócitos do estrato granuloso,
caracterizados por manchas escuras do material citoplasmático e pela intensa
produção de queratina e lipídios. O estrato córneo, como o último produto dos
queratinócitos, é o mais externo da epiderme, e reconhecidamente, o principal
responsável pela função de barreira protetora da pele. As células que compõe esta
camada são conhecidas como corneócitos, células derivadas de queratinócitos mortos
desprovidos de organelas. Os corneócitos são os responsáveis por barrar diversos
agentes tóxicos, como por exemplo substâncias químicas e microrganismos, atuando
desta forma como a primeira barreira do sistema imune inato. Ainda, os mesmos
atuam impedindo a desidratação da pele (NESTLE; MEGLIO; QIN; NICKOLOFF,
2009, PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008, GNIADECKI, 1998).
19
Figura 1 – Camadas da pele
Estrato córneo
Estrato granuloso
Estrato espinhoso
Epiderme
Estrato Basal
Glândula
sebácea
Vaso
linfático
Derme
Macrófago
Vaso sanguíneo
Tecido adiposo
A pele humana apresenta uma epiderme espessa com várias camadas de células que se diferenciam
formando seus estrato. Abaixo da epiderme está localizada a derme uma camada de tecido conjuntivo
caracterizada pelas projeções das cristas epidérmicas, observa-se a presença de glândula sebácea,
vasos linfáticos e sanguíneos assim como células do sistema imune como os macrófagos. Fonte:
Adaptado de Pasparakis; Haase; Nestle, (2014).
Adicionalmente, a epiderme possui células especializadas, como melanócitos,
responsáveis pela produção de melanina, e células de Langerhans, responsáveis pela
imunovigilância do tecido cutâneo, sendo assim as principais células residentes do
sistema imunológico da pele (Figura 2) (PROKSCH; BRANDNER; JENSEN, 2008;
NESTLE; MEGLIO; QIN; NICKOLOFF, 2009).
A pele saudável, além de se renovar normalmente como a maior parte dos
tecidos corporais, tem extraordinária capacidade de auto regeneração quando sofre
lesões. A constante renovação da epiderme ocorre por meio de um processo de ciclo
celular controlado, no qual se formam continuamente novos queratinócitos. A
proliferação dos queratinócitos é regulada por diferentes substâncias como fatores de
crescimento, vitaminas lipossolúveis e seus derivados, ceramidas, neuropeptídeos,
esteróides, hormônios peptídicos e mediadores inflamatórios (GNIADECKI, 1998).
20
Quando ocorre uma lesão na camada epidérmica, as células superficiais
sinalizam às células mais profundas a sua perda de contato com células vizinhas
destruídas. A sinalização gerada estimula as células da camada basal a proliferarem
e se diferenciarem, culminando com o reparo da área lesionada (HERSON, 2004).
Outra importante estrutura da pele é a derme, a qual está localizada abaixo da
epiderme, repousando sobre o tecido subcutâneo. A derme, é formada por uma
camada de tecido conjuntivo associada a um sistema integrado de estruturas fibrosas,
filamentosas e amorfas onde estão acomodados os vasos sanguíneos, linfáticos,
terminações nervosas e anexos cutâneos (glândulas sebáceas, sudoríparas, folículos
pilosos) originados do aprofundamento da epiderme na derme (FREINKEL;
WOODLEY, 2001). Ainda, a derme é importante para a nutrição da epiderme e para
remoção de resíduos, uma vez que a epiderme é uma camada avascular (HILINSK;
MEYERS, 2013).
Uma extensa rede de comunicação entre células epiteliais da epiderme, tecido
conjuntivo da derme e células do sistema imune regula as respostas imunológicas da
pele, a qual é responsável por garantir a defesa do hospedeiro, mantendo ou
restaurando a homeostase do tecido (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014)
21
Figura 2 – Anatomia da pele humana e efetores celulares
A estrutura da pele reflete a complexidade das suas funções como uma barreira protetora para manter
a temperatura do corpo, na coleta de informações sensoriais do ambiente e no papel ativo no sistema
imunológico. A epiderme é composta de 4 estratos sendo a camada mais externa, o estrato córneo,
responsável pela função de barreira da pele. As células especializadas na epiderme incluem os
melanócitos, que produzem o pigmento (melanina) e células de Langerhans. Raras células T podem
ser encontrada no estrato basal e camada espinhosa. A derme é composta de colágeno, tecido elástico
e fibras reticulares. A derme contém muitas células especializadas, como células dendríticas (DC)
subconjuntos, incluindo DCs dérmicos. Além disso, macrófagos, mastócitos e fibroblastos estão
presentes. Vasos sanguíneos e linfáticos e os nervos (não mostrados na figura) também estão
presentes em toda a derme.
Fonte: Adaptado de Nestle; Meglio; Qin; Nickoloff (2009).
A derme é rica em matriz extracelular e contém células do estroma, como
fibroblastos, fibrócitos e células estruturais dos vasos sanguíneos e linfáticos. As
células imunes residem e trafegam na derme, são dinâmicas e sofrem alterações
acentuadas durante a resposta imune, como pode ser visualizado na Figura 1
(PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014).
Devido seu posicionamento estratégico na interface entre o meio externo e
interno, os queratinócitos recebem sinais a partir do ambiente e são capazes de
transmiti-los para células do sistema imunológico presentes na pele. Esta
comunicação é realizada a partir da expressão de receptores gerados por meio da
produção de citocinas e quimiocinas, como por exemplo, as interleucinas IL-1, IL-10,
IL-20 e o TNF (PASPARAKIS; HAASE; NESTLE, 2014).
22
Os
apêndices
epidérmicos,
incluindo
glândulas
sebáceas,
glândulas
sudoríparas, glândulas apócrinas e folículos pilosos, desenvolvem-se a partir da
epiderme e se aprofundam na derme. Eles estão alinhados com células epiteliais que
possuem potencial para a divisão e diferenciação, desta forma são uma importante
fonte de células para a reepitelização quando a epiderme é destruída. A destruição
epidermémica pode ocorrer por queimaduras de espessura parcial e traumática, em
peeling químico, dermo abrasão ou por outros processos esfoliativos (HILINSK;
MEYERS, 2013).
3.2 Fisiologia e farmacologia do reparo tecidual
Uma lesão ou ferimento é gerado através da ruptura na integridade do tecido
epitelial da pele e pode estar acompanhado de uma perturbação na estrutura e função
do tecido normal. Esta perturbação pode ser gerada por um trauma, queimadura ou
ainda por uma contusão, laceração ou abrasão. Esta alteração deve ser restaurada
rapidamente uma vez que a integridade da pele é crucial para a manutenção da
homeostasia do organismo (PEREIRA; CURI, 2005; ENOCH; LEAPER, 2008;
BALBINO; MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).
O reparo tecidual é um processo dinâmico que ocorre em uma sequência
preestabelecida de fases que não se excluem, pelo contrário, se somam. Este
processo é resultante da interação complexa entre células da epiderme e da derme,
proteínas da matriz e do plasma e angiogênese controlada (LAU et al.,2009).
Logo após uma lesão, várias vias intra e intercelulares devem ser ativadas e
coordenadas para que a integridade do tecido e a homeostase seja restaurada. Os
componentes celulares do sistema imune, a cascata de coagulação do sangue e as
vias inflamatórias são ativadas, este processo é um dos mais complexos que ocorrem
durante a vida humana (MARTIN, 1997; SINGER e CLARK, 1999, GURTNER et
al.,2008).
Com o objetivo de facilitar a compreensão deste evento dinâmico e complexo
diferentes etapas classificatórias do processo de reparo são utilizadas. Estas fases
são interdependentes em um determinado período de tempo as fases coincidem e
acontecem
simultaneamente,
permitindo
assim
(MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003).
o
sucesso
da
cicatrização
23
Estas atividades ocorrem em cascata e estão correlacionadas com o
aparecimento de diferentes tipos celulares e a liberação de mediadores químicos
definindo os estágios ou fases do processo de reparo. Disparados pela lesão no tecido
cutâneo, o reparo tecidual envolve quatro fases; hemostasia, inflamação, proliferação
e remodelagem como pode-se acompanhar através da figura 3 (ENOCH; LEAPER,
2008).
Figura 3 - Linha do tempo de migração de populações de células imunitárias correlacionadas com as
fases de cicatrização de feridas.
Fonte: Adaptado de PARK; BARBUL, (2004)
O processo inflamatório, etapa essencial para a manutenção da homeostasia,
tem papel primordial no reparo tecidual. Ocorre imediatamente após o surgimento do
trauma, caracterizado pela ruptura de vasos sanguíneos e extravasamento de seus
constituintes onde inicia a cascata de coagulação (MANDELBAUM; DI SANTIS;
MANDELBAUM, 2003). As plaquetas induzidas pela trombina sofrem degranulação
plaquetária liberando diversos fatores de crescimento, como o fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento transformador-β e α (TGF-β;
24
TGF-α), fator de crescimento epidérmico (EGF), e o fator de crescimento de células
endoteliais (VEGF), além de glicoproteínas adesivas como a fibronectina e
trombospondina, que são importantes constituintes da matriz extracelular provisória.
O cruzamento de fibronectina fornece uma matriz preliminar, que alicerçará a
migração das seguintes células, fibroblastos, células endoteliais e queratinócitos
responsáveis pelo desencadeamento do processo de reparo.
Além disto, a ativação da cascata de coagulação e do complemento,
juntamente com a liberação dos fatores de crescimento e ativação de células
parenquimatosas por células lesionadas, produzem numerosos mediadores
vasoativos e fatores quimiotáticos que auxiliam o recrutamento das células
inflamatórias para o sitio de lesão. Após a saída das plaquetas dos vasos, neutrófilos
e monócitos em resposta a fatores quimiotáticos migram para a região do trauma
(MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).
A primeira contribuição de mediadores circulantes para a formação do
gradiente quimiotáxico vem de proteínas plasmáticas como o Fator de Hageman e o
cininogênio de alto peso molecular. Da interação entre estas duas moléculas é gerada
a bradicinina que, além de propriedades vasoativas e nociceptivas é também indutora
da metabolização do ácido araquidônico para formação de eicosanóides. As
moléculas desta família possuem importância comprovada em vários fenômenos
inflamatórios e dentre eles a atividade quimiotáxica (HUYBRECHTS-GODIN et al.,
1979 apud BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Nesta etapa, leucócitos se infiltram na área da lesão e serão os principais
componentes celulares da resposta inflamatória. Estas células são efetoras no
combate de patógenos invasores e também estão envolvidas na degradação do tecido
lesionado. A compreensão do papel essencial da resposta inflamatória no reparo de
feridas irá fornecer estratégias para modular a remodelação do tecido (EMING;
KRIEG; DAVIDSON, 2008).
A força de arraste da corrente sanguínea sobre as células circulatórias está
diminuída devido à vasodilatação local e ainda estão expressas na superfície das
células endoteliais dos vasos não lesionados, moléculas de adesão que ancoram os
leucócitos circulantes e permitem a sua transmigração para o foco inflamatório
(BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Na fase final do processo inflamatório, os macrófagos se apresentam como
peças chave no processo regulatório do reparo, pois apresentam ação fagocitária,
25
degradando e removendo componentes de tecido conjuntivo danificado debridando a
ferida
(BRAIMAN-WIKSMAN;
SOLOMONIK;
SPIRA;
TENNENBAUM,
2007,
COUTINHO-NETTO, 2009; ENOCH; LEAPER, 2008; MANDELBAUM; DI SANTIS;
MANDELBAUM, 2003)
O papel dos macrófagos é complexo, esta célula polivalente está envolvida em
muitos aspectos do reparo tecidual através das citocinas e fatores imunomoduladores
que produz. As citocinas produzidas por macrófagos estão envolvidas na
angiogênese, migração e proliferação de fibroblastos, na produção de colágeno e
possivelmente, na contração da ferida (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA;
TENNENBAUM, 2007, COUTINHO-NETTO, 2009; ENOCH; LEAPER, 2008;
MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003; MENDONÇA; MONACO,
LAWRENCE, 2003)
O processo de reparo tecidual é, em grande parte, regulado pela produção de
citocinas, que ordenam e controlam a ativação de genes responsáveis pelo controle
da migração, proliferação e atividade celular. As plaquetas e macrófagos são as
principais fontes celulares de citocinas, embora muitas outras células também as
produzam. O controle da liberação de citocinas é, em parte, regulado por outras
citocinas e pelas características do meio tecidual (MONACO; LAWRENCE, 2003)
Logo após a formação da lesão, as citocinas, interleucina 1 beta (IL-1β) e o
fator de necrose tumoral (TNF), são liberados a partir de células endoteliais rompidas,
queratinócitos e fibroblastos. A liberação destas citocinas, inicia a fase inflamatória,
promovendo o recrutamento de leucócitos para o local da ferida. O pico de
concentração destas, se da no primeiro dia do ferimento e serão sobrereguladas
durante a resposta inflamatória, o que é essencial no estímulo inflamatório e na
modulação do processo de regeneração tecidual e (FAHEY et al., 1990; MEDZHITOV,
2008; KANNO et al., 2013).
Estudos tem demostrado que o TNF participa diretamente da angiogênese e
induz a síntese do fator de crescimento transformador (TGF), assim como a
proliferação de fibroblastos, componentes essenciais no processo de cicatrização.
Ademais, induzem a biossíntese de vários outros mediadores inflamatórios, incluindo
IL-1β e as cininas, que em sinergia podem amplificar a resposta inflamatória (FAHEY
et al.,1990; HENRY; GARNER, 2003)
26
O TNF exerce uma variedade de efeitos biológicos incluindo a produção de
citocinas inflamatórias, regulação positiva de moléculas de adesão, proliferação,
diferenciação e morte celular (KAMATA et al., 2005)
Enquanto tais efeitos são mediados pelos dois receptores do TNF (TNF-RI e
TNF-RII), a morte celular induzida por esta citocina é mediada principalmente por TNFRI, ao ligar-se a este receptor o TNF é capaz de estimular a sinalização apoptótica,
resultando no recrutamento e ativação da caspase-8. A caspase-8 ativada por sua
vez, ativa caspases efetoras tais como a caspase-3 e-7, resultando em apoptose
(ALIKHANI et al., 2004, WALLACH et al., 2002)
Assim como, o TNF pode também induzir a apoptose celular, atuando como um
agente citotóxico (pró-apoptótico) em determinadas situações pode estimular a
proliferação de fibroblastos (SUGARMAN et al., 1985). .
Esta dicotomia se deve em parte à capacidade do TNF de atuar como ativador
do fator de transcrição nuclear -kB (NF-kB), responsável pela sobrevivência celular
através da ativação de genes pró sobrevivência e supressão de genes próapoptóticos. Um elemento crítico na sinalização da apoptose induzida por TNF, é a
ativação robusta e prolongada de JNK, o que ocorre quando o NF-kB é inibido. No
entanto, os sinais específicos que podem desencadear esta citotoxicidade não são
completamente ilucidados (CHEN et al., 2007, KAMATA et al., 2005; SAKON et al,
2003).
Durante o processo de cicatrização a IL-1β é liberada por queratinócitos, tendo
um efeito parácrino, assim como age de forma autócrina interferindo na migração e
proliferação destas células epiteliais, e ainda, participam da proliferação de
fibroblastos (BARRIENTOS et al, 2008; RAJA, 2007).
Tal como a IL-1β, o TNF pode induzir a produção de fator de crescimento
fibroblástico (FGF), sugerindo ação indireta na promoção da reepitelização.
(BARRIENTOS et al, 2008).
O TNF, de forma isolada, demonstrou inibir a reepitelização de feridas, tendo
seus efeitos dependentes da concentração e duração da exposição, enfatizando a
importância do equilíbrio entre os sinais pró e anti-inflamatórios no controle da
cicatrização. Em baixas concentrações, o TNF pode promover a cicatrização de
feridas por agir indiretamente estimulando a inflamação e induzindo o aumento no
recrutamento de macrófagos, liberação de fatores de crescimento e proliferação de
fibroblastos. No entanto, em concentrações elevadas de TNF, especialmente durante
27
longos períodos, pode-se observar um efeito prejudicial sobre o processo de reparo,
já que tem a habilidade de suprimir a síntese de proteínas de matriz extracelular e
seus inibidores teciduais, enquanto aumenta a síntese de enzimas proteolíticas como
as metalaproteinases (MMPs), dentre as quais se pode destacar a MMP-1, MMP-2,
MMP-3, MMP-9, MMP-13, e de MT1-MMP. Ainda, elevados níveis de IL-1β
apresentam resposta similar à do TNF, em um processo de retroalimentação,
amplificando este sinal (AGREN et al.,1992; BARRIENTOS et al, 2008).
Quando o processo inflamatório se encerra, já existe uma matriz provisória com
a presença de moléculas com propriedades quimiotáxicas gerando condições
propícias e orientando o sentido da migração celular na região da lesão, servindo
então como alicerce para novas células se proliferarem (BALBINO; PEREIRA; CURI,
2005). A partir desta etapa, se inicia o processo de proliferação, fase responsável pelo
fechamento da lesão. Nesta etapa ocorre a formação do tecido de granulação, um
tecido conjuntivo ainda imaturo, que substituirá o tecido lesionado. Esta etapa
apresenta três importantes eventos: (1) reepitelização, (2) fibroplasia e (3)
angiogênese. (BRAIMAN-WIKSMAN; SOLOMONIK; SPIRA; TENNENBAUM, 2007)

(1) A reepitelização inicia horas após a lesão, com a movimentação das
células epiteliais que provêm tanto da margem da ferida como dos
apêndices epidérmicos localizados no centro da lesão (MENDONÇA;
COUTINHO-NETTO,
2009;
BRAIMAN-WIKSMAN;
SOLOMONIK;
SPIRA; TENNENBAUM, 2007).

(2) A fibroplasia se dá pela substituição da matriz extracelular provisória
por um tecido conjuntivo mais forte e elástico. Os fibroblastos são as
células responsáveis por este processo, produzindo proteínas da matriz
como a fibronectina, ácido hialurônico, proteoglicanas e posteriormente
o depósito de colágeno no tecido de granulação. Nesta fase sua
migração e ativação são intensificadas para produção de uma nova
matriz extracelular necessária ao crescimento celular. Após a influência
dos fatores de crescimento e demais mediadores inflamatórios,
derivados principalmente dos macrófagos, os fibroblastos são ativados
e migram das margens da ferida para o seu centro (BRAIMANWIKSMAN;
SOLOMONIK;
SPIRA;
TENNENBAUM,
2007;
MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003). Fatores de
crescimento como PDGF, fator de crescimento fibroblástico básico,
28
TGF-α, IL-1 e TNF induzem a síntese de colágeno durante a fase
proliferativa e também na fase subsequente, a remodelagem. Para que
a fibroplasia ocorra de forma eficiente é necessário a formação de novos
vasos sanguíneos, que irão carrear oxigênio e nutrientes essenciais ao
metabolismo celular local (SINGER; CLARK, 1999; ENOCH; LEAPER,
2008).

(3) Na angiogênese, as células endoteliais migram para a área de lesão
e a produção de novos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes
é acompanhada, na maioria das vezes, por aumento da permeabilidade
vascular. As células endoteliais dos vasos neoformados se diferenciam
em
células
de
revestimento
e
vasos
neoformados
assumem
características funcionais de capilares, a seguir ocorre proliferação das
células endoteliais, acesso para as células responsáveis pelas próximas
fases (MANDELBAUM; DI SANTIS; MANDELBAUM, 2003).
Após a formação de um tecido de granulação prossegue-se para a última fase
do processo de reparo, a fase de remodelagem ou remodelamento, marcada pela
maturação dos elementos e alterações na matriz extracelular, o tecido de granulação
é enriquecido com fibras de colágeno e começa a adquirir a aparência de massa
fibrótica característica da cicatriz. Nesta fase ocorrem melhorias e reformulações nos
componentes das fibras de colágeno e na matriz extracelular, aumentando assim a
força de tensão e a diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. Cabe ressaltar
que este processo pode perdurar durante meses (CLARK, 1985).
O remodelamento da cicatriz envolve etapas sucessivas de produção, digestão
e orientação das fibrilas de colágeno. Repetições sucessivas da lise, nova síntese,
redirecionamento e religação formam fibras maiores de colágeno, resultando em uma
configuração mais regular da cicatriz. Isso aumenta a sua resistência devido à
organização das fibras acompanharem as forças mecânicas a que o tecido está sujeito
durante a atividade normal. A neovasculatura diminui, e tardiamente a cicatriz é
considerada avascular (CLARK, 1985).
A partir deste momento a cicatriz adquire sua máxima resistência à tração,
característica marcante desta fase do reparo é a grande e acelerada deposição de
colágeno na região da ferida. Assim, os sinalizadores de importância, de alguma
forma, devem exercer influência sobre os fibroblastos. Esta fase está sob influência
29
de grande número de citocinas incluindo; TNF, IL-1, TGF-β, PDGF e fator de
crescimento fibroblástico básico (ENOCH; LEAPER, 2008).
O TGF-β, um sinalizador com participação crucial nessa fase, é um mitógeno
importante de fibroblastos. Embora exercendo efeitos inibitórios sobre a proliferação
dos queratinócitos, é um potente estimulador da expressão de proteínas da matriz
extracelular e de integrinas (BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).
Com a evolução do processo de cicatrização acentua-se a deposição de
colágeno e a maioria das células desaparecem (observa-se a apoptose de fibroblastos
e células endoteliais) formando finalmente a cicatriz avascular com baixo número de
células. Se o teor celular permanecer alto, poderá ocorrer a formação de cicatrizes
hipertróficas ou queloides (MENDONÇA; COUTINHO-NETTO, 2009).
3.3 Cininas
As cininas fazem parte de uma importante família de peptídeos biologicamente
ativos, envolvidos em uma série de processos biológicos e fisiopatológicos. As ações
das cininas já foram confirmadas em diversas reações inflamatórias, além de
processos dolorosos e inflamação (KAPLAN; KUSUMAM; SILVERBERG, 2002).
Pesquisas têm demonstrado que estes peptídeos estão envolvidos em uma
variedade de fenômenos biológicos, como a regulação da pressão arterial sistêmica,
através das suas propriedades vasodilatadoras, contração da musculatura lisa
regulando o tônus vascular, além de modular o metabolismo da glicose (BHOOLA et
al., 1992; MARCEAU; REGOLI, 2004).
Os componentes do sistema cinina-calicreína vêm sendo estudados desde
1909, quando um componente hipotensivo foi encontrado no sistema urinário, sendo
posteriormente identificado como a calicreína tecidual. Em 1949, Rocha-e-Silva e
colaboradores isolaram o peptídeo bradicinina (BK) das globulinas plasmáticas
tratadas com tripsina ou protease provenientes do veneno da cobra Bothrops jararaca
(BHOOLA et al., 1992; MARCEAU e REGOLI, 2004).
As cininas pertencem a um grupo de peptídeos com 9 a 11 aminoácidos,
incluindo a BK, calidina (Lys- BK), T-cinina e seus metabólitos ativos e as des-Argcininas. A cascata de formação das cininas compreende a ação de enzimas
proteolíticas denominadas calicreínas sobre um precursor, o cininogênio, encontrado
no plasma e nos tecidos. A calicreína plasmática cliva o cininogênio de alto peso
30
molecular (HMWK) liberando a BK, este processo encontra-se exacerbado em
respostas inflamatórias. Já a calicreína tecidual utiliza como substrato o cininogênio
de baixo peso molecular (LMWK), sintetizando a Calidina (Lys-BK) (MCLEAN et al,
2000).
Após o processo de síntese, as cininas são rapidamente metabolizadas por
diferentes grupos de peptidases. Há evidências de 4 metalopeptidases que são
responsáveis pelo metabolismo da BK: 1) enzima conversora de angiotensina I (ECA,
cininase II), 2) aminopeptidase P (APP), 3) endopeptidase neutral 24.11 (NEP,
neprilisina) e as 4) carboxipeptidases M (membrana) e N (plasma) (CPM, CPN;
cininases I). Em humanos, os níveis circulantes são regulados pela CPN. Entretanto,
nas superfícies endoteliais, principalmente no leito vascular pulmonar, a regulação é
realizada pela ECA, sendo este o principal mecanismo através do qual a BK e Lys-BK
são inativadas (BHOOLA et al., 1992; MARCEAU; REGOLI, 2004; REGOLI; BARABÉ,
1980).
As principais enzimas que degradam a bradicinina são as cininases I e II. A
cininase II, exerce sua ação através da remoção do dipeptídeo da porção C-terminal
da bradicinina ou calidina ocasionando sua total inativação. Já a atividade da cininase
I apresenta uma importância particular, uma vez que é a responsável pela geração de
metabólitos ativos das cininas, a des-Arg9 bradicinina (DABK) eu des-arg10 calidina,
através da remoção do aminoácido arginina da porção C- terminal da BK e Lys-BK,
respectivamente. (Figura 4) (BHOOLA et al., 1992; KAPLAN; KUSUMAM, 2002;
SHEIKH; KAPLAN, 1989)
31
Figura 4 – Cascata de formação das Cininas
IIustra a via do sistema calicreína-cininas e sua cascata de formação.A partir da ação da Calicreína,
tecidual ou plasmática sobre o cininogênio de alto peso molecula (HK) ou ciniogênio de baixo peso
molecular, será formada a Bradicinina, que por ação da cininase I pode ser convertida em seu
metabólito ativo a DABK ou em um metabólito inativo também por ação de uma cininase (ECA). A
bradicinina então agirá preferencialmente nos recptores B2, enquanto seu metabólito ativo, DABK agirá
através da ligação nos receptores B1.
Fonte: RAMALHO (2000)
Após serem liberadas, BK, Lys-BK e seus derivados ativos exercem uma série
de efeitos biológicos, como vasodilatação, aumento do fluxo sanguíneo e da
permeabilidade vascular, redução da pressão do sague, contração ou relaxamento da
musculatura lisa e sensibilização de fibras aferentes sensoriais. As cininas ainda estão
relacionadas com a liberação de diferentes mediadores pelo endotélio, indução da
proliferação celular, regulação do transporte de glicose e estimular a reabsorção
óssea (BHOOLA et al., 1992; REGOLI; BARABÉ, 1980).
A utilização da biologia molecular como ferramenta no estudo dos receptores
cininérgicos permitiu a definição molecular dos receptores das cininas e foi iniciada
pela clonagem do receptor B2 em ratos (MCEACHERN et al., 1991), seguida pela do
receptor B1 em humanos (MENKE et al., 1994). Os dois receptores parecem estar
envolvidos com alterações observadas durante desordens inflamatórias agudas e
crônicas. Grande parte dessas conclusões está baseada nos estudos dos efeitos dos
antagonistas dos receptores utilizados em diversos modelos de inflamação
(MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998).
32
Diversas investigações demonstram o envolvimento dos receptores B 1 e B2 na
resposta edematogênica mediada pelas cininas no modelo de edema de pata em
ratos. Neste modelo os receptores B2 parecem ser constitutivos, enquanto os
receptores B1 apresentam caráter induzido (CAMPOS; CALIXTO,1995; CAMPOS et
al.,1995). Estudos demonstraram que a expressão dos receptores B 1 é controlada
principalmente pela produção de citocinas específicas após trauma tecidual,
principalmente pela IL-1β (MARCEAU et al.,1998). Diversos estímulos inflamatórios
são capazes de estimular a produção de IL-1β como citocinas pró-inflamatórias e
produtos bacterianos como lipopolissacarídeo de membrana (LPS) (DINARELLO,
1998).
Assim, os efeitos biológicos das cininas ocorrem pela ativação específica de
receptores denominados de B1 e B2, receptores estes pertencentes à superfamília de
receptores acoplados à proteína G. No entanto, os receptores B1 e B2 se diferenciam
em suas estruturas primárias, regulação, expressão e distribuição no tecido
(MARCEAU et al., 1998).
Receptores B1 são preferencialmente e seletivamente estimulados pelos
metabólitos ativos des-Arg9-BK e Lys-des-Arg9-BK (figura 4). Enquanto que os
receptores B2 apresentam alta afinidade pela BK e Lys-BK (figura 4) (KAPLAN et
al.,2002, MARCEAU et al., 1998). Evidências apontam que receptores B2 encontramse expressos de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares
(SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995) e são os principais responsáveis pelas
ações fisiológicas das cininas. Com relação ao receptor B1, não são expressos em
níveis significativos nos tecidos em condições normais, mas são sintetizados e
modulados rapidamente em diversos tipos celulares após traumas teciduais ou
durante condições patológicas, indicando um mecanismo adicional na lesão tecidual
e na recuperação. Além disso, a indução do receptor B1 é resultante de uma cascata
de eventos que envolvem a interação entre fatores de transcrição, proteínas quinases,
células inflamatórias e citocinas, como por exemplo IL-1 e TNF (CALIXTO et al., 2000;
CALIXTO et al., 2004; KAPLAN; KUSUMAM, 2002). Desta forma, grande parte dos
efeitos fisiológicos das cininas são mediados pela ativação dos receptores B 2
enquanto os receptores B1 parecem estar envolvidos na amplificação da sinalização
iniciada pelos receptores B2 (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004).
33
O receptor B1 é geralmente expresso no mesmo tipo celular que está presente
o receptor B2, recrutando a mesma via de sinalização, entretanto, o receptor B 1 não
sofre dessensibilização após estimulação pelo agonista (MARCEAU; REGOLI, 2004).
Os dois receptores parecem estar envolvidos com as alterações observadas
durante desordens inflamatórias agudas e crônicas. Grande parte dessas conclusões
está baseada nos estudos dos efeitos dos antagonistas dos receptores utilizados em
diversos modelos de inflamação (MARCEAU; HESS; BACHVAROV, 1998).
Grandes avanços do envolvimento das cininas em processos fisiológicos assim
como fisiopatológicos se deram com o desenvolvimento de antagonistas seletivos
para os receptores cininérgicos. Os antagonistas seletivos para o receptor B 1 se deu
uma década antes do desenvolvimento de antagonistas para receptores B 2. O
desenvolvimento do protótipo [Leu8]-des-Arg9-Bk (DALBK) como antagonista seletivo
foi decisivo para definir a existência dos receptores B1 (REGOLI; BARABÉ, 1980).
Mesmo com as limitações da primeira geração de antagonistas de B 2, a partir
de seu desenvolvimento, o papel das cininas em condições normais e patológicas
agudas começou a ser delineado (BHOOLA et al., 1992). A segunda geração de
antagonistas da BK começou com os antagonistas exemplificados por Hoechst HOE140 (Icatibante), obtido através da introdução de dois aminoácidos sintéticos (Tic e
Oic) nas posições 7 e 8 do antagonista anterior (HOCK et al.,1991; WIRTH et al.,
1991).
Esta alteração estrutural gerou uma molécula com a capacidade de bloquear
sua degradação, aumentando dramaticamente o tempo de meia vida in vivo deste
antagonista em comparação aos antagonistas da primeira geração. A busca por
antagonistas não peptídicos que fossem ativos por via oral, levou ainda ao
desenvolvimento de uma terceira geração de antagonistas (STEWART et al., 1999;
STEWART, 2004).
Apesar de existirem diferenças entre os dois receptors cininérgicos B 1 e B2, as
vias de sinalização celular ativadas por eles parecem ser semelhantes. Ambos são
recepetores acoplados a proteína G e sua ativação pode estar envolvida direta ou
indiretamente, com diferentes vias de transdução de sinal (YANAGA et al., 1991; XIE
et al., 2000).
Complementando os efeitos pró-inflamatórios do receptor B2, que se encontram
acoplados a múltiplos mecanismos transducionais. A BK ativa os receptores B2 e
estimula a liberação do ácido araquidônico com formação subseqüente de
34
prostaglandina E2 ou I2, resultando na formação do monofosfato cíclico de adenosina
(AMPc). Outro componente envolvido no processo inflamatório é o óxido nítrico (NO),
também formado pela ativação dos receptores B2, através do aumento de monofosfato
cíclico de guanosina (GMPc) (MARCEAU, HESS, BACHVAROV, 1998).
Outro ponto a se destacar é a ativação de vias alternativas, envolvendo a
fosforilação de algumas classes de quinases, como tirosina quinase, quinases
ativadas por mitógeno, proteína ribosomal S6 quinase e fosfatidilinositol-3-quinase
(MARCEAU; BACHVAROV, 1998; PYNE et al., 1997; PAN et al, 1999).
Os mecanismos descritos acima, podem levar à liberação ou mesmo
potencialização da ação de outros importantes mediadores inflamatórios como as
citocinas, assim como a ativação do fator de transcrição NF-B (PAN et al., 1998).
A ativação de receptores B2 acoplados aos mecanismos de transdução pode
ser responsável pelo aumento da população de receptores B1, sugerindo a existência
de um processo de balanço entre as duas populações de receptores cininérgicos,
durante desordens inflamatórias (CALIXTO et al., 2000).
Outro fato importante a se acrescentar em relação à participação dos
receptores B1 é que durante o desenvolvimento da inflamação, uma grande
quantidade de BK sofre a ação de carboxipeptidases, produzindo grandes
quantidades do metabólito ativo des-Arg9-bradicinina. Esta alta concentração
endógena dos agonistas seletivos para o receptor B 1 demonstra que estes possuem
papel fundamental também na regulação de expressão dos receptores B1
(SCHANSTRA et al., 1998).
Processos inflamatórios cutâneos induzidos através de diferentes estímulos,
incluindo substâncias alergênicas ou através da radiação ultravioleta, disparam
respostas inflamatórias no tecido cutâneo induzindo diretamente queratinócitos e
estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias e BK. Nos queratinócitos, a
bradicinina induz o crescimento celular e este efeito pode ser induzido via receptores
específicos de cininas (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995).
Schremmer-Danninger
e
colaboradores
(1995),
utilizando
técnicas
radiográficas, identificaram receptores específicos para bradicinina na camada basal
de epiderme humana sugerindo que as cininas podem estar envolvidas em
mecanismos de proliferação celular epidérmica.
O RNA mensageiro (RNAm) para o receptor B1, B2 e para a calicreína tecidual
na pele de indivíduos sadios foi identificado e desta forma, a existência do sistema
35
das cininas na pele humana é um fato comprovado (SCHREMMER-DANNINGER et
al., 1999). Poblete e colaboradores (1991) encontraram calicreína tecidual no fundo
secretório de glândulas sudoríparas. Além disso, foi demonstrada a presença de
cininogênio de alto peso molecular no espaço intersticial tecidual na epiderme de
cobaias e também na pele humana (YAMAMOTO et al.,1987; VIDAL et al., 2005).
Dados indicam que as calicreínas e as cininas contêm substratos que normalmente
estão presentes na pele humana contribuindo para o conceito de que as cininas são
formadas localmente (VIDAL et al, 2005).
É importante destacar que outras ações das cininas também sugerem o
envolvimento desse sistema em outras etapas dos processos inflamatórios cutâneos,
como na proliferação celular. Cheng e colaboradores (2004) demonstraram que a BK,
via ativação dos receptores B2, apresenta efeito mitogênico através da ativação de
proteína G, causando fosforilação da via da PKC e consequente estimulação da via
da MEK/ proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da expressão de c-fos e cjun em cultura de queratinócitos obtidos da córnea de coelhos. Também através de
receptores B2, a BK promove ativação da cascata da p42/p44 MAPK em vários tipos
de células humanas, incluindo as células da musculatura lisa vascular, endoteliais,
PC-12 e linhagem de células tumorais (CHENG et al., 2004).
Em 2008, Matus e colaboradores utilizando cultura de queratinócitos
comprovaram que o estímulo de receptores B1 pode contribuir para a diferenciação e
migração de queratinócitos através da sinalização da tirosina quinase C ou através da
interação com receptores da família ErbB. Indícios de que o sistema cinina-calicreína
pode estar envolvido com a migração e diferenciação de queratinócitos foram
confirmados em lesões realizadas em cultura celular e tratadas com calicreína. Neste
trabalho, Gao e colaboradores, (2010) constataram que há influência na migração e
diferenciação destas células através da ativação de receptores PAR, sugerindo assim
um importante papel no processo de reparo tecidual.
Como já mencionado anteriormente, os fibroblastos são células importantes na
reparação de tecidos, estando envolvidos na migração, proliferação, contração da
ferida e na produção de colágeno (ENOCH; LEAPER, 2008). Em uma busca na
literatura não foram encontrados estudos relacionando o papel das cininas e seus
receptores envolvendo fibroblastos cutâneos, porém já existem estudos in vitro
usando fibroblastos de outros tecidos indicando que a bradicinina também é capaz de
36
induzir a ativação destas células (CHENG; TSENG; MAO,2012; SABATINI et al.,2013;
VANCHERI et al., 2005).
Estudos in vitro demonstram que a BK através da ativação dos receptores B2 é
capaz de ativar a via do NF-kB e a liberação de citocinas em cultura de fibroblastos
de pulmão humano influenciando na sua contratilidade (VANCHERI et al., 2005). A
BK causa um significativo aumento na α-actina de músculo liso (α-SMA), proteína
expressa por fibroblastos em fase de transformação em miofibroblastos pulmonares.
O receptor B2 foi considerado o responsável por este efeito, pois o tratamento com o
antagonista bloqueou a expressão. A BK também é capaz de induzir a proliferação de
fibroblastos e a produção de colágeno através da ativação da via da MAPK por
fosforilação regulada por sinal extracelular (ERK 1/2) (VANCHERI et al., 2005).
Considerando o importante papel dos fibroblastos na fase proliferativa com o
fechamento da lesão através da formação do tecido de granulação e influenciando o
depósito de colágeno e a contração da ferida. Avaliando o cenário onde, os
mediadores inflamatórios assumem um importante papel na progressão da resposta
de reparo tecidual somando-se às evidências de que o sistema cinina-calicreína pode
regular a proliferação celular, assim como sua possível relevância na a angiogênese.
Considera-se relevante explorar o papel das cininas na proliferação de fibroblastos in
vitro e a influência do TNF neste processo, procurando através do “Scratch model”
mimetizar as condições envolvidas no processo de reparo tecidual.
37
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Linhagem celular
As células utilizadas foram adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro.
Fibroblastos Murino linhagem NCTC clone 929 [L CELL, L-929], de origem de tecido
conectivo adiposo.
4.1.2 Condições de cultivo
No cultivo celular in vitro, células de fibroblasto murino L929 desenvolveram-se
como culturas aderentes cultivadas em garrafas plásticas (poliestireno) estéreis da
Techno Plastic Products (TPP). O meio de cultura DMEM (Vitrocell®) suplementado
com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) (Gibco®) foram adicionados às garrafas. As
células foram mantidas em estufa sob atmosfera contendo 5% de CO 2 à temperatura
de 37°C. A subcultura foi realizada de acordo com a confluência das células na
garrafa, utilizando-se a solução de tripsina-EDTA para desprender as células
aderidas. Para o armazenamento das linhagens, as células, foram suspensas em
meio de cultura suplementado com 10% SFB e 10% de DMSO e armazenadas em
nitrogênio líquido.
4.2.Métodos
4.2.1 Avaliação da proliferação celular
4.2.1.1 Preparo da placa de cultivo
Após crescimento celular em alta confluência em monocamada mantida na
garrafa de cultivo, células foram tripsinizadas e semeadas em placas de 24 poços e
mantidas em estufa até atingirem máxima confluência, como pode ser visualizado no
modelo demonstrado na figura 5.
38
Figura 5 – Modelo de placa com 24 poços para cultivo celular
4.2.2 Ensaio de Scratch in vitro
Após confluência na placa de 24 poços, o meio de cultivo foi retirado dos poços
e com o auxílio de uma ponteira (tip 200) foi realizado um risco contínuo na superfície
medial de cada poço, de acordo com a figura 6. Este procedimento ocasiona uma
ruptura do contato entre as células e a retirada destas de uma determinada região da
placa, resultando na formação de uma lesão mecânica na monocamada
Os poços foram lavados com Salina tamponada com fosfato (PBS) (Gibco®),
composto por cloreto de sódio e fosfato de sódio, para remoção das células
debridadas, o esquema de cultivo e experimento in vitro está demostrado na figura 7.
Antes do plaqueamento das células, foi realizada uma marcação central
utilizando um marcador permanente objetivando uma melhor padronização na
confecção do rasgo e das medidas. Esta marcação estabelece um campo visual no
poço, o qual será analisado posteriormente após o estabelecimento do rasgo na
monocamada, em tempo zero, 24 e 48 horas. Posteriormente, foi feito o
acompanhamento da proliferação das células adjacentes em direção ao espaço livre
na placa conforme a figura 6.
39
Figura 6 – Esquema do procedimento In vitro de “ Scratch model”
Após confluência na placa de 24 poços cada poço (A) foi submetido ao stress mecânico através da
ruptura da monocamada com um “rasgo” contínuo utilizando uma ponteira de micropipeta (B), após a
retirada das células desaderidas as céulas adjacentes tendem a se proliferar em direção ao espaço
livre na placa (C).
Fonte: Adaptado de VEDULA et al., (2013).
Figura 7 – Modelo de Scratch wound “in vitro”
Após confluência em
monocamada, as células de
fibroblastos L929 foram
tripsinizadas
semeadas em placas de
plástico (TPP) de 24 poços
1x 105 cels/poço
e mantidas em estufa até
atingirem a máxima
confluência
A placa foi marcada no seu
verso, de modo que cada
poço obtivesse uma
marcação central.
Esta marcação estabelece
qual campo do poço será
analisado em tempo zero,
24 e 48horas
Retirou-se o meio de cultura
e com o auxílio de uma
ponteira (tip 200) foi feito um
risco contínuo na superfície
medial de cada poço,
. Os poços foram então
lavados com Salina
tamponada com fosfato
(PBS) para remoção das
células desaderidas
40
4.2.3 Avaliações da proliferação celular em fibroblastos tratados com TNF
Com o objetivo de ativar os receptores cininérgicos e avaliar um possível efeito
das cininas na proliferação de fibroblastos, após o trauma mecânico (Scratch) as
células foram tratadas com TNF.
As células, após Scratch, foram incubadas com solução rm TNF em meio de
cultivo suplementado com 5% de SFB na concentração de 2 ng/mL (GOLDBERG et
al., 2007).
Inicialmente, foi realizado experimento com o intuito de verificar o melhor tempo
de exposição de contato com TNF para indução da proliferação celular, após o stress
mecânico as células foram mantidas incubadas por 30, 60, 90, 180 ou 240 minutos.
Após o tempo de contato com o TNF, o meio foi retirado, as células foram lavadas
com PBS e então foi adicionado meio DMEM suplementado com 5% de SFB (figura
8). Foi mantido um grupo controle onde as células receberam apenas meio de cultivo
suplementado e PBS. A análise fotográfica foi feita no tempo zero (imediatamente
após o rasgo), após 24 e 48 horas após o rasgo.
Figura 8 – Esquema de tratamento das células com TNF em diferentes tempos de contato.
Tempo zero
Tempo de contato
com TNF
30,60,90,180 e 240
min.
Após confluência na
placa de 24 poços
“Scratch “ rasgo”
Incubação com TNF
Registro fotográfico
imediatamente após o
rasgo e incubação
Lava com PBS e
adiciona meio
suplementado com 5%
SFB
Tempo
Tempo
Após rasgo
Após rasgo
24 horas
48 horas
Registro fotográfico
Retira o meio
Registro fotográfico
Avaliação da
proliferação
Lava com PBS
Adiciona meio de
cultivo com 5% de SFB
Avaliação da
proliferação
41
4.2.4 Avaliações do papel das cininas na proliferação celular em fibroblastos
Com o objetivo de avaliar a interferência das cininas no processo de
proliferação de fibroblastos L929, as células foram incubadas com agonistas dos
receptores cininérgicos B1 [des-Arg9]BK (DABK, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
U.S.A.) e B2, Bradicinina (BK, Bachem California, Torrance, CA) ®
Para avaliar qual concentração do agonista do receptor B2 (BK) pode interferir
na proliferação celular, o ensaio seguiu o esquema descrito na figura 9. O mesmo
procedimento foi executado para avaliar a interferência do agonista do receptor B1
empregando para tal o seu agonista DABK, figura 10.
Figura 9 - Esquema de tratamento das células com agonista receptor B2 (BK) em diferentes
concentrações.
Tempo zero
Tempo de contato
Tempo
Tempo
60 minutos
24 horas
48 horas
diferentes [ ] de BK
(0,1, 1,0 e 100µM)
1
2
3
4
Após confluência na placa
de 24 poços
Scratch “rasgo”
Incubação com diferentes
[ ] de BK + meio sem SFB
Registro fotográfico
Após 60 minutos
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio 5% SFB
Registro fotográfico
Retira o meio
lava com PBS
Adiciona meio com 5%
SFB
Avaliação da proliferação
Registro fotográfico
Avaliação da proliferação
Figura 10 - Esquema de tratamento das células com agonista receptor B 1 (DABK) em diferentes
concentrações.
Tempo zero
Tempo de contato
Tempo
Tempo
60 minutos
24 horas
48 horas
1
2
3
4
Após confluência na placa
de 24 poços
Scratch “rasgo”
Incubação com diferentes
[ ] deDABK (0,1, 1,0, 10
Após 60 minutos
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio 5% SFB
Registro fotográfico
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio com 5%
SFB
Avaliação da proliferação
Registro fotográfico
Avaliação da proliferação
e 100nM)
Meio sem SFB
Registro fotográfico
42
4.2.5 Avaliações do papel das cininas na proliferação celular em fibroblastos
pré tratados com TNF
Com o objetivo de avaliar a co-participação do TNF na proliferação celular de
fibroblastos L929 induzida pelos agonistas cininérgicos, as células foram pré-tratadas
com TNF imediatamente após o stress mecânico e mantidas em contato por 240
minutos. Após este estímulo o meio é retirado, as células lavadas com PBS e então
tratadas com agonistas cininérgicos por 60 minutos. Após este período o meio foi
retirado, as células foram lavadas com PBS, incubadas com meio de cultivo
suplementado com 5% de SFB e mantidas por 48 horas. Foi realizada avaliação da
proliferação celular por meio de registro fotográfico em 24 e 48 horas após o rasgo
(Figura 11 e 12).
Figura 11 – Esquema de tratamento com o agonista do receptor B2, BK, em células pré tratadas com
TNF.
Tempo zero
Tempo 240
Tempo 60
Tempo
Tempo
Incubação com
minutos
minutos
24 horas
48 horas
1
2
3
4
5
Após confluência na
placa de 24 poços
“Scratch“ rasgo”
Incubação com TNF
2ng/ml + meio 5%
de SFB
Após 240min
Após 60 minutos
Retira o meio
Registro fotográfico
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio com
5% SFB
Avaliação da
proliferação
Registro fotográfico
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio sem
TNF
Registro fotográfico
imediatamente após
o rasgo e incubação
suplementação
acrescido das
diferentes [ ] de BK
(0,1, 1,0 ,10 e
100µM)
Lava com PBS
adiciona meio com
5% SFB
Avaliação da
proliferação
43
Figura 12- Esquema do tratamento com o agonista do receptor B1, DABK, em células pré tratadas com
TNF.
Tempo zero
Tempo 240
Tempo 60
Tempo
Tempo
minutos
Minutos
24 horas
48 horas
1
2
3
4
5
Após confluência na
placa de 24 poços
“Scratch“ rasgo”
Incubação com TNF
2ng/ml+meio 5% de
SFB
Após 240min
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio sem
suplementação
acrescido das
diferentes [ ] de
DA BK (0,1, 1,0, 10
e 100nM)
Após 60 minutos
Retira o meio
Lava com PBS
adiciona meio com
5% SFB
Registro fotográfico
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio com
5% SFB
Avaliação da
proliferação
Registro fotográfico
Avaliação da
proliferação
Registro fotográfico
imediatamente após
o rasgo e incubação
4.2.6 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos
L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF.
Para padronizar a resposta obtida e otimizar o modelo testado foram efetuadas
algumas modificações no modelo anteriormente descrito.
Como no ensaio de padronização com diferentes tempos de contato do TNF
com as células os tempos de 90 até 240 minutos apresentaram aumento significativo
na proliferação celular em comparação às células tratadas somente com PBS, sendo
que o tempo de 240 minutos aumenta considerável este nível de proliferação,
padronizou-se o tempo 180 miunutos para os demais ensaios.
Foi utilizada 300µL de meios em cada poço da placa de 24 poços e a
proliferação celular foi avaliada mediante registro fotográfico no tempo zero
(imediatamente após o rasgo), 30 e 48 horas após o rasgo.
A fim de confirmar o possível envolvimento dos receptores cininérgicos B1 e B2
e a co participação do TNF no processo de proliferação dos fibroblastos, foi realizado
um experimento adicionando os antagonistas cininérgicos; antagonista seletivo do
receptor B1) Lys-(Des-Arg9, Leu8)-BK DALBK; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
U.S.A. e com o antagonista seletivo do receptor B2, HOE -140 (D-Arg0-Hyp3-Thi5-DTic7Oic8-BK, Hoechst AG, Frankfurt, Germany), após o pré estimulação do TNF por 180
minutos, e mantidos em contato com as células, conforme o esquema da figura 13.
44
Para confirmar a participação do TNF o mesmo foi incubado na presença do
anticorpo anti TNF em coadministração e mantidos por 180 minutos, após foi retirado
o meio e as células foram lavadas com PBS.
E ainda para avaliar o envolvimento do fator de transcrição NF-ƙB na
proliferação dos fibroblastos foi efetuado um tratamento utilizando um inibidor da
ativação deste fator de transcrição o PDTC (pirrolidinaditiocarbamato), administrado
após o estímulo do TNF por 180 minutos, e os tratamentos foram mantidos até 48
horas após o rasgo, conforme figura 13.
Figura 13- Esquema do tratamento com os antagonistas do receptor B1 e B2, anticorpo anti TNF e
PDTC, administrados após o pré tratamento com TNF.
Tempo zero
Tempo 180
Tempo
Tempo
minutos
30 horas
48 horas
1
2
4
5
Após confluência na
placa de 24 poços
“Scratch“ rasgo”
Incubação com TNF
2ng/ml + meio 5%
de SFB
Após 180min
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio 5%
SFB acrescido de:
Registro fotográfico
Avaliação da
proliferação
Registro fotográfico
Avaliação da
proliferação
AB anti TNF
Nas cels que não
receberam estímulo
com TNF
receberam apenas
PBS + meio 5%
SFB
Registro fotográfico
imediatamente após
o rasgo e incubação
HOE-140 1µM
DALBK 10µM
Ou
PDTC
45
4.2.7 Avaliação do efeito das cininas na proliferação celular em fibroblastos
pré tratados ou não com TNF em coadministração ou não do anticorpo anti
TNF.
Para avaliar o efeito da coparticipação do TNF na proliferação celular de
fibroblastos estimulada pelos agonistas cininérgicos as células foram cultivados em
placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida incubados
com TNF coadministradas ou não com o anticorpo recombinante para esta citocina.
Após este tempo de contato as células foram estimuladas com agonistas das cininas
(BK ou DABK) conforme exemplificado figura 14.
Com o objetivo de comparar a proliferação sem o pré estímulo do TNF, também
foram realizados tratamentos onde as células foram tratadas apenas com os agonistas
BK ou DABK esquema da figura 14.
Para confirmar a hipótese de estresse mecânico gerado pela ruptura da adesão
celular causada pelo rasgo na monocamada também induz a liberação de cininas
pelas células, as mesmas foram tratadas com os antagonistas, HOE-140 e DALBK
logo após o rasgo.
Figura 14 - Esquema do tratamento com os agonistas do receptor B1 e B2 pré tratadas ou não com o
TNF e coadministradas ou não com o anticorpo anti TNF.
Tempo zero
Tempo 180 minutos
Tempo
Tempo
2
30 horas
48 horas
4
5
Registro
fotográfico
Avaliação
da
proliferação
Registro fotográfico
Avaliação da
proliferação
1
Após confluência na
placa de 24 poços
“Scratch“ rasgo”
Incubação com TNF
2ng/ml + meio 5%
de SFB
AB anti TNF
Nas cels que não
receberam estímulo
com TNF
receberam apenas
PBS + meio %%
SFB
Registro fotográfico
imediatamente após
o rasgo e incubação
Após 180min
Retira o meio
Lava com PBS
Adiciona meio 5% SFB
acrescido de:
BK 10 µM
DABK 1nM
HOE-140 1µM
DALBK 10µM
BK 10 µM+HOE1µM
DABK 1nM+DALBK 10µM
46
4.3 Análises dos dados e apresentação dos resultados
O cultivo com os tratamentos foi mantido e controlado após scratch, pelo
período de 24 e 48 horas. A condição controle foi realizada com veículo de diluição
dos componentes (PBS).
Nos tempos zero (logo após o trauma mecânico), 24 e 48 horas o ensaio foi
analisado utilizando microscópio de contraste de fase (Olympus CKX 41) e as imagens
capturadas com uma câmera digital acoplada ao microscópio, com aumento final de
100x. As análises foram realizadas medindo a área sem proliferação, obtida na região
do “risco” em mm2 utilizando o software ImageJ1.46r como apresentado na figura 15.
A análise dos resultados foi realizada a partir do cálculo da % área de cobertura
de proliferação usando a fórmula abaixo:
% da área de cobertura 24 h = Área em 24 h x 100
- 100
Área em T0
% da área de cobertura 48 h = Área em 48 h x 100
- 100
Área em T24
Os tratamentos dos itens 4.2.6 e 4,2,7, foram avaliados de forma diferente para
melhor padronização da técnica, onde as células foram mantidas por 48horas após o
estresse mecânico e as análises fotográficas foram feitas em 30 horas após o rasgo.
As células foram mantidas por mantidas por 48 horas e os registros fotográficos foram
feitos, porém pelaquantidade de meio por poço foi diminuída e mantida por 48 horas
percebe-se uma diminuição da proliferação celular em 48 horas e uma mudança na
morfologia celular, portanto foi mantida apenas a análise em 30 horas decultivo após
o estresse mecânico (rasgo).
Os resultados obtidos foram avaliados conforme a formulação abaixo:
% da área de cobertura 30 h = Área em 30 h x 100
Área em T0
- 100
47
Figura 15- Imagens da monocamada de fibroblastos L929 antes e após o ensaio de Scratch
A
B
C
Ilustração das imagens do cultivo celular utilizando o software ImageJ1.46r para avaliação A).
Representa o cultivo de fibroblastos L929 em monocamada após confluência de 48horas. B) Imagem
da monocamada no tempo zero após execução do scratch e como análise da área formada na
monocamada. C) Imagem do campo da placa de cultivo de um ensaio após 48 horas do scratch com a
marcação da análise da área demarcada indicando a diminuição da área e um subsequente aumento
na área de cobertura do rasgo através da proliferação celular.
4.4 Analise estatística
Os resultados obtidos nos experimentos foram expressos em média ± erro
padrão da média (E.P.M.) e analisados estatisticamente por Teste “t” de student ou
pela análise de variância com comparações múltiplas (ANOVA) e, quando necessário,
foram utilizados como pós-teste o Teste de Tukey-Kramer ou Newman-Keuls. Os
dados
foram
analisados
no
programa
significativamente estatístico o p<0,05.
GraphPad
Prism,
admitindo
como
48
5.0 RESULTADOS
5.1 Efeitos do TNF sobre a proliferação de fibroblastos
Os dados apresentados na figura 16 mostram o efeito do tratamento com TNF
(2 ng/mL) na proliferação de fibroblastos utilizando o modelo de scratch. É possível
verificar que a proliferação é dependente do tempo de exposição ao TNF, sendo o
tempo de 240 minutos o que promove maior proliferação celular após 48 horas,
portanto, foi adotado como o período de incubação nos ensaios posteriores onde
houve o estímulo celular com o TNF. Porém no decorrer do trabalho observa-se que
o período de 240 minutos de contato com as células em 24 horas já demonstra 90%
de proliferação o que não oferece uma janela adequada para os estímulos
subsequentes desta forma, para melhor padronização do método utilizou-se o tempo
de 180 minutos decontato do TNF com as células.
Figura 16 - O tratamento com TNF aumenta a proliferação de fibroblastos quando incubados por 240
minutos.
% área de cobertura
100
TNF (2 ng/mL)
80
**
*
60
40
20
0
PBS
30
60
90
240
Tempo de exposição (min)
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL por diferentes tempos de
contato e mantidas incubadas por 48 hs. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de
cobertura em 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. ANOVA seguida do teste de NewmanKeuls.* p<0,05 e ** p<0,01 diferem significativamente do grupo tratado com veículo PBS .
49
5.2 Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na
proliferação de fibroblastos, com e sem estímulo com TNF.
5.2.1 Influência da administração de agonistas dos receptores de cininas na
proliferação de fibroblastos L929 quando administrados sem o pré estímulo do
TNF.
Os dados apresentados na figura 17 e 21 demontram que o tratamento com
BK, um agonista de receptores B2, não induz proliferação celular em nenhuma das
concentrações avaliadas. Ressalta-se que este experimento foi realizado em
fibroblatos sem o pré estímulo com TNF. Adicionalmente, a concetração de 100 µM
de BK apresentou efeito antiproliferativo quando comparado com as demais doses de
BK.
Quando as células foram tratadas com agonista de receptores B 1 (DABK),
utilizando concentrações nanomolares, foi observado aumento significativo na
proliferação em todas as doses avaliadas quando comparado com células tratadas
apenas com veículo (Figuras 17 e 21).
50
Figura 17- Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos,
sem o estímulo do pré-tratamento com o TNF
100
% área coberta
80
60
###
40
20
0
PBS
0,1
1
10
100
BK [M]
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de BK em diferentes concentrações e
mantidas por 48 horas. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 24 e
48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos
realizados em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls.### p < 0,001 diferem
significativamente do grupo tratado com veículo PBS .
51
Figura 18- Efeitos do tratamento com DABK em diferentes concentrações na proliferação de
fibroblastos, sem o estímulo do pré tratamento com o TNF-α
###
100
% área coberta
80
60
40
20
0
PBS
0,1
1
10
100
DABK [nM]
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de DABK em diferentes concentrações e
mantidas por 48 horas. Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 24 e
48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos
realizados em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. ### p < 0,001 diferem
significativamente do grupo tratado com veículo PBS.
5.2.2 Influência da administração de agonistas do receptor de cininas na
proliferação de fibroblastos L929 quando administrados após células pré
tratadas com TNF.
O efeito do tratamento com os agonistas cininérgicos BK e DABK foi avaliado
240 minutos após pré-tratamento com TNF. Diferentes doses dos agonistas foram
empregadas, e as células foram incubadas durante 60 minutos.
Os dados obtidos (figura 19 e 21) mostram que diferentes concentrações de BK
apresentam efeitos distintos, quando as células foram tratadas com 0,1 ou 1 µM não
foi verificada diferença no efeito proliferativo em comparação ao grupo tratado
somente com TNF (2ng/mL). No entanto, na concentração elevada (100 µM), foi
observado diminuição na capacidade proliferatiava. Entretanto a dose de 10 µM após
48 horas de proliferação apresentou efeito adicional aos efeitos induzidos pelo TNF
(figura 20 e 21). A partir dos dados obtidos pode-se sugerir a participação dos
52
receptores B2 no efeito mitogênico/proliferativo de fibroblastos, demonstrando uma
dependência do processo inflamatório induzido pelo TNF.
Figura 19- Efeitos do tratamento com BK em diferentes concentrações na proliferação de fibroblastos,
com o estímulo do pré-tratamento com o TNF
*
###
100
###
###
##
##
% área coberta
80
60
40
20
0
Br
0,1
1
10
100
Bk [M]
TNF (2ng/mL; 240 min)
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL por 240 min.e após incubadas
com solução de BK em diferentes concentrações e mantidas por 48 horas. Os valores representam a
média ± E.P.M da % de área de cobertura em 24 e 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os
resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicate. ANOVA seguida do teste
de Newman-Keuls. * p < 0,05 difere significativamente do grupo tratado com TNF. ## p < 0.01 e ### p <
0,001 diferem significativamente do grupo tratado com veículo PBS.
Os dados da figura 20 permitem observar que o tratamento das células com
DABK em concentrações nanomolares após pré tratamento com TNF, não parece
potencializar o efeito proliferativo do TNF em nenhuma das concentrações utilizadas.
Mostrando assim uma não correlação dose-efeito da DABK, porém a janela obtida
com pré estímulo com o TNF não permite analisar a resposta da DABK com precisão
já que em 24 horas o TNF já apresenta um resultado na área de cobertura superior a
80%.
53
Figura 20 - Efeitos do tratamento com DABK em diferentes concentrações (nanomolar) na proliferação
de fibroblastos, com pré estímulo do TNF.
100
***
***
**
**
% área coberta
80
60
40
20
0
PBS
0,1
1
10
100
DABK [nM]
TNF (2ng/mL; 240 min)
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL por 240 min.e após incubadas
com solução de DABK em diferentes concentrações e mantidas por 48 horas. Os valores representam
a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 48hs após o scratch em relação ao tempo zero. Os
resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata. A análise estatística foi
realizada com ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. **p<0,01 para os tratamentos com TNF e
com TNF+ DABK 100nM em relação às células tratadas apenas com PBS (veículo). ***p<0,001 para
as demais concentrações em relação às células tratadas apenas com o veículo (PBS).
Pode se observar uma maior porcentagem da área de cobertura quando as
células são tratadas com TNF (Figura 21). Observa-se que o pré estímulo com TNF
aumenta a procentagem da área de combertura quando comparada com as células
sem este estímulo. Porém esta área não apresenta este incremento na porcentagem
de área cobertura quando tratadas apenas com os agonistas sem o estímulo do TNF.
54
Figura 21 - Imagem da proliferação celular com tratamento de TNF e dos agonistas dos receptores
cininérgicos , BK e DABK, sem e com o pré estímulo do TNF
Ilustra a proliferação de fibrobloblasto L929 após stress mecânico com a ruptura da monocamada com
uma ponteira (tip200) e na sequência foram incubados com TNF-α por 240 minutos, também demonstra
a proliferação celular com tratamentos dos agonistas (BK e DABK) por 60 minutos, com e sem o pré
estímulo do TNF.
55
5.2.3 Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos
L929 induzida pelo TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF
Para padronizar a resposta obtida nos resultados anteriores e otimizar o modelo
testado, foram efetuadas algumas modificações no modelo inicialmente descrito.
Como no ensaio de padronização com diferentes tempos de contato do TNF
com as células os tempos de 90 até 240 minutos apresentaram aumento significativo
na proliferação celular em comparação às células tratadas somente com PBS, sendo
que o tempo de 240 minutos aumenta considerável este nível de proliferação,
padronizou-se o tempo 180 miunutos para os demais ensaios.
Foram utilizados 300µL de meio em cada poço da placa de 24 poços e a
proliferação celular foi avaliada mediante registro fotográfico no tempo zero
(imediatamente após o rasgo) e 30 48 horas após o rasgo.
Para avaliar a participação do TNF na proliferação celular fibroblastos
cultivados em placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida
incubados com TNF coadministrados ou não com o anticorpo recombinante para esta
citocina.
A partir dos dados mostrados na figura 22 e 24 pode se observar que o TNF
potencializa a proliferação de fibroblastos, a qual foi bloqueada pelo seu anticorpo,
para níveis abaixo do tratamento apenas com PBS. O efeito do a administração do
anticorpo anti TNF logo após o estresse mecânico sem o estímulo com TNF não
apresentou resultado significativo quando comparado com as células tratadas apenas
com o veículo demonstrando a importância do estímulo com esta citocina para início
da resposta inflamatória e proliferativa.
Quando as células foram pré estimuladas com TNF por 180 minutos e depois
incubadas por 48 horas com os antagonistas cininérgicos tanto do receptor B1
(DALBK) como do receptor B2 (HOE-140), observa-se uma redução significativa da
proliferação quando comparada à proliferação obtida sem estes antagonistas, o que
demonstra uma participação destes receptores no estímulo proliferativo destas células
(figura 22).
Para avaliar o envolvimento do fator de transcrição NF-ƙB na proliferação dos
fibroblastos foi efetuado um tratamento utilizando um inibidor da ativação deste fator
de transcrição o PDTC, administrado após o estímulo com TNF por 180 minutos, e os
56
tratamentos foram mantidos até 48 horas após o rasgo. Analisando os dados da figura
22, pode-se concluir que o estímulo proliferativo ocorre via fatores de transcrição
nuclear já que a incubação com PDTC inibe de forma significativa a proliferação obtida
pelo estímulo com TNF.
Figura 22 - Efeito dos antagonistas cininérgicos sobre a proliferação de fibroblastos L929 induzida pelo
TNF e pelas cininas com pré estímulo do TNF
ns
60
##
proliferação em 30 horas
% área coberta
50
40
30
*
*
20
*
*
10
TNF + PDTC
TNF + DLABK + HOE
TNF + HOE
TNF + DALBK
PBS + Ab
TNF + Ab
TNF
**
PBS
0
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL com e sem coadministração
do anticorpo recombinante para esta citocina, com os antagonistas cininérgicos seletivos HOE-140 e
DALBK ou ainda na presença de ambos e também com o inibidor do fator de transcrição nuclear NFƙB (PDTC). Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 30horas após o
scratch em relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados
em triplicata. ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. ##p<0,01 difere significativamente do grupo
ttratado com PBS e *p<0,05 e **p<0,01 diferem significativamente do grupo tratado com TNF.
57
5.2.4 Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF na
proliferação de fibroblastos L929.
Para avaliar o efeito dos receptores cininérgicos na proliferação, fibroblastos
cultivados em placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida
incubados com TNF coadministrados ou não com o anticorpo recombinante para esta
citocina. Após 180 minutos de contato, as células foram lavadas e tratadas com o
agonista do receptor B1 (DABK) e o agonista do receptor B2 (BK), assim como
tratamentos onde estes agonistas foram coadministrados com seus antagonistas
seletivos DALBK e HOE -140 respectivamente.
Foram realizados tratamentos onde as células foram tratadas apenas com o os
agonistas, BK ou DABK sem pré estímulo com TNF assim como tratamentos apenas
com os antagonistas seletivos destes recepetores (DALBK e HOE-140).
A partir dos dados demonstrados na figura 23 e 24 pode se observar que o TNF
potencializa a proliferação de fibroblastos, a qual foi bloqueada pelo seu anticorpo,
para níveis abaixo do tratamento apenas com PBS.
Também pode-se observar, que o TNF potencializa a ação da BK, uma vez que
o tratamento com TNF e o agonista do receptor B2 (BK) apresenta um efeito adicional
à proliferação obtida com tratamento apenas com o TNF e quando comparada com a
proliferação obtida apenas com o agonista sem o pré estímulo do TNF.
A adição dos antagonistas dos receptores cininérgicos HOE-140 e DALBK foi
capaz de diminuir a proliferação celular para níveis inferiores aos obtidos com o
estímulo do TNF e com o efeito adicional da BK demonstrando um envolvimento dos
receptores cininérgicos na proliferação celular induzida pelo TNF.
Neste tratamento, o anticorpo anti-TNF e a coadministração do antagonista do
receptor B2 com a BK após o estímulo o pré estímulo com TNF interfere de forma
significativa na redução da proliferação induzida pela BK com o pré estímulo do TNF
demontrando a importância do estímulo inflamatório para a proliferação induzida pela
BK.
Já a DABK não parece potencializar o efeito obtido na proliferação induzida
pelo TNF, nem a proliferação obtida sem pré estímulo do TNF parece interferir de
forma significativa quando comparada com o grupo tratado apenas com PBS. Já
administração do antagonista do receptor B1, DALBK foi capaz de diminuir a
proliferação a níveis menores do que os obtidos com o estímulo do TNF.
58
Figura 23 - Influência dos receptores cininérgicos e a participação do TNF na proliferação de
fibroblastos L929
Proliferação em 30 horas
Proliferação de fibroblastos L929 incubados com solução de TNF 2ng/mL com e sem coadministração
do anticorpo recombinante para esta citocina, com os agonistas BK e DABK em coadministração ou
não com seus antagonistas HOE -140 ou DALBK respectivamente, com e sem o pré estímulo do TNF
Os valores representam a média ± E.P.M da % de área de cobertura em 30 hs após o scratch em
relação ao tempo zero. Os resultados apresentam a média de 3 experimentos realizados em triplicata.
ANOVA seguida do teste de Newman-Keuls. # p < 0,05 difere do grupo tratado com PBS , *p<0,05
difere do grupo tratado com TNF e + p < 0,05 difere do grupo tratado com TNF + BK.
59
Na figura 24 é possível observar uma significativa diminuição da porcentagem da área
de cobertura quando as células são tratadas com o anti TNF em co administração com
TNF ou com os antagonistas dos receptores cininérgicos.
Observa-se que o pré estímulo com TNF mantém a procentagem da área de
combertura, ao incubar as células com o agonista do receptor B2, a BK em células
estimuladas com TNF, esta células demonstraram um efeito adicional no aumento da
porcentagem da área de cobertura, fato não observado quando este agonista foi
incubado sozinho sem o pré estímulo da citocina. È possível notar que a adição do
PDTC após o pré estímulo com TNF bloqueia a proliferação celular em fibroblastos
L929, sugerindo que este estímulo ocorra via ativação do NF-ƙB.
Figura 24 – Imagem do efeito do tratamento as células com o anticorpo anti TNF em coadministração
com TNF e desafiadas com os agonistas BK e DABK com sem a presença dos antagonistas
cininérgicos HOE-140 e DALBK.
Ilustra a proliferação de fibrobloblasto L929 após stress mecânico com a ruptura da monocamada e na
sequência a incubação com TNF por 180 minutos em coadministração ou não com o anti corpo anti
TNF, tamb com a adição dos agonistas co administrados ou não com seus antagonistas e a imagem
de células incubadas com PDTC após o pré estímulo com TNF.
60
6.0 DISCUSSÃO
Após a ocorrência de uma lesão tecidual, várias vias de sinalização inter e
intracelular são ativadas com o objetivo de restaurar rapidamente a homeostase do
tecido. Os componentes celulares do sistema imunológico, a cascata de coagulação
sanguínea e as vias inflamatórias são ativadas. Várias células, incluindo células do
sistema imune, como neutrófilos, monócitos, linfócitos e células dendríticas, células
endoteliais, queratinócitos e fibroblastos, sofrem alterações na expressão gênica,
ocasionando a migração, proliferação e diferenciação celular (GURTNER et al., 2008).
A fibroplasia é uma etapa fundamental na formação de um novo tecido, sendo
caracterizada pela migração e proliferação de células, como os fibroblastos, que irão
formar o tecido de granulação (SINGER; CLARK, 1999; ENOCH; LEAPER, 2008). A
proliferação celular é um processo central em condições fisiológicas e possui papel
essencial no processo de reparação tecidual onde a mitose é regulada por um gama
de sinais autócrinos, parácrinos e fatores humorais (WALSH; FAN, 1997).
Diversos modelos experimentais in vitro têm sido desenvolvidos para estudar o
processo de reparo tecidual e reepitelização. Dentre eles pode-se destacar o modelo
organotípico de cultura 3D de queratinócito e fibroblasto ex vivo, o modelo ex vivo
onde se usa pele de camundongo ou de humano extraídas de cirurgia plástica ou
ainda o co-cultivo in vitro em duas câmaras envolvendo cultura de fibroblasto e
queratinócitos (LOO; HALLIWELL, 2012).
Um modelo amplamente empregado e de baixa complexidade é o “scratch
assay” (ensaio do rasgo). Neste modelo uma monocamada de células confluentes é
submetida a uma lesão mecânica promovendo a descontinuidade da adesão celular
fazendo com que as células presentes na borda do rasgo se proliferem para o
posterior preenchimento do espaço até que novos contatos célula-célula sejam
estabelecidos. Esta técnica pode ser empregada para medir a proliferação de células
in vitro (LOO; HALLIWELL, 2012). As imagens são capturadas no início do ensaio
(logo após o “rasgo”) em intervalos regulares durante a migração celular até o
fechamento do espaço criado pela ruptura na monocamada. Comparando as imagens
durante o período pode se quantificar a taxa de proliferação celular (LIANG; PARK;
GUAN, 2007).
61
A partir da padronização do método descrito acima, o presente estudo teve
como objetivo inicial avaliar a proliferação celular de fibroblastos da linhagem murino
L929 estimulados com TNF na tentativa de mimetizar o processo inflamatório
encontrado na derme após a lesão tecidual. O TNF é uma citocina sintetizada por
monócitos, macrófagos, célula endotelial, neutrófilos, linfócitos na presença de um
estímulo inflamatório, após ativação do fator de transcrição NF-B. Após ser produzido
e clivado pela ação da enzima TACE, este mediador é liberado e a sua ação nas
células-alvo ocorre pela ligação a receptores específicos denominados receptores de
TNF I e II (TNF-RI e TNF-RII). O TNF-RI é expresso constitutivamente nas células,
enquanto o TNF-RII é induzido pela ação de metaloproteinases em resposta a sinais
inflamatórios. Quando liberado no local da resposta inflamatória, o TNF promove
ativação celular bem como a liberação de outras citocinas e mediadores químicos
(DINARELLO; MOLDAWER, 2000; ABBAS; SEELY, 2003; ISHII et al., 2010).
Os dados obtidos no presente trabalho demostram que fibroblastos L929
tratados com (2 ng/mL) por 240 minutos apresentam aumento na proliferação celular
em 24 e 48 horas, evidenciando assim um efeito positivo do TNF sobre a proliferação
de fibroblastos L929. Dados obtidos por Kanno e colaboradores (2013), mostram que
as células estruturais da pele, como queratinócitos, fibroblastos e células endoteliais
vasculares, produzem TNF quando estimuladas por uma bactéria, o que leva a
infiltração de neutrófilos e acelera o processo de reparo tecidual. Em estudos
anteriores os mesmos autores concluíram que a inoculação com P. aeruginosa
(PAO1) favorece a cicatrização de feridas através da indução de infiltração de
neutrófilos, que desempenha um papel importante como fonte de TNF (KANNO et al.,
2011).
Por outro lado, dados da literatura também demostram que o TNF pode inibir a
reepitelização de feridas, mostrando assim que os efeitos dessa citocina são
dependentes da concentração e da duração da exposição. Em baixas concentrações
o TNF pode promover o reparo tecidual por agir indiretamente estimulando a
inflamação e induzindo a migração de neutrófilos e a liberação de fatores de
crescimento. No entanto, concentrações elevadas de TNF, especialmente durante
longos períodos, podem ter um efeito prejudicial sobre o processo de reparo, uma vez
que esta citocina tem a capacidade de suprimir a síntese de proteínas de matriz
extracelular e seus inibidores teciduais, enquanto aumenta a síntese das MMPs
(MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13, e de MT1-MMP) (BARRIENTOS et al.,
62
2008). Ainda, em altas concentrações, através da sua atuação sobre receptores TNFR1, estimula a via de sinalização apoptótica, resultando no recrutamento e ativação
da caspase-8. A caspase-8 ativada por sua vez, ativa caspases efetoras tais como a
caspase-3 e-7, resultando em apoptose celular (ALIKHANI et al., 2004; WALLACH et
al., 2002).
Logo após a formação da lesão, o TNF será liberado a partir de diferentes
células, entre elas os fibroblastos e desta forma, iniciando o estímulo inflamatório
(FAHEY et al., 1990; MEDZHITOV, 2008; KANNO et al., 2013). Além disso, outros
mediadores e vias de sinalização são produtos da ação de citocinas, como é o caso
dos receptores B1 para cininas. Os mesmos são sintetizados e modulados
rapidamente em diversos tipos celulares após trauma tecidual e que sua indução é
resultante de uma cascata de eventos que envolvem também liberação de citocinas,
como por exemplo, IL-1 e TNF (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004; KAPLAN;
KUSUMAM, 2002).
Considerando a importância deste estímulo assim como a modulação da
cascata inflamatória para o processo de regeneração tecidual, a influência desta
citocina foi então primeiramente avaliada.neste trabalho.
Para confirmar o envolvimento do TNF na proliferação celular os fibroblastos
cultivados em placas de 24 poços foram submetidos à técnica de scratch e em seguida
incubados com TNF co-administrados ou não com o anticorpo recombinante para a
mesma citocina durante 180 minutos.
Os resultados obtidos demonstram que a incubação das células com o TNF
potencializa o efeito proliferativo, o que foi comprovado através do bloqueio da
proliferação pelo anticorpo anti-TNF, levando os níveis proliferativos para níveis
inferiores aos obtidos apenas com incubação com o veículo. Estes dados direcionam
o raciocínio para a hipótese de que a proliferação celular do grupo tratado apenas com
veículo também é dependente de TNF liberado pelos próprios fibroblastos, sugerindo
que o estresse mecânico causado pela ruptura do contato célula-célula induz a síntese
de TNF. Diferentes estudos realizados com outros ensaios mencionam o efeito
proliferativo do TNF (HEO et al, 2011; VOLOSHENYUK et al, 2011).
Ao iniciar o estímulo proliferativo através da liberação de TNF acredita-se ainda
que este estresse mecânico também interfira na regulação de outros mediadores,
incluindo as cininas, nos fibroblastos levando-os à liberação destes.
63
Cabe ressaltar que durante a fase de padronização do método foram testadas
várias concentrações de SFB para suplementação do meio de cultivo. Dados da
literatura sugerem a utilização de baixas concentrações de SFB para não interferir nos
resultados de proliferação bem como na possível degradação dos mediadores
utilizados (LOO; HALLIWELL, 2012). Por outro lado, ao cultivar as células sem
suplementação, ou seja, na ausência de fatores de crescimento ocorre uma privação
de nutrientes levando à morte celular, fato observado quando as células foram
cultivadas sem SFB. Foi então padronizada a concentração de 5% de SFB para a
suplementação e mantida no decorrer do trabalho.
Na vigência de um processo inflamatório induzido, por exemplo, pelo TNF,
outras vias intracelulares podem ser ativadas. A ligação do TNF aos seus dois
receptores, o TNFR1 e TNFR2, resulta em recrutamento de transdutores de sinais que
ativam, pelo menos, três diferentes vias. Através de uma complexa cascata de
sinalização, estes efetores levam à ativação de caspases e dois fatores de transcrição,
ativação da proteína-1 e NF-kappaB (BAUD, KARIN, 2001). Para confirmar a ativação
do fator de transcrição nuclear citado acima as células foram subtidas ao pré estímulo
com TNF, foram mantidas por 180 minutos e posteriormente subtidas ao contato de
um inibidor do fator de transcrição nuclear o PDTC. A incubação com PDTC inibe a
proliferação obtida pelo o estímulo do TNF, confirmando os dados citados por Baud e
colaboradores, 2001 onde descrevem que após a ligação do TNF aos seus receptores
ocorra a ativação de fatores de transcrição nuclear iniciando a cascata inflamatória e
a síntese de outros mediadores do processo.
Diversas evidências apontam que receptores B2 para cininas encontram-se
expressos de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares,
inclusive queratinócitos (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995) e são responsáveis
pela maioria das ações fisiológicas das cininas. Já os receptores B1 não são expressos
em níveis significativos nos tecidos em condições normais, mas são sintetizados e
rapidamente modulados em diversos tipos celulares após trauma tecidual ou durante
condições patológicas, indicando um mecanismo adicional na lesão e na recuperação
tecidual. Além disso, a indução do receptor B1 é resultante de uma cascata de eventos
que envolvem a interação entre fatores de transcrição, proteínas quinases, citocinas
e células inflamatórias (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004). Os receptores
B1 são preferencialmente e seletivamente estimulados pelos metabólitos ativos des-
64
Arg9-BK e Lys-des-Arg9-BK, enquanto que os receptores B2 apresentam alta afinidade
pela BK e Lys-BK (MARCEAU; REGOLI, 2004).
Evidências a partir de ensaios in vitro indicam que os agonistas do receptor de
cinina podem estimular a proliferação celular, em particular na presença de outros
fatores de crescimento e mediadores químicos. Esta afirmação feita por Walsh e Fan,
(1997) foi confirmada no presente trabalho quando fibroblastos L929 foram incubados
com concentrações crescentes de BK, após o pré-tratamento com TNF. Foi observado
que a proliferação se apresenta de forma distinta, sendo dose-dependente da
concentração de BK. Nas concentrações de 0,1 e 1 µM de BK não foi verificada
diferença no efeito proliferativo quando comparado ao grupo tratado somente com
TNFα (2ng/mL). De modo semelhante ao observado com o tratamento com TNF, a
BK, em concentrações elevadas (100 µM), reduziu a capacidade proliferativa dos
fibroblastos. De acordo com a literatura, esta diminuição na proliferação se deve em
partes a ação da BK sobre a liberação de ácido araquidônico, o qual é precursor para
a sintese das Ciclooxigeneses e consequente produção de PGE2, a qual apresenta
efeito anti-proliferativo (STRAUS; PANG, 1984). De fato, quando celulas são tratadas
com BK e um anti-inflamatório não esteroidal, como a indometacina, o efeito é
revertido (GOLDSTEIN; WALL, 1984, M MCALLISTER; LEEB-LUNDBERG; OLSON,
1993). Por outro lado, a dose de 10 µM de BK, 48 horas após o tratamento, apresentou
efeito adicional aos efeitos induzidos pelo TNF na proliferação, evidenciando assim
um efeito proliferativo da BK em fibroblastos L929.
Com o intuito de verificar o papel proliferativo da BK foi realizado o mesmo
procedimento sem o pré tratamento com TNF. Neste ensaio foi possível observar que
em nenhuma das concentração a BK promoveu aumento da proliferação de
fribroblastos L929, quando comparado ao grupo tratado apenas com PBS e também
quando comparado com as células pré estimuladas com TNF. Este resultado
demonstra uma dependência de um processo inflamatório pré-instalado, como o
promovido pelo pré-tratamento das células com TNF para induzir a cascata de
proliferação celular através da ação das cininas.
O efeito anti-proliferativo da BK foi anteriormente escrito por Patel e Schrey,
(1992) onde cita que o efeito proliferativo da BK pode apresentar uma curva de
concentração/resposta na forma de “sino” com a inibição em maiores concentrações
deste agonista. Este efeito é decorrente da mesma situação citada anteriormente,
65
onde doses elevadas de BK podem promover aumento da síntese de moléculas antiproliferativas como a PGE2.
Vários estudos sugerem que os receptores B2 das cininas são os responsáveis
pelas ações proliferativas da BK em fibroblastos. Linhagens de fibroblastos sensíveis
aos efeitos de crescimento estimulados pela BK expressam constitutivamente o
receptor B2 (ROBERTS, GULLICK, 1989; BATHON ET AL, 1992; MENKE et al, 1994;
KIEHNE, ROZENGURT, 1995).
Cheng e colaboradores (2004) demonstraram que a BK, através da ativação
dos receptores B2, apresenta efeito mitogênico por ativar a proteína Gq causando
fosforilação da via da PKC e consequente estimulação da via da MEK/ proteína
quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da expressão de c-fos e c-jun em cultura de
queratinócitos obtidos da córnea de coelhos. Também através de receptores B 2, a BK
promove ativação da cascata da p42/p44 MAPK em vários tipos de células humanas,
incluindo as células da musculatura lisa vascular, endoteliais, PC-12 e linhagem de
células tumorais.
Após avaliação dos dados obtidos pode-se sugerir a participação dos
receptores B2 no efeito proliferativo de fibroblastos como observou Kiehne e
Rozengurt, (1994) em fibroblasto 3T3, onde o estímulo proliferativo da BK foi
bloqueado por antagonistas do receptor B2.
O uso de antagonistas para os receptores da cininas tem sido ferramenta
poderosa para determiar os papéis das cininas tanto em condições fisiológicas como
patológicas (STEWART et al, 1999). Foi então realizado um experimento adicionando
o agonista BK e a DABK, com e sem o pré-estímulo do TNF, co-administrados com
antagonista B1 e/ou B2, após este pré estímulo e mantidos em contato com as células
por 30 horas após o estresse mecânico. A BK foi capaz de causar aumento adicional
à prolferação celular obtida com a incubação somente com TNF. Porém sem o pré
estímulo com estacitocina não foi observado o mesmo resultado, onde a proliferação
celular foi menor do que às células tratadas apenas com o veículo. Quando as células
foram tratadas com TNF por 180 minutos e após incubadas com o antagonista do
receptor B2 HOE-140, houve uma diminuição da proliferação quando comparada às
células tratadas apenas com esta citocina.
Este resultado demonstra que existe participação das cininas na proliferação
induzida pelo TNF e esta proliferação pode ocorrer via indução de receptores B2, uma
vez que o antagonista seletivo deste receptor, HOE -140, foi capaz de inibir
66
significativamente a proliferação induzida pela BK em células estimuladas com TNF,
a níveis abaixo dos observados quando as células foram tratadas apenas com o
veículo e nas que foram induzidas apenas com o TNF.
Através deste resultado, acredita-se que a via de proliferação dependa
inicialmente do estímulo inflamatório gerado pelo estresse mecânico e pela adição do
TNF e em seguida da ação da BK sobre receptores B2, levando a proliferação a níveis
menores que o tratamento com veículo, para que após este estímulo a proliferação
seja desencadeada pelos receptores B1 através de mais liberação de TNF ao meio.
Esta hipótese foi construída baseada no fato de que o antagonista do receptor
B1 a DALBK também foi capaz interferir na proliferação celular induzida pelo seu
agonista DABK em células pré estimuladas com TNF assim com em células que
sofreram apenas o estrsse mecânico. Este fato pode ser discutido baseando-se em
relatos da literatura onde evidenciam que os receptores B2 encontram-se expressos
de forma constitutiva em diferentes órgãos, tecidos e tipos celulares (SCHREMMERDANNINGER et al., 1995) e são os principais responsáveis pelas ações fisiológicas
das cininas.
Com relação ao receptor B1, são sintetizados e modulados rapidamente em
diversos tipos celulares após trauma teciduais. Além disso, a indução do receptor B1
é resultante de uma cascata de eventos que envolvem a interação entre fatores de
transcrição, proteínas quinases, células inflamatórias e citocinas, como por exemplo,
IL-1 e TNF-α (CALIXTO et al., 2000; CALIXTO et al., 2004; KAPLAN; KUSUMAM,
2002). Fato demonstrado por Brechter e colaboradores (2008) onde estudam os
efeitos de citocinas em células osteoblástica MG-6 e em fibroblastos gengivais
humanos, comprovando que ambos os receptores são sobre-regulados por IL-1β e
TNF nestas linhagens celulares.
Desta forma estes resultados sugerem duas hipóteses possíveis; onde a
DALBK bloqueie os receptores B1 que foram expressos rapidamente em minutos após
o estress mecânico ou que já existam receptores na membrana para que o antagonista
se ligue.
No mesmo estudo citado anteriormente os autores demonstram que ambos os
receptores B2 e B1 são constitutivamente expressos nas linhagens celulares de
osteoblastos MG-63 e em fibroblastos gengivais humano (BRECHTER et al, 2008). A
presença de forma constitutiva de receptores B1 já havia sido relata por Schremmer-
67
danninger
e
colaboradores
(1999)
onde
demontraram
que
estes
estão
constitutivamente expressos na pele normal
A Expressão constitutiva de Receptores B1 e B2 em linhagem IMR-90 de
fibroblasto pulmonar humano também foi detectada através da ligação específica de
[3H] desArg10KD e [3H] BK, respectivamente. Após incubação das células em meio
DMEM durante 6 h a 37 ° C, as células IMR-90 expressam receptores B1 e B2 em uma
proporção de cerca de 1:85 (PHAGOO, POOLE, LEEB-LUNDBERG, 1999)
Os dados obtidos até o momento demostram que a BK aumenta a atividade
proliferativa dos fibroblastos L929 atuando em receptores B2 após o estímulo celular
com TNF o que possivelmente favoreça o aumento da expressão deste receptor, no
entanto, a atuação dos receptores B1 não pode ser descartada. O efeito global das
cininas na proliferação celular depende, em parte, no nível relativo de B 2 e da
expressão do receptor B1 (ROBERTS, GULLICK, 1989; TAYLOR et al., 1992). Uma
série de tipos celulares, incluindo fibroblastos, podem co-expressar tanto receptors B1
como B2, correspondentemente, a regulação da proliferação pelas cininas pode ser o
produto de diferentes ações simultâneas e através de ambos os receptores
(BASCANDS et al, 2003; MARCEAU; REGOLI, 2004).
Com base na afirmação anterior onde sugerem que o efeito das cininas na
proliferação celular depende, em partes, da expressão dos receptores B1 e B2 foi
também estudado o efeito do receptor B1 na proliferação celular de fibroblastos L929.
(ROBERTS; GULLICK, 1989; TAYLOR; 1992.). A expressão destes dois subtipos de
receptores pode ser regulada em diferentes situações. O receptor B2 como citado
anteriormente é expresso constitutivamente, embora ambos possam ser regulados
por mediadores inflamatórios, tais como a interleucina-1 (IL-1) e o TNF (BATHON et
aL, 1992; GALIZZI et aL, 1994).
Os dados obtidos no presente trabalho empregando um agonista seletivo de
receptores B1, a DABK, demonstraram que em nenhuma das concentrações
empregadas (0,1, 1, e 100 µM) após o pré-tratamento com TNF apresentaram
aumento do efeito proliferativo quando comparado ao grupo somente tratado apenas
com TNF em 24 ou 48 horas. No entanto, cabe ressaltar que o tratamento com DABK
na concentração de 0,1 e 1 µM apresentou efeito anti prolifertivo (dados não
demonstrados), ou seja, inibiu a proliferação celular induzida pelo pré-tratamento com
TNF. Walsh e Fan, (1997) assim como Bascands e colaboradores (2003), também
relatam em sua revisão a existência tanto de efeitos mitogênico e antimitogênico
68
relacionados às cininas, observados em diferentes linhagens celulares e em diferentes
condições, indicando a interação com várias vias importantes na regulação da
proliferação celular. Essa multiplicidade de ação pode resultar da ativação de segundo
mensageiros e de múltiplos subtipos de receptores. Um fator importante relacionado
aos efeitos antiproliferativos da DABK são as doses empregadas, pois os estudos
citados acima sugerem que doses muitos elevadas podem diminuir a proliferação
enquanto doses menos elevadas podem estimular a mesma, ativando vias distintas
dependendo da dose empregada.
Ao incubar os fibroblastos com doses 1000 vezes menores e sem pré estímulo
de TNF foi observado um efeito proliferativo quando comparado às células incubadas
somente com veículo. Porém ao efetuar o pré estímulo com TNF foi observado um
efeito proliferativo em todas as concentrações utilizadas do agonista seletivo do
receptor B1 a DABK. Importante citar que na metodologia inicialmente empregada o
agonista foi incubado e mantido em contato por 60 minutos e lavadas com PBS, como
a ação da DABK pode depender a expressão do receptor B 1 talvez este tempo de
contato seja pouco para que ocorra uma significativa expressão dos mesmos,
interferindo no resultado. A adição de DABK 12 horas após o estresse mecânico e/ou
estímulo com TNF também pode interferir no resultado, em uma possível ação tardia
mediada pelos receptores B1, já que os mesmos são expressos após trauma tecidual
(BATHON et aL, 1992; GALIZZI et aL, 1994).
Foi então realizado um experimento em condições diferentes das inciais para
melhor padronização do método. As células foram pré estimuladas com TNF e após
180 minutos foram lavadas e tratadas com o agonista do receptor B1, DABK coadministrados com seu antagonista seletivo e, assim como outro grupo foi tratado
apenas com o antagonista DALBK e outro apenas com o agonista, sem pre estímulo
do TNF e os tratamento foram mantidos por 30 horas em contato com as células.
A adição do antagonista seletivo para o receptor B 1 (DALBK) foi capaz de
alterar a ação proliferativa do seu agonista DABK em células pré estimuladas com
TNF, diminuindo a proliferação até os níveis das células tratadas apenas com veículo,
porém ao administrar a DABK sem pré estímulo do TNF não houve aumento da
proliferação em relação às células tratadas apenas com TNF, demonstrando a
importância do estímulo inflamatório para início da cascata de proliferação. Um dado
importante obtido foi a diminuição de forma significativa da proliferação quando as
células foram tratadas apenas com o antagonista do receptor B1 DALBK, com e sem
69
pré estímulo do TNF, fato que demonstra o envolvimento também deste receptor na
cascata proliferativa dos fibroblastos L929 induzida pelo estresse mecânico e do
estímulo do TNF. Estes dados sustentam a hipótese de que esta cascata proliferativa
seja iniciada pelo TNF seguido da ativação do receptor B2 e consequente indução do
receptor B1 e mantida por mais TNF liberado.
A ativação de receptores B2 acoplados aos mecanismos de transdução pode
ser responsável pelo aumento da população de receptores B1, sugerindo a existência
de um processo de balanço entre as duas populações de receptores cininérgicos,
durante desordens inflamatórias (CALIXTO et al., 2000).
Outro fato importante a se acrescentar em relação à participação dos
receptores B1 é que, durante o desenvolvimento da inflamação, uma grande
quantidade de BK sofre a ação de carboxipeptidases, produzindo grandes
quantidades dos metabólitos ativos des-Arg9-bradicinina. Esta alta concentração
endógena dos agonistas seletivos para o receptor B 1 demonstra que estes possuem
papel fundamental também na regulação de expressão dos receptores B 1
(SCHANSTRA et al., 1998).
Processos inflamatórios cutâneos induzidos através de diferentes estímulos,
incluindo substâncias alergênicas ou através da radiação ultravioleta, disparam
respostas inflamatórias no tecido cutâneo induzindo diretamente queratinócitos e
estimulando a liberação de citocinas pró-inflamatórias e BK. Nos queratinócitos, a
bradicinina induz o crescimento celular e este efeito pode ser induzido via receptores
específicos de cininas (SCHREMMER-DANNINGER et al., 1995).
Schremmer-Danninger
e
colaboradores
(1995),
utilizando
técnicas
radiográficas, identificaram receptores específicos para bradicinina na camada basal
de epiderme humana sugerindo que as cininas podem estar envolvidas em
mecanismos de proliferação celular epidérmica.
Na tentativa de confirmar os efeitos do TNF e dos receptores para cininas na
proliferação de fibroblastos, foi utilizado o anticorpo anti-TNF em coadministração com
os agonistas de cininas em células pré estimuladas com TNF.
Assim como confirmado que o estímulo mecânico é importante para o início do
estímulo proliferativo, o pré estímulo dos fibroblastos com o TNF é capaz de
potencializar a ação poliferativa da BK. Os dados obtidos confirmam esta hipótese,
uma vez que ao incubar as células com TNF após 180 minutos tratá-las com BK, foi
observado um aumento da proliferação em relação às células tratadas com veículo,
70
assim como aquelas tratadas apenas com TNF. O pré-tratamento do anticorpo antiTNF coadministrado com o TNF por 180 minutos e posterior adição da BK e DABK ao
meio parece interferir na proliferação, diminuindo os níveis proliferativos quando
comparados às células tratadas apenas com a citocina e aquelas tratadas somente
com veículo. Acredita-se que o anticorpo bloqueie o TNF livre no meio de cultivo,
porém, e adição posterior dos agonistas cininérgicos não a BK foi capaz de manter o
estímulo proliferativo, comprovando novamente a dependência do estímulo
inflamatório induzido pelo TNF para início da cascata de ploriferação.
Os mecanismos descritos acima, podem levar à liberação ou mesmo
potencialização da ação de outros importantes mediadores inflamatórios como as
citocinas, assim como a ativação do fator de transcrição NF-B (PAN et al., 1998).
Estes resultados confirmam as evidências da literatura que sugerem que a BK
uma vez ligada ao receptor B2 seja capaz de manter o estímulo proliferativo através
da regulação de rceptores B1 e liberação de TNF (BRECHTER et al, 2008, PHAGOO
et al, 1999; SOUZA et al, 2013)
Com os dados até aqui obtidos neste estudo sugere-se que a BK via receptor
B2 e o TNF ativariam a via de transcrição para aumentar a expressão do receptor B 1,
que se encontra expresso de modo constitutivo e por fim causar proliferação.
Pela ação observada após a co aministração do antagonista seletivo para
receptores B2, HOE-140, acredita-se que a via de proliferação dependa da ação da
BK sobre receptores B2, para que no final a proliferação seja desencadeada pelos
receptores B1 através de mais TNF, uma vez que a DALBK também foi capaz de inibir
a proliferação induzida pelo TNF.
O estresse mecânico causado pelo (rasgo) na monocamada é capaz de induzir
a liberação de TNF no meio. Entretanto, em menores concentrações, a adição de BK,
DABK e TNF, potencializa este efeito proliferativo dependente da dose e do tempo de
contato.
Cabe ressaltar que novos experimentos são necessários, para a melhor
visualização dos efeitos proliferativos das cininas. Desta forma, para confirmação
destes dados sugere-se a a incubação dos antagonistas e do anticorpo anti TNF 12
horas após a administração da BK, DABK ou TNF. Esta sugestão tem o objetivo de
bloquear o estímulo gerado durante as primeiras horas após a agressão mecânica,
bloqueando os mediadores gerados neste período, proporcionando desta forma a
71
obtenção de mais dados sobre o início da cascata de eventos envolvidos na
proliferação observada.
Ressalta–se ainda a importância da quantificação da expressão proteica e
gênica dos receptores B1 e B2, através de técnicas de biologia molecular como
Western Blot ou Real Time PCR. Adicionalmente, sugere-se a avaliação em condições
inicias (basais), assim como, nas condições testadas; na presença de TNF, na
presença dos agonistas (BK e DABK) com e sem estímulo do TNF, utilizando os
tempos zero, 12, 30 e 48 horas após estresse mecânco.
72
7 CONCLUSÕES
A partir da padronização do método “ Scratch “ em monocamada de fibroblastos
murinho L929, foi possível padronizar um método de reparo tecidual in vitro na
tentativa de se aproximar às condições reais de um processo inflamatório encontrado
na derme após a lesão tecidual, possível através da incubação celular com a citocina
TNF.
Os restultados obtidos neste trabalho permitem concluir que:

Fibroblastos L929 tratados com TNF (2 ng/mL) por 240 minutos apresentam
aumento na proliferação celular em 24 e 48 horas.

O efeito proliferativo induzido pelo TNF é dependente da dose e do tempo de
incubação, o que foi comprovado através do bloqueio da proliferação pelo
anticorpo anti-TNF.

Sugere-se que o estresse mecânico causado pela ruptura do contato célulacélula também induza a síntese de TNF

Acredita-se que a cascata de estímulo proliferativo inicada pela ligação do TNF
aos seus receptores esteja ocorrendo via a ativação de fatores de transcrição
nuclear iniciando a cascata inflamatória e a síntese de outros mediadores do
processo.
Ao iniciar o estímulo proliferativo através da liberação de TNF este estresse também
interfere na regulação de outros mediadores, incluindo as cininas.

A BK interfere na proliferação celular de fibroblastos submetidos ao estresse
mecânico.

Este estímulo é dependente do processo inflamatório ali instalado pelo TNF já
que sem o pré estímulo com esta citocina e incubadas com o agonista, as
células não apresentam o mesmo efeito proliferativo.

Existe participação das cininas na proliferação induzida pelo TNF e esta
proliferação pode ocorrer via indução de receptores B2, uma vez que o
antagonista seletivo deste receptor, HOE -140, foi capaz de inibir
significativamente a proliferação induzida pela BK em células estimuladas com
TNF.

O antagonista do receptor B1 a DALBK também foi capaz interferir na
proliferação celular induzida pelo seu agonista DABK em células pré
73
estimuladas com TNF assim com em células que sofreram apenas o estresse
mecânico, demonstrando o envolvimento também deste receptor na cascata
proliferativa dos fibroblastos L929 induzida pelo estresse mecânico e do
estímulo do TNF.

Acredita-se que a via de proliferação dependa inicialmente do estímulo
inflamatório gerado pelo estresse mecânico e pela adição do TNF e em seguida
da ação da BK sobre receptores B2, para que após este estímulo a proliferação
seja desencadeada pelos receptores B1 através de mais liberação de TNF ao
meio.
Juntos, os dados obtidos mostram a importância do processo inflamatório, aqui
representado pelo estímulo prévio do TNF, para a proliferação celular de fibroblastos
murino L929 e que o efeito das cininas na proliferação é dependente deste estimulo
inflamatório, já que as mesmas sozinhas não apresentam efeito proliferativo evidente.
Ainda, o efeito das cininas na proliferação parece ser dependente da ativação de
receptores B2 mas os dados indicam participação também dos receptores B1 já que o
antagonista seletivo deste também interfere na diminuição da proliferação induzida
pelo TNF.
Os resultados obtidos no presente trabalho em conjunto com dados da
literatura, mostraram que esta estratégia é uma ferramenta disponível para a
investigação do processo de cicatrização in vitro
74
REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A.H. IMUNOLOGIA BÁSICA: Funções e Distúrbios do
Sistema Imune. 2ed, Rio de Janeiro: Revinter, 2003
ADETUTU, A., MORGAN, W.A., CORCORAN, O., Ethnopharmacological survey and
in vitro evaluation of wound-healing plants used in South-western Nigeria. J.
Ethnopharmacol., v. 137, p. 50– 56, 2011
AGREN, M.S., TAPLIN, C.J., WOESSNER, J.F. JR., EAGLSTEIN, W.H., MERTZ,
P.M. Collagenase in wound healing: effect of wound age and type, J Invest
Dermatol, v. 99, p 709-14, 1992.
ALIKHANI, M.; ALIKHANI, Z.; RAPTIS, M.; GRAVES, D. T. TNF-α In Vivo Stimulates
Apoptosis in Fibroblasts Through Caspase-8 activation and Modulates the
expression of Pro-Apoptotic Genes .Journal Of Cellular Physiology, v.201, p.341–
348, 2004
BALBINO, C. A.; PEREIRA, L. M.; CURI, R. Mecanismos envolvidos na cicatrização:
uma revisão. Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, v. 41, n. 1, jan./mar.
2005.
BARRIENTOS, S.; STOJADINOVIC, O.; GOLINKO, M. S.; BREM, H.; MARJANA
TOMIC-CANIC, M. Growth factors and cytokines in wound healing. Wound Rep
Reg, v.16, p. 585–601, 2008.
BASCANDS, L., SCHANSTRA, J. P., COUTURE, R., GIROLAMI J.P. Les récepteurs
de la bradykinine: de nouveaux rôles physiopathologiques. Medecine/Sciences, v.
19, p. 1093-100, 2003
BATHON, J.M., MANNING, D.C., GOLDMAN, D.W., TOWNS, M.C. AND PROUD, D.
Characterization of kinin receptors on human synovial cells and upregulation of
receptor number by interleukin-1. J. Pharmacol. Exp. Ther. V. 260, p.384-392, 1992
BAUD, V.,KARIN, M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its
relatives.Trends Cell Biol, v.11 , p. 372-7, 2001
BHOOLA, K. D.; FIGUEROA, C. D. E.; WORTHY, K. Bioregulation of kinins:
kallikreins,kininogens, and kininases. Pharmacol. Ver., v. 44,n. 1, p .1-80, 1992.
BRAIMAN-WIKSMAN, L.; SOLOMONIK, I.; SPIRA, R.; TENNENBAUM, T. Novel
Insights into Wound Healing Sequence of Events. Toxicologic Pathology, v. 35,
p.767–779, 2007
CAMPOS, M. M; CALIXTO, J. B.; Involvement of B1 and B2 receptors in badykinininduced rat paw oedema. Br.J. Pharmacol., v. 114, p.1005-1013, 1995.
CAMPOS, M. M; MATA, L. V.; CALIXTO, J. B.; Expression of B1 kinin receptors
mediating paw edema and formalin-induced nociception modulation by
glucocorticoids. Can. J. Physiol. Pharmacol., v. 73, p. 812-819, 1995.
75
CAMPOS, M. M.; SOUZA, G. E. P.; RICCI, N. D.; PESQUERO, J. L.; TEIXEIRA, M.
M; CALIXTO, J. B. The role of migrating leukocytes in IL-1b-induced up-regulation of
kinin B1receptors in rats.Br. J. Pharmacol., v.135, p.1107-1114, 2002.
CALIXTO, J. B.; CABRINI, D. A.; FERREIRA, J. E.; CAMPOS, M. M. Kinins in pain
and inflammation. Pain, v. 87, n.1, p.1-5, 2000.
CALIXTO, J. B; MEDEIROS, R.; FERNANDES, E. S.; FERREIRA, J.; CABRINI, D.
A.; CAMPOS, M. M. Kinin B1 receptors: key G-protein-coupled receptors and their
role in inflammatory and painful processes. Br. J. Pharmacol., v. 143, n. 7, p. 803818, 2004.
CHEN, C.C., YOUNG, J. L., MONZON, R. I., CHEN, N., TODOROVIC, V., LAU, L.F.
Cytotoxicity of TNF-α is regulated by integrinmediated matrix signaling. EMBO J., v.
26, p. 1257–1267, 2007
CHENG, C. Y.; HUANG, S. C.; HSIAO, L. D.; SUN, C. C.; JOU, M. J.; YANG, C. M.
Bradykinin-stimulated p42/p44 MAPK activation associated with cell proliferation in
corneal keratocytes. Cell Signal, v.16, n. 5, p. 535-549, 2004.
CHENG, C.; TSENG, H.C.; MAO, Y.C. Bradykinin-Mediated Cell
Proliferation Depends on Transactivation of EGF Receptor in Corneal Fibroblasts. J.
Cell. Physiol, v. 227, p. 1367–1381, 2012
CHIARI, B. G.; MAGNANI. C.; SALGADO, H. R. N.; CORRÊA, M. A.; ISAAC, V. L.
B.; Estudo da segurança de cosméticos: presente e futuro. Rev Ciênc Farm Básica
Apl, v.33, n. 3, p. 323-330, 2012.
CLARK, R. A. F. Cutaneous tissue repair: basic biologic considerations. Journal of
the American Academy of Dermatology, v. 13, p. 701-725, 1985.
CLARK, E.; SCERRI, L. Superficial and medium-depth chemical peels. Clinics in
Dermatology, v. 26, p. 209–218, 2008
COUGHLIN, S.; LEE, W.M.; WILLIAMS, P.W.; GIELS, G.M.; WILLIAMS, L.T. c-myc
gene expression is stimulated by agents that activate protein kinase C and does not
account for the mitogenic effect of PDGF. Cell, v.43, p.243-251, 1985.
DINARELLO, C. A. Interleukin-1, interleukin-1 receptors and interleukin-1 receptor
antagonista. Int. Rev. Immunol., v. 16, p. 457-499, 1998
DINARELLO, C.A., MOLDAWER, L.L. Proinflammatory and Anti-inflammatory
Cytokines in Rheumatoid Arthritis. A primer for clinicians, 2ed, Amgen, 2000
EMING, S.; KRIEG, T.; DAVIDSON, J.M.Inflammation in Wound Repair: Molecular
and Cellular Mechanisms. Journal of Investigative Dermatology, v. 127, p.514525, 2007.
ENOCH, S.; LEAPER, D. J. Basic science of wound healing. Surgery, v. 36, n. 2, p.
31-37, fev. 2008.
76
FAHEY, T. J.; SHERRY, B.; TRACEY, K. J.; DEVENTER V. S.; JONES, W. G.;
MINEI, J. P.; MORGELLO, S.; SHIRES, G. T.; CERAMI, A. Cytokine production in a
model of wound healing: The appearance of MIP-1, MIP-2, cachectin/TNF-α and IL-I,
Cytokine, v. 2, p. 92-99, 1990
FERNANDES, E. S.; PASSOS, G. F.; CAMPOS, M. M.; ARAUJO, J. G. V. C.;
PESQUERO, J. L.; AVELLLAR, M. C.; TEIXEIRA, M. M.; CALIXTO, J. B.
Mechanisms underlying the modulatory action of platelet activating factor (PAF) on
the upregulation of kinin B1 receptors in the rat paw. Br.J.Pharmacol., v.139, n. 5, p.
973-981, 2003.
FERREIRA, J.; TRICHES, K. M.; MEDEIROS, R. et al..Mechanismis involved in the
nociception produced by peripheral protein kinase C activation in mice.Pain.v.117,
p.171-181, 2005.
FISCHER, T.C; PEROSINO, E.; POLI, F.; VIERA, M.S.; DRENO, B. Chemical peels
in aesthetic dermatology: an update 2009. Journal European Academy of
Dermatology and Venereology, v.24, p. 281–292, 2010.
FREINKEL, R. K.; WOODLEY, D. T. The Biology of the Skin. Lancaster:
Parthenon, 2001.
GAD, C.S. Recent developments in replacing, reducing, and refining animal use in
toxicologic research and testing. Fundam. Appl. Toxicol.,v. 5, n. 1, p. 8-16, 1990
GALIZZI, J.P.; BODINIER, M.C.; CHAPELAIN, B.;LY, S.M.; COUSSY, L.; GIROUD,
S., NELIAT, G.; JEAN, T. Up-regulation of [SH]-des-Arg10 binding to the bradykinin B
1 receptor by intedeukin-l[3 in isolated smooth muscle cells: correlation with B1
agonist-induced PGI 2 production. Br. J. Pharmacol. V. 113,p.389-394,1994.
GAO, L.; CHAO, L.; CHAO, J. A novel signaling pathway of tissue kallikrein in
promoting keratinocyte migration: Activation of proteinase-activated receptor 1 and
epidermal growth factor receptor. Experimental Cell Research, v. 316, p. 376-389,
2010.
GNIADECKI, R. Regulation of keratinocyte proliferation. Gen. Pharmacol., v. 30, n.
5, p. 619-622, 1998.
GODIN, C.; SMITH, A.D.; RILEY, P.A. Bradykinin stimulates DNA synthesis in
competent Balb/c 3T3 cells and enhances inositol phosphate formation induced by
platelet- derived growth factor. Biochem. Pharmacol., v 42, p.117-122, 1991.
GOLDBERG, M.T.; HAN, Y.P.; YAN, C.; SHAW, M. C.; GARNER, W. L. TNF-α
Suppresses a-Smooth Muscle Actin Expression in Human Dermal Fibroblasts: An
Implication for Abnormal Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology, v.
127, p. 2645–2655, 2007.
77
GOLDSTEIN, R. H.; WALL, M. Activation of Protein Formation and Cell Division by
Bradykinin and Des-Argg-bradykinin. The Journal of Biological Chemistry, V.259,
p. 9263-9268, 1984
GOUGAT, J.; FERRARI, B.; SARRAN, L. et al..SSR240612 [(2R)-2-[((3R)-3-(1,3Benzodioxol-5-yl)-3-{[(6-methoxy-2-naphthyl)sulfonyl]amino}propanoyl)amino]-3-(4{[2R,6S)-2,6-dimethylpiperidinyl]methyl}phenyl)-N-isopropyl-Nmethylpropanamide
Hydrochloride], a New Nonpeptide Antagonist of the Bradykinin B1Receptor:
Biochemical and Pharmacological.J. Pharmacol. Exp. Ther, v.309, p. 661-669,
2004.
GURTNER, G. C.; WERNER, S.; BARRANDON, Y.; LONGAKER, M. Wound repair
and regeneration. Nature, v.453, p.314-321, 2008
HARRIS, M. I. N. C. Pele: estrutura, propriedades propriedades e envelhecimento. 3.
ed. rev. e ampl . São Paulo, SP: SENAC, 2009.
HENRY, G.; GARNER, W. L., Inflammatory mediators in wound healing, Surg. Clin.
N. Am.,v. 83, p. 483-507, 2003
HEO, S. C., JEON, E. S., LEE, H.I., KIM, H. S., KIM, M. B., KIM, J. H. Tumor
Necrosis Factor-a-Activated Human Adipose Tissue–Derived Mesenchymal Stem
Cells Accelerate Cutaneous Wound Healing through Paracrine Mechanisms. Journal
of Investigative Dermatology, v. 131, p. 1559–1567, 2011,
HERSON, M. Processo de cura de feridas. In: MAIO, Mauricio de. Tratado de
medicina estética. São Paulo: Roca, 2004. cap. 35, p.723-729.
ISHII, D.; SCHENK, A.D.; BABA, S.; FAIRCHILD, R.L. Role of TNFα in Early
Chemokine Production and Leukocyte Infiltration into Heart Allografts. Am J
Transplant, v.10, n.1, p. 59-68, 2010.
KAMATA, H., HONDA, S., MAEDA, S., CHANG, L., HIRATA, H., KARIN, M. Reactive
oxygen species promote TNFalpha-induced death and sustained JNK activation by
inhibiting MAP kinase phosphatases. Cell, v. 120, p.: 649–661, 2005.
KANNO, E.; KAWAKAMI, K.; RITSU, M.; ISHII, K.; TANNO, H.; TORIYABE, S. ;
IMAI, Y. ; MARUYAMA, R. ; MASAHIRO, T. Wound healing in skin promoted by
inoculation with Pseudomonas aeruginosa PAO1: The critical role of tumor necrosis
factor-a secreted from infiltrating neutrophils. Wound. Rep. Reg.,v. 19, p. 608–62 ,
2011.
KANNO, E.; KAWAKAMI, K.; MIYAIRI, S.; TANNO, H.; OTOMARU, H.; HATANAKA,
A.; SATO, S.; ISHII, K.; HAYASHI, D.; SHIBUYA, N.; IMAI, Y.; GOTOH, N.;
MARUYAMA, R.; TACHI, M. Neutrophil-derived tumor necrosis factor-a contributes to
acute wound healing promoted by N-(3-oxododecanoyl)-L-homoserine lactone from
Pseudomonas aeruginosa. J. Dermatol. Sci., v.70, p. 130–138, 2013.
78
KAPLAN, A.P.; KUSUMAM, J.; SILVERBERG,M.Pathways for bradykinin formation
and inflammatory disease. J.Allergy Clin.Immunol., v.109 (2), p. 195–209 , 2002
KIEHNE, K; ROZENGURT, E. Synergistic stimulation of DNA synthesis by bradykinin
and vasopressin in Swiss 3T3 cells. J. Cell. Physiol., v.160, p. 502-51, 1994.
KIMURA, A.; KANAZAWA, N.; LI, H.J.; YONEI, N.; YAMAMOTO,Y.; FURUKAWA, F.
Influence of chemical peeling on the skin stress response system. Experimental
Dermatology, v. 21,p. 8–10, 2012
KYRITSIS. N, KIZIL. C, ZOCHER. S, KROEHNE. V, KASLIN.J, FREUDENREICH.
D, ILTZSCHE. A, BRAND. M, Acute inflammation initiates the regenerative response
in the adult zebrafish brain. Science, v.7, p. 1353-6, 2012
LAU, K.; PAUS, R.; TIEDE, S.; DAY, P.; BAYAT, A. Exploring the role of stem cells in
cutaneous wound healing. Experimental Dermatology, v.18, p. 921-933, 2009.
LIANG, C. C.; PARK, A. Y.; GUAN, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and
inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc., v. 2, n. 2, p.
329-333, 2007.
LOO, A.E.K.; HALLIWELL, B. Effects of hydrogen peroxide in a keratinocytefibroblast co-culture model of wound healing, Biochemical and iophysical
Research Communications, v. 423, p.253-258, 2012.
MANDELBAUM, S. H.; DI SANTIS, E. P.; MANDELBAUM, M. H. Cicatrização:
conceitos atuais e recursos auxiliares - Parte I - An Bras. Dermatol., v. 78, n. 4, p.
393-410, jul./ago. 2003.
MARCEAU, F.; HESS, J. F. E.; BACHVAROV, D. R. The B1 receptors for kinins.
Pharmacol .Rev., v. 50, n. 3, p. 357-386, 1998.
MARCEAU, F.; REGOLI, D. Bradykinin receptor ligands: therapeutic perspectives.
Nat. Ver. Drug. Discov., v. 3, n. 10, p. 845-852, 2004.
MATUS, C. E.; EHRENFELD, P.; PAVICIC, F.; SARMIENTO, J. M.; ASTROZA, A.;
SANCHEZ, T.; SALEM, C.; CONCHA, M.; VIDAL, M. A.; GONZALEZ, C. B.;
FIGUEROA,C. D. Activation of kinin B receptor triggers differentiation of cultured
human keratinocytes. Br. J. Dermatol., v. 159, n. 4, p. 792-803, 2008.
MCEACHERN, A. E.; SHELTON, E. R.; BHAKTA, S.; OBERNOLTE, R.; BACH, C.;
ZUPPAN, P.; FUJISAKI, J.; ALDRICH, R. W.; JARNAGIN, K. Expression cloning of a
rat B2 bradykinin receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., v. 88, n. 17, p. 7724-8,
1991.
MCALLISTER, B.S; LEEB-LUNDBERG, F.; OLSON, M. S., Bradykinin inhibition of
EGF- and PDGF-induced DNA synthesis in human fibroblastos. American Journal of
Physiology - Cell Physiology, v.265, p. 477-484,1993
79
MCLEAN, P.; PERRETTI, M.; AHLUWALIA, A. Kinin B receptors and the
cardiovascular system: regulation of expression 1 and function. Cardiovascular Res.
v. 48, p. 194–210, 2000.
MEDZHITOV, R. Origin and physiological roles of inflammation. NATURE, v. 454,
2008.
MENDONÇA, R.J.; COUTINHO-NETTO, J. Aspectos celulares da cicatrização. An
Bras. Dermatol., v. 84, n. 3, p 257-62, 2009.
MENKE, J. G.; BORKOWSKI, J. A.; BIERILO, K. K.; MACNEIL, T.; DERRICK, A. W.;
SCHNECK, K. A.; RANSOM, R. W.; STRADER. C. D.; LINEMEYER, D. L.; HESS, J.
F.Expression cloning of a human B1 bradykinin receptor. J. Biol. Chem., v. 9, n. 34,
p. 21583-6, 1994.
MICHALIK, L.; DESVERGNE, B.; TAN, N. S.; MODAK, S. B; ESCHER, P.;
RIEUSSET, J.; PETERS, J. M.; KAYA, G.; GONZALEZ,F.J.; ZAKANY, J.;
METZGER, D.; CHAMBON, P.; DUBOULE, D.; WAHLI, W. Impaired skin wound
healing in peroxisome proliferator–activated receptor (PPAR)α and PPARβ mutant
mice. The Journal of Cell Biology, v.154, n.4, p. 799–814, 2001.
MONACO,J.L.; LAWRENCE, W.T. Acute wound healing An overview, Clin Plastic
Surg, v. 30 , p. 1-12, 2003.
NESTLE, F.O.; MEGLIO, P.D.; QIN, J.; NICKOLOFF, B.J. Skin immune sentinels in
health and disease. Nature reviews Immunology, v. 9, p. 679-691, 2009.
PARK, J.E.; BARBUL, A.; nderstanding the role of immune regulation in wound
healing, The American Journal of Surgery,v. 187, p.11-16, 2004
PASPARAKIS, M.; HAASE, I.; NESTLE, F. O. Mechanisms regulating skin immunity
and inflammation. Nature Reviews Immunology, 2014.
PATEL, K.V.; SCHREY, M.E Inhibition of DNA synthesis and growth in human breast
stromal cells by bradykinin: evidence for independent roles of B 1 and B2 receptors in
the respective control of cell growth and phospholipid hydrolysis. Cancer Res.,v. 52,
p. 334-340, 1992.
PEREDA-MIRANDA, R.; BAH, M. Biodynamic constituents in the Mexican morning
glories: purgative remedies transcending boundaries. Curr. Top. Med. Chem., v.
3,p.111–131, 2003.
PEREDA-MIRANDA, R.; ROSAS-RAMÍREZ, D.; CASTAÑEDA-GÓMEZ, J.. RESIN
glycosides from the morning glory family. In: Kinghorn, A.D., Falk, H., Kobayashi, J.
(Eds.),Progress in the Chemistry of Natural Products, v. 92. Springer, New York,
p.77–153, 2010.
PHAGOO, S. B., POOLE, S., LEEB-LUNDBERG, L. M. F. Autoregulation of
Bradykinin Receptors: Agonists in the Presence of Interleukin-1b Shift the Repertoire
80
of Receptor Subtypes from B2 to B1 in Human Lung Fibroblasts, molecular
pharmacology, v. 56, p. 325–333 ,1999
PHIPPS, J. A.; FEENER, E. P., The kallikrein–kinin system in diabetic retinopathy:
Lessons for the kidney. Kidney International, v.73, p.1114-1119, 2008.
PIETROVSKI, E. F.; PALUDO, K. S.; MENDES, D. A. G. B.; GUIMARÃES, F. S. F.;
VEIGA, S. S.; BUCHI, D. F.; FONSECA , R. G.; ZAMPRONIO, A. R.; BADER, M.;
PESQUERO, J. B.; FERREIRA, J.; OTUKI, M. F.; CABRINI, D. A. B1 and B2 kinin
receptor participation in hyperproliferative and inflammatory skin processes in mice.
Journal of Dermatological Science, v. 64, p. 23-30, 2011.
POBLETE, M. T.; REYNOLDS, N. J.; FIGUEROA, C. D.; BURTON, J. L.;
MÜLLERESTERL, W.; BHOOLA, K. D. Tissue kallikrein and kininogen in human
sweat glands andpsoriatic skin. Br. J. Dermatol., v. 124, n 3, p. 236-341, 1991.
PROKSCH, E.; BRANDNER, J. M.; JENSEN, J. M. The skin: an indispensable
barrier. Exp. Dermatol., v. 17, n.12, p.1063-1072, 2008.
.
RAJA, SIVAMANI, K , GARCIA, M. S.,ISSEROFF, R. R., Wound reepithelialization:
modulating keratinocyte migration in wound healing. Front Biosci., v. 12, p. 2849–68
,2007
RAMALHO, F.S.; A regeneração hepática e os inibidores da enzima conversora da
angiotensina, Acta Cir. Bras., v.15, 2000
REGOLI, D. E.; BARABÉ, J. Pharmacology of bradykinin and related kinins.
Pharmacol. Rev., v. 32, n. 1, p. 1-46, 1980
ROBERTS, I.L.A.; GULLICK, W.J. Bradykinin receptor number and sensitivity to
ligand stimulation of mitogenesis is increased by expression of a mutant ras
oncogene. J. Cell Sci. v.94, p. 527-535, 1989
ROGERS, K.L; GRICE, I.D., GRIFFITHS, L.R. Inhibition of platelet
aggregation and 5-HT release by extracts of Australian plants used traditionally as
headache treatments. Eur J Pharm Sci., v.9, p. 355-363, 2000.
RUSENHACK, C. Microdermoabrasão. In: BORGES, (Org.). Dermato-Funcional:
modalidades terapêuticas nas disfunções estéticas. São Paulo: Phorte, 2006.
Cap. 4, p. 101-115.
RUSSEL, W.M.S.; BURCH, R.C. The principles of human experimental
technique. London: Methuen; 1959.
81
SABATINI, F.; LUPP, F., PETECCHIA, L.; STEFANO, A.D.; LONGO, A. M.; EVA, A.;
VANNI, C.; PIETER, S.H.; STERK PETER,J.; SORBELLO, V.; FABBRI, L. M.;
ROSSI, G. A.; RICCIARDOLO, F.M. Bradykinin-induce de asthmatic
fibroblast/myofibroblast activities via bradykininB2 receptor and diferente
MAPKpathways. European Journal of Pharmacology, v. 710, p.100-109, 2013.
SAKON, S., XUE, X., TAKEKAWA, M., SASAZUKI, T., OKAZAKI, T., KOJIMA, Y.,
PIAO, J.H., YAGITA, H., OKUMURA, K., DOI, T., NAKANO, H. NF-kappaB inhibits
TNF-induced accumulation of ROS that mediate prolonged MAPK activation and
necrotic cell death. EMBO J. , v.22,p. 3898–3909, 2003
SATISH. L, KATHJU. S. Cellular and Molecular Characteristics of Scarless versus
Fibrotic Wound Healing. Dermatology Research and Practice, v. 2010, p. 1-11,
2010
SCHREMMER-DANNINGER, E.; HEINZ-ERIAN, P.; TOPFER-PETERSEN, E.;
ROSCHER, A. A. Autoradiographic localization and characterization of bradykinin
receptors in human skin. Eur. J. Pharmacol., v. 283,n. 1-3, p. 207-216, 1995.
SCHREMMER-DANNINGER, E.; HERMANN, A.; FINK, E.; FRITZ, H.; ROSCHER,
A. A.Identification and occurrence of mRNAs for components of the kallikrein-kinin
system inhuman skin and in skin diseases. Immunopharmacology , v. 43, n. 2-3, p.
287-291, 1999.
SCHREMMER-DANNINGER, E.; NAIDOO, S.; NEUHOF, C.; VALESKE, K.;
SNYMAN, C.; SANDER, C.; BHOOLA, K. D.; NEUHOF, H. Visualisation of tissue
kallikrein, kininogen and kinin receptors in human skin following trauma and in dermal
diseases. Biol. Chem., v. 385, n. 11, p. 1069-1076, 2004.
SEELY, A.J.E.; PASCUAL, J.L.; CHRISTOU, N.V. Science review: Cell membrane
expression (connectivity) regulates neutrophil delivery, function and clearance.
Critical Care, Ottawa, v. 7, p. 291-307, 2003
SHEIKH, I.A.; KAPLAN, A.P. Mechanism of digestion of bradykinin and
lysylbradykinin (kallidin) in human serum. Role of carboxypeptidase, angiotensinconverting enzyme and determination of final degradation products. Biochemical
Pharmacology. v. 38, n. 6, p. 993-1110, 1989
SINGER. A. J.; CLARK, M. D. Cutaneous wound healing. N. Engl.J .Med., v. 341, p.
738-746, 1999.
SONG, H. Y.; JU, S. M.; GOH, A. R.; KWON, D.; CHOI, S. Y.; PARK, J. Suppression
of TNF-alpha-induced MMP-9 expression by a cell-permeable superoxide dismutase
in keratinocytes. JBMB, v. 44, n. 7, p. 462-467, 2011.
SOUZA, P.P.C.; BRECHTER, A.B.; REIS, R.I.; COSTA, C.A.S.; LUNDBERG, P.;
LERNER, U.H. IL-4 and IL-13 inhibit IL-1b and TNF-α induced kinin B1 and B2
receptors through a STAT6-dependent mechanism. British Journal of
Pharmacology, v. 169, p. 400-412, 2013.
82
STRAUS, D.S; PANG, K.J. Effects of bradykinin on DNA synthesis in resting NIL8
hamster cells and human fibroblasts. Exp. Cell Res. V. 151, p.129-135, 1984.
STEWART, J. M., GERA, L., YORK, E. J., CHAN, D. C., BUNN, P. Bradykinin
antagonists: present progress and future prospects, Immunopharmacology , v. 43,
p. 155–161, 1999
SUGARMAN, B.J., AGGARWAL, B.B., HASS, P.E.,FIGARI, I.S., PALLADINO, M.A.
JR.,SHEPARD, H.M. Recombinant human tumor necrosis factor-alpha: effects on
proliferation of normal and transformed cells in vitro. Science, v. 230, n. 4728, p.943945, 1985
TAYLOR, L.; RICUPERO, D.; JEAN, J.C.; JACKSON, B.A.; NAVARRO, J.; POLGAR,
P. Functional expression of the bradykinin-B 2 receptor cDNA in Chinese hamster
lung CCL39 fibroblasts. Biochem. Biophys. Res. Commun., v.188, p.786-793, 1992.
YAMAMOTO, T.; TSURUTA, J.; KAMBARA, T. Interstitial-tissue localization of
highmolecular-weight kininogen in guinea-pig skin. Biochem Biophys Acta, v. 16,
n. 3, p. 332-342, 1987.
VANCHERI, C; GILI, E; FAILLA, M.; MASTRUZZO, C.; SALINARO, E.T.; LOFURNO,
D.; PISTORIO, M. P.; ROSA, C.; CARUSO, M.; CRIMI, N. Bradykinin differentiates
human lung fibroblasts to a myofibroblast phenotype via the B2 receptor. J. Allergy.
Clin. Immunol., v.116, p. 1242-8, 2005.
VIDAL, M. A.; ASTROZA, A.; MATUS, C. E.; EHRENFELD, P.; PAVICIC, F.;
SANCHEZ, T.; SALEM, C.; FIGUEROA, J.; CONCHA, M.; GONZALEZ, C. B.;
FIGUEROA, C. D. Kinin B2 Receptor-Coupled Signal Transduction in Human
Cultured Keratinocytes. J. Invest. Dermatol., v. 124, n. 1, p. 178-186, 2005.
VOLOSHENYUK, T.G,HART, A.D.,KHOUTOROVA, E.,GARDNER, J.D. TNF-α
increases cardiac fibroblast lysyl oxidase expression through TGF-β and PI3Kinase
signaling pathways. Biochem Biophys Res Commun, v. 413, p.370-375, 2011
WALLACH, D., ARUMUGAM, T. U., BOLDIN, M. P., CANTARELLA, G., GANESH,K.
A., GOLTSEV, Y., GONCHAROV, T. M, KOVALENKO, A. V., RAJPUT ,A.,
VARFOLOMEEV, E., ZHANG, S. Q. How are the regulators regulated ? The search
for mechanisms that impose specicity on induction of cell death and NF-kB activation
by members of the TNF/NGF receptor family. Arthritis Res., v. 4, p. 189-196, 2002
WALSH, D.A., FAN, T.D. Bradykinin as a Growth Factor. In: Farme, S. G.The Kinin
System. Elsevier Ltd.,1997.p 301-314.
WIERNAS,K., DAVIS,L.T., GRIFFIN,B.W., SHARIF, N.A. Effects of bradykinin on
signal transduction, cell proliferation, and cytokine, prostaglandin E2 and
collagenase-1 release from human corneal epithelial cells. British Journal of
Pharmacology, v. 123, p. 1127-1137, 1998,
83
YADAV, K. S.; YADAV, N. P.; RAWAT, B.; RAI, V. K.; SHANKER, K.; RAO, C. V. An
Assessment of Wound Healing Potential of Argyreia speciosa Leaves. Hindawi
Publishing Corporation. The Scientific World Journal, 2014.
YUSSOF, S. M., OMAR, E., PAI, D., SOOD, S. Cellular events and biomarkers of
wound healing. Indian Journal of Plastic Surgery. V.45 .p.220, 2012