i
Universidade Camilo Castelo Branco
Instituto de Engenharia Biomédica
ANTONIO CARLOS BUENO FILHO
ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DE HEMOGLOBINAS A
PARTIR DE AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES COM DOENÇA
FACILFORME
ANALYSIS OF RAMAN SPECTROSCOPY HEMOGLOBINS FROM BLOOD
SAMPLES FROM PATIENTS WITH SICKLE CELL DISEASE
São José dos Campos, SP
2014
ii
Antonio Carlos Bueno Filho
ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DE HEMOGLOBINAS A
PARTIR DE AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES COM DOENÇA
FACILFORME
Orientadora: Profa. Dra. Adriana Barrinha Fernandes Moretti
Co-orientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Jr.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da
Universidade Camilo Castelo Branco, como complementação dos créditos necessários para obtenção
do título de Mestre em Bioengenharia.
São José dos Campos, SP
2014
iii
Ficha Catalográfica
iv
v
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho a Deus em primeiro lugar.
In Memoriam de Ana Maria Teixeira Ribeiro, minha mãe que tinha um sonho ter um
filho mestre, mãe conseguimos e ao meu Pai.
Aos meus filhos Pedro Davi e Gabriel Antonio e minha esposa Luciana Regina, que
participaram indiretamente da construção deste trabalho.
Aos meus amigos Eduardo Luiz da Silva e Júlio Cesar Mussato, pelos momentos
que passamos juntos nessa caminhada.
E a todos que tiveram participações direta ou indiretamente para a realização deste
trabalho.
E aos voluntários desta pesquisa.
vi
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Profa. Dra. Adriana Barrinha que acreditou neste projeto e em
mim e que lutou comigo durante a realização deste trabalho;
Ao Prof. Dr. Landulfo, pela sua ajuda e por me ensinar a espectroscopia Raman e no
auxílio na interpretação dos espectros, sem ele isso não seria possível e pela sua
compreensão durante a realização deste trabalho;
Agradeço a médica Ana Leticia Sant’Anna Yannai, por acreditar na pesquisa e em
mim, e abrir as portas da Unidade de Transfusão e Coleta de Sinop/MT e de seus
pacientes que gentilmente sempre me atendeu e contribuiu com sugestões
importantes no trabalho;
Agradeço a todos meus professores do curso de Mestrado em Bioengenharia que
com suas experiências e conhecimentos agregaram em mim valores científicos e
profissionais.
Este projeto teve o apoio parcial da FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado de São Paulo, processo nº 2009/01788-5.
vii
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original.”
Albert Einstein
viii
ANÁLISE POR ESPECTROSCOPIA RAMAN DE HEMOGLOBINAS A
PARTIR DE AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES COM
DOENÇA FACILFORME
RESUMO
A espectroscopia de Raman vem sendo utilizada como uma ferramenta importante
no diagnóstico de doenças com alguma dificuldade em se ter um diagnóstico rápido
e preciso. Dentre estas doenças está a falciforme que é uma moléstia que provoca
em seu portador uma anemia grave que surge logo na primeira infância. O
diagnóstico precoce é importante, pois, esta doença provoca várias complicações
patológicas dentre elas a vaso-oclusão, anemia hemolítica e outras doenças
relacionadas como retinopatias, infecções e doença Cardiovascular. Neste trabalho
constatou que a espectroscopia de Raman tem capacidade em discriminar a
presença da hemoglobina S da hemoglobina A com grande precisão e sensibilidade.
Isto se deve pela discriminação dos espectros médios da valina (882 cm-1 e
1373 cm-1) e do ácido glutâmico (1547 cm-1 e 1622 cm-1) que está presente na
hemoglobina S (Val) e na hemoglobina A (Glut), que é discriminado pelo Raman
demonstrando que alterações sutis na cadeia polipeptídica é identificada. Por outro
lado, o procedimento técnico para a realização da espectroscopia de Raman não
tem necessidade de protocolos complexos e com alto custo para realizar a pesquisa
da hemoglobina, pode ser utilizado procedimento técnico simples como a hemólise e
à partir dai a realização da espectroscopia com a mesma resposta dos
procedimentos complexos.
Palavras-chave: Ácido glutâmico, valina, espectroscopia de Raman, hemoglobina
S, anemias.
ix
ANALYSIS OF RAMAN SPECTROSCOPY HEMOGLOBINS FROM
BLOOD SAMPLES FROM PATIENTS WITH SICKLE CELL DISEASE
ABSTRACT
Raman spectroscopy has been used as an important tool in the diagnosis of
diseases with some difficulty in having a quick and accurate diagnosis. Among these
diseases are sickle cell is a disease that causes its bearer in severe anemia that
arises immediately in infancy. Early diagnosis is important as this disease causes
various pathological complications among them vaso-occlusion hemolytic anemia
and other diseases such as retinopathy, infections and cardiovascular disease. In
this work we found that Raman spectroscopy is able to discriminate the presence of
hemoglobin hemoglobin S with high precision and sensitivity. This is due to the
breakdown of the average spectra of valine (882 cm-1 and 1373 cm-1) and glutamic
acid (1547 cm-1 and 1622 cm-1) which is present in hemoglobin S (Val) and
hemoglobin (Glut) which is broken down by Raman demonstrating that subtle
changes in the polypeptide chain is identified. On the other hand, the technical
procedure for carrying out Raman spectroscopy has no need for complex protocols
and costly to perform the search of hemoglobin, can be used simple technical
procedure as hemolysis and thereafter performing spectroscopy with the response of
the same complex procedures.
Keywords: Glutamic acid, valine, Raman spectroscopy, hemoglobin S, anemias.
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa genômico dos genes da alfa e beta
globinas..............................................................................................................
22
Figura 2: Estrutura molecular da hemoglobina A e da hemoglobina
S.........................................................................................................................
25
Figura 3: Espectro do Ácido Glutâmico..............................................................
38
Figura 4: Espectro da Valina..............................................................................
38
Figura 5: Eletroforese de hemoglobina (Hb AA, HbSS, HbSA, HbSC)..............
40
Figura 6: Espectros médios da HbA, HbS e EDTA............................................
41
Figura 7: Intensidades médias e desvio padrão dos
scores................................................................................................................
Figura 8: Plotagem binária das componentes principais PC1 e
PC2....................................................................................................................
42
43
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Genes responsáveis pela produção das hemoglobinas nas
diferentes fases da vida humana ......................................................................
21
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALA
- Ácido Delta Levolínico
CHCM
- Concentração de hemoglobina Corpuscular Media
EDTA
- Etileno Diamino Tetracético
EPI
- Equipamento de Proteção Individual
EPC
- Equipamento de Proteção Coletiva
GAG
- Guanina, Adenina, Guanina
GTG
- Guanina, Timina, Guanina
GLU
- Ácido Glutâmico
HbA
- Hemoglobina A
HbS
- Hemoglobina S
HbSA
- Hemoglobina AS
HbSS
- Hemoglobina SS
HbSC
- Hemoglobina SC
HS
- Sítio Hipersensível
IEF
- Focagem Isoelétrica
LCR
- Região Controladora do Gene
PHHF
- Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal
PCA
- Análise do Componente Principal
pH
- Potencial Hidrogeniônico
RPM
- Rotação por Minuto
SC
- Hemoglobina C
SD
- Hemoglobina D
SOarab - Hemoglobina SO arab
SNP
- Polimorfismo de Único Nucleotídeo
TEB
- Tris-EDTA-Borato
TCLE
- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
UCT
- Unidade de Coleta e Transfusão
v
- Vibração
xiii
LISTA DE SÍMBOLOS
α
- Alfa
β
- Beta
0
β
- Talassemia heterozigoto
β+
- Talassemia homozigoto
Da
- Daltons
Kb
- Quilobase
xiv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................
15
1.1. Objetivo geral.............................................................................................
17
1.2. Objetivos específicos.................................................................................
17
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA............................................................................
18
2.1. Fisiologia da Hemoglobina.........................................................................
18
2.1.1. Transporte de oxigênio.........................................................................
19
2.2. Origem e controle genético da hemoglobina..............................................
19
2.2.1. Estrutura molecular da hemoglobina normal........................................
23
2.2.2. Hemoglobinas anormais ou variantes..................................................
24
2.2.3. Doença falciforme................................................................................
26
2.3. Diagnóstico laboratorial..............................................................................
29
2.3.1. Eletroforese..........................................................................................
29
2.3.2. Espectroscopia Raman........................................................................
32
3. MATERIAL E MÉTODO...................................................................................
36
3.1. Amostras biológicas...................................................................................
36
3.2. Protocolo de hemólise................................................................................
37
3.3. Eletroforese................................................................................................
37
3.4. Análise espectroscópica.............................................................................
37
4. RESULTADOS.................................................................................................
40
5. DISCUSSÃO....................................................................................................
44
6. CONCLUSÃO..................................................................................................
50
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................................
51
ANEXO A - Termo de Consentimento Livre e esclarecido – TCLE.....................
57
ANEXO B – Protocolo de Anamnese...................................................................
61
15
1. INTRODUÇÃO
As anemias hereditárias como a anemia falciforme e outras formas de anemias
como a talassemia afetam 12 a 15% da população humana que são portadores e
apresentam quadros assintomáticos da doença (LEONELI et al., 2000).
A anemia falciforme é a doença hereditária monogênica mais comum do
Brasil. A causa da doença é uma mutação de ponto (GAG->GTG) no gene da
globina beta da hemoglobina, originando uma hemoglobina anormal, denominada
hemoglobina S (HbS), ao invés da hemoglobina normal denominada hemoglobina A
(HbA). Esta mutação leva à substituição de um ácido glutâmico por uma valina na
posição 6 da cadeia beta, com consequente modificação físico-química na molécula
da hemoglobina. Em determinadas situações, estas moléculas podem sofrer
polimerização, com falcização das hemácias, ocasionando encurtamento da vida
média dos glóbulos vermelhos, fenômenos de vaso-oclusão e episódios de dor e
lesão de órgãos.
No Brasil, as doenças falciformes distribuem-se heterogeneamente, sendo
mais frequente onde a proporção de antepassados negros da população é maior
(nordeste). Estimativas, com base na prevalência, permitem estimar a existência de
mais de 2 milhões de portadores do gene da HbS, no Brasil, mais de 8.000 afetados
com a forma homozigótica (HbSS). Estima-se o nascimento de 700 - 1000 novos
casos anuais de doenças falciformes no país. Portanto, as doenças falciformes são
um problema de saúde pública no Brasil. (ZAGO, 2001).
De modo geral, além da anemia crônica, as diferentes formas de doenças
falciformes caracterizam-se por numerosas complicações que podem afetar quase
todos os órgãos e sistemas, com expressiva morbidade, redução da capacidade de
trabalho e da expectativa de vida. Entretanto, diferente das outras anemias
hemolíticas, pacientes com doenças falciformes não costumam apresentar
esplenomegalia porque, repetidos episódios de vasooclusão determinam fibrose e
atrofia do baço. A destruição do baço é a principal responsável pela suscetibilidade
aumentada a infecções graves (septicemias). Sendo estas infecções a 1ª causa de
morte em crianças menores de 5 anos. Como este estado de asplenia funcional
pode ser documentado desde os três meses de idade, o diagnóstico precoce e o
tratamento adequado são responsáveis pela redução expressiva da morbidade e
16
mortalidade (EATON; HOFRICHTER, 1981; EATON; HOFRICHTER, 1990; MACKIE;
HOCHMUTH, 1990).
Atualmente, o diagnóstico da anemia falciforme é realizado por meio da
análise do sangue e por sinais clínicos da doença.
Na prática laboratorial, a
pesquisa de hemoglobina S (HbS) que identifica a anemia falciforme, ocorre por
alguns métodos de identificação para o diagnóstico laboratorial. Os principais
métodos utilizados em laboratório clínico de rotina para a pesquisa de HbS são:
Eletroforese de Hemoglobina, Turvação com Ditionito de Sódio em tubo, Exame
microscópio das hemácias falciforme após incubação com metabissulfito de sódio
(RAPPAPORT, 1990).
O diagnóstico das hemoglobinopatias nem sempre é simples e rápido devido
à dificuldade na identificação das hemoglobinas anormais pelos métodos
convencionais. Esta dificuldade passa por alguns fatores que influenciam
diretamente no resultado final como, por exemplo, a falta de conhecimento técnico
cientifica do profissional, a falta de dados clínicos não fornecidos e a imperícia em
interpretar o eritrograma (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 2007).
A Espectroscopia Raman é definida como estudo do espectro obtido pela
interação da radiação eletromagnética com a matéria, sendo um dos seus principais
objetivos, a determinação dos níveis de energia de átomos ou moléculas. Esta
técnica de análise utiliza a radiação eletromagnética para testar o comportamento
vibracional das moléculas, observando-se a absorção ou espalhamento dessa
radiação. Essa inovação vem sendo utilizada com sucesso no diagnóstico de
patologias em materiais biológicos, permitindo a caracterização bioquímica da
amostra. O espectro Raman proporciona informação química e estrutural de
compostos orgânicos e inorgânicos, permitindo assim sua identificação em poucos
segundos, com pouca ou sem a necessidade de preparação da amostra (SHAPIRO
et al., 2011).
Em suma, como a hemoglobina é uma biomolécula e apresenta à capacidade
de absorver luz, ela também apresenta uma faixa e perfil espectral característicos da
molécula, se ocorrer uma pequena mudança nessa conformação haverá uma
alteração do perfil espectral o que permitirá a identificação da hemoglobina variante
(HbS). Deste modo, pretende-se comparar os espectros obtidos a partir da
Espectroscopia Raman com o método convencional de identificação (eletroforese). É
de extrema importância que novas tecnologias sejam empregadas no diagnóstico
17
das hemoglobinopatias, com o intuito de tornar o diagnóstico mais rápido e preciso,
para que os pacientes recebam o tratamento um adequado e precoce, com intuito de
evitar ou minimizar as complicações decorrentes desta patologia. Neste sentido, o
presente estudo pretende utilizar a espectroscopia Raman como ferramenta na
identificação de hemoglobina variante (HbS).
1.1. Objetivo geral
- Analisar amostras de sangue provenientes de pacientes portadores de doenças
falciformes através da espectroscopia Raman com o intuito de identificar a HbS, que
tem uma papel crucial na determinação do quadro clínico desta patologia.
1.2. Objetivos específicos
- Analisar e identificar as diferenças espectrais obtidos do grupo controle e do grupo
de
pacientes
portadores
da
doença
falciforme
que
foram
previamente
diagnosticados através do método convencional de identificação de hemoglobina
(eletroforese).
- Utilizar a Análise dos Componentes Principais (PCA) para fazer a classificação e a
discriminação das hemoglobinas estudadas.
18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Fisiologia da hemoglobina
Para que ocorra a síntese de hemoglobina é necessário haver dois fatores
importantes na fase da eritrogênese medular, o fator hormonal (eritropoietina) e o
nutricional (ferro, vitamina B12 e folato), para a maturação, proliferação e
diferenciação normal das hemácias e com ação direta também na síntese da
hemoglobina (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004). A eritropoietina (EPO) tem ação
na hemoglobinização dos eritroblastos e o ferro está diretamente envolvido na
síntese da cadeia heme (NAOUM, 2012). Com a ação dos fatores hormonais e
nutricionais e o controle genético pelos cromossomos 11 e 16 temos a produção e
concentração adequada de hemoglobinas funcionais (MOHANDAS; EVANS, 1989).
A hemoglobina é uma proteína que tem característica de promover a cor
vermelha nos eritrócitos, é obrigatoriamente uma molécula intracelular nos
mamíferos
e
tem
seu
peso
molecular
aproximadamente
de
64.500
Da
(VERRASTRO; LORENZI; NETO, 2005). Além disso, possui a capacidade de
carrear gases como o oxigênio dos pulmões aos tecidos e o monóxido de carbono
dos tecidos aos pulmões (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004). Esta cinética de
transporte tem papel fundamental na manutenção da vida, pois, o oxigênio é vital
para a função celular dos seres humanos para que possa produzir energia a partir
da oxidação dos carboidratos (DAVID; COX, 2004).
Para que os tecidos sejam oxigenados adequadamente é necessário que haja
concentração de hemoglobina adequada no interior dos eritrócitos e sua estrutura
molecular apresente dois pares de cadeias globínicas e a cadeia heme.
No sangue arterial oxigenado encontramos aproximadamente cerca de 19 a 20 mL
de oxigênio em combinação com a hemoglobina e 0,3 mL de oxigênio dissolvido no
plasma. Cada grama de hemoglobina pode carrear 1,34 mL de oxigênio; portanto,
16g de hemoglobina presentes em 1dl de sangue transporta 19 a 20 mL de oxigênio
(LORENZI et al., 2003).
19
2.1.1. Transporte de oxigênio
Nos alvéolos pulmonares o oxigênio se liga fortemente com a hemoglobina para que
possa ser transportado para os tecidos. Nos pulmões a hemoglobina fica saturada
em 97% e a saturação do oxigênio neste local é de 100 mmHg (LORENZI et al.,
2003).
O oxigênio dissolvido no sangue circulante tem concentração muito pequena
que acarretaria uma dificuldade dos tecidos serem supridos por este gás, assim, a
hemoglobina torna possível a oxigenação dos tecidos pela ação de transporte do
oxigênio mesmo concentração baixa (LORENZI et al., 2003). Desta maneira, a
hemoglobina é imprescindível para a homeostasia dos tecidos.
Para o transporte do oxigênio pelas hemoglobinas existem fatores que são
importantes para que haja eficiência neste trabalho de troca gasosa pelas hemácias.
É necessário a presença de fatores físicos presentes como a pressão do gás tanto
nos alvéolos quanto nos tecidos, temperatura corporal e potencial hidrogeniônico
(pH) que se sofrem alterações mínimas dificultam o transporte de oxigênio ou
aumentam a oferta deste gás nos tecidos. Estes fenômenos são regulados pela
curva de Bohr que define a saturação de oxigênio no organismo (LORENZI et al.,
2003).
Além destes fenômenos físicos a estrutura molecular da hemoglobina também
tem papel importante para o transporte do oxigênio, pois, é ela que promove a
ligação entre a proteína transportadora com o oxigênio. Qualquer mudança na sua
estrutura pode provocar uma deficiência nas trocas gasosas.
A estrutura molecular da hemoglobina é importante para que haja a ligação
com o oxigênio por apresentar sítios de ligação na cadeia Heme (ZAGO; FALCÃO;
PASQUINI, 2004).
2.2. Origem e controle genético da hemoglobina
A hemoglobina tem sua origem nos eritroblasto que são células jovens que estão no
interior da medula óssea na região das trabéculas ósseas dos ossos esponjosos
(VERRASTRO; LORENZI; NETO, 2005).
O eritroblasto sofre ação de fatores hormonais (EPO) que vão induzir sua
maturação no interior da medula óssea até chegar à célula madura e funcional o
20
eritrócito (RAPAPORT, 1990). Durante o processo de maturação do eritrócito ocorre
a síntese da hemoglobina em todas as etapas da diferenciação do eritrócito (ZAGO;
FALCÃO; PASQUINI, 2004). Para a síntese da hemoglobina é necessário que
ocorra a produção de duas cadeias que constituem a hemoglobina que é produzida
a partir de vias metabólicas complexas que vão originar as moléculas estruturais da
hemoglobina (VOET et al., 2006).
Para a formação do anel tetrapirrólico é necessário que ocorram reações
químicas que são coordenadas por enzimas específicas que regulam a formação do
anel tetrapirrólico. Para que haja a produção normal da cadeia heme é necessário a
ação de 8 enzimas de um ciclo metabólico conhecido como via da porfiria. Nesta via
que ocorre a formação do anel tetraprirrólico e a ligação do ferro a esta estrutura
tetraédrica (VOET et al., 2006).
Na via da porfiria estão presentes enzimas que irão catalisar as reações
químicas, são as seguintes em ordem de ação na via da porfiria: (1) ALA-sintetase;
(2) ALA-deidratase; (3) porfobilinogênio-deaminase; (4) urobilinogênio-sintetase; (5)
uroporfirinogênio-decarboxilase;
(6)
coproporfirinogênio-oxidase;
(7)
protoporfirinogênio-oxidase; (8) ferroquelatase (LORENZI et al., 2003). A primeira
enzima e as três últimas enzimas estão localizadas no citoplasma dos eritroblastos e
as demais na mitocôndria (LORENZI et al., 2003).
A outra cadeia que constitui a hemoglobina é a cadeia globínica que é a parte
proteica da hemoglobina que é produzida também no eritroblasto. Sua síntese segue
uma sequência complexa que envolve sete genes que modelam a sua constituição
que tem papel importante na formação da hemoglobina. Sua formação ocorre nos
ribossomos e formam monômeros que durante o processo de sua síntese vão
criando dímeros e depois um tetrâmero (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004).
O tetrâmero é formado por dois pares de cadeias globínicas que enovelam e
estão ligadas por histidina com a cadeia heme. Os genes envolvidos na síntese dos
pares de cadeias globínicas são os α-símile e o gene não-alfa. O par de cadeias
globínica α-símile têm em sua constituição 141 aminoácidos, enquanto as cadeias
não-α têm em sua estrutura 146 aminoácidos (BONINI-DOMINGOS, 1993; ZAGO;
FALCÃO; PASQUINI, 2004).
Na Tabela 1 é apresentada cada fase do desenvolvimento uterino e a
ativação do gene específico para a produção da hemoglobina correspondente.
21
Tabela1: Genes responsáveis pela produção das hemoglobinas nas diferentes fases da vida
humana.
Nome da hemoglobina
Estrutura da
Subunidade
Tempo de expressão
Hemoglobina Portland
Hemoglobina Gower I
Hemoglobina de
Gower II
Hemoglobina Fetal
ζ2γ2
ζ2ε2
α2ε2
Vida embrionária
Vida embrionária
Vida embrionária
Vida fetal*
Hemoglobina A2
α2Gγ2
α2Aγ2
α2δ2
Hemoglobina A
α2β2
Idade adulta (hemoglobina
adulta menor)
Idade adulta (principal
hemoglobina adulta)
*Produzida em pequenas quantidades numa subpopulação limitada de células (células fetais) em
adultos.
Fonte: Adaptado de GALIZA NETO; PITOMBEIRA (2003).
Para a produção da hemoglobina humana é necessário que ocorra a ativação
de dois genes importantes que controlam a formação e produção das cadeias
globínicas. Esses genes que sintetizam a cadeia globínica são formados por grupos
de genes (clusters) dos cromossomos 11 e 16 que regulam a produção da cadeia
globínica (NAOUM, 2012).
O grupo de genes do cromossomo 11 e 16 seguem uma ordem cronológica
em que são expressos, desta maneira é sintetizada a hemoglobina nos períodos
embrionário, fetal e adulto. Sendo assim, há uma sequencia no sentido da leitura
dos genes nos cromossomos no sentido das sequencias intensificadoras nesta
região (NAOUM, 1984; VERRASTRO; LORENZI; NETO, 2005).
Para que ocorra a síntese adequada da hemoglobina é necessária a presença
de sequencia de nucleotídeos que estão agrupados em 3 blocos formando os éxons
(intensificador) que são responsáveis pela produção do RNA mensageiro e
interpostos a eles os íntrons a cada duas sequencias de éxons que inibem a
produção de RNA mensageiro (DAVID; COX, 2004; VOET et al., 2006).
No braço curto do cromossomo 16, tem um segmento de DNA de 35 kb, o
gene Zeta (ζ) que codificam a cadeia zeta globínica, dois pseudogenes e os genes
Alfa 1 e Alfa 2 que podem ter sido originados da duplicação gênica (LORENZI et al.,
2003). Por outro lado, o cromossomo 11 tem uma região de aproximadamente de 60
kb, que estão localizados o complexo de genes Beta, onde se tem o sentido 5´→3´,
22
o gene Épsilon (ε), Gama glicina, Gama adenina, um pseudogenes e os genes Delta
(δ) e Beta (β) (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004).
Existem elementos promotores que agem em cis e estão localizados no final
5´ de cada um dos genes da globina. Assim, há duas sequencias reguladoras na
região dos clusters, tanto no gene Beta e Alfa. Estão regiões são chamadas de LCR
(região controladora do gene) encontrada no gene Beta e marcado por sítios
hipersensíveis à DNAse; e o HS (sítio hipersensível) no clusters Alfa que é similar ao
LCR (VOET et al., 2006).
Figura 1: Mapa genômico dos genes da alfa e beta globinas. Cada gene de globina contendo três
exons e dois introns. (a) O gene da α globina, localizado no cromossomo 16 (16p13.3). Dos sete
genes mostrados apenas três são expressos em níveis fisiológicos significantes, o gene ζ2, α1 e α2.
Os demais genes são pseudogenes ou genes que não são expressos significativamente. A estrutura
do gene α2 é mostrada na figura, indicando os três exons, os dois introns e regiões 5’ UTR e 3’ UTR.
(b) O locus β do cromossomo 11 (11p15.4) com os genes ε, G-gama, Agama, delta e β. O gene da β
globina, mostrado em destaque para evidenciar a sua estrutura. Assim como o gene α2, o gene β
também possui três exons, dois introns, e regiões comuns a todos os genes de globinas.
Fonte: Clark e Thein (2004).
23
2.1. Estrutura molecular da hemoglobina normal
Para manter a estabilidade da cadeia globínica após sua síntese, os pares de
globina se combinam rapidamente entre si e com a cadeia heme para formar um
tetrâmero de globina. A hemoglobina normal (embrionária, fetal e do adulto) tem
como estrutura proteica dímeros de protômeros αβ que formam uma estrutura
quartenária α2β2 constituindo uma proteína tetramérica (DAVID; COX, 2004).
Sendo assim, a hemoglobina é formada por quatro cadeias globínicas (α2β2)
ligadas a um grupo Heme (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004). Todas as
hemoglobinas das fases embrionária, fetal e do adulto, são constituídas por 574
aminoácidos, sendo que 282 aminoácidos constituem o par de cadeias globínicas
alfa e 292 aminoácidos que formam o par de cadeias globina betas. Assim, temos
que na cadeia globina alfa temos 141 aminoácidos e na cadeia globina beta se
encontra 146 aminoácidos (NAOUM, 2012).
A estrutura geométrica tetraédrica da hemoglobina se deve pela similaridade
dos protômeros αβ que apresentam uma rotação de 180º de segunda ordem que
fazem com que se coincidem, e suas subunidades alfa e beta tem estruturas
semelhantes
que
se
aproximam
por
uma
rotação
de
segunda
ordem
(pseudossimetria) cuja rotação ocorre no eixo perpendicular da rotação de segunda
ordem exata. Deste modo, a hemoglobina possui simetria C2 exata e simetria
pseudo-D2 (estruturas com simetria D2 possuem simetria rotacional de um
tetraedro) (VOET et al., 2006).
Para que as hemoglobinas tenham estabilidade estrutural é necessário que
haja arranjo na composição entre as globinas alfa e beta. A forma globular da
hemoglobina se deve pela presença de extensa disposição helicoidal dos
polipeptídios que constituem as globinas alfa e beta (NAOUM, 2012).
Em 1959, Perutz e Kendrew realizaram experimentos com proteínas
utilizando o método de cristalografia por meio da difração de raios X, descobriram
particularidades fisico-químicas da hemoglobina que faz com que ela tenha estrutura
enovelada (NAOUM, 2012; VOET et al., 2006).
Essa forma tetramérica só existe pelas ligações físico-químicas com
diferentes intensidades que originam a movimentação da molécula durante a ligação
com o oxigênio. As ligações entre as moléculas de hemoglobina são as: covalentes
24
e iônicas, pontes de hidrogênio, forças de Van der Waals e interações hidrofóbicas
(RAPAPORT, 1990).
Para que a hemoglobina possa ter sua atividade fisiológica adequada é
necessário ligações intermoleculares entre os pares de cadeias globínicas alfa e
beta, assim, denominou-se a disposição do tetrâmero da seguinte estrutura química:
cadeia alfa (α1 e α2) e cadeia beta (β1 e β2) para que possa ter um entendimento
adequado da estrutura da hemoglobina (VOET et al., 2006; DAVID; COX, 2004).
No tetrâmero a interação molecular entre as cadeias alfa e beta ocorrem em
toda a extensão da molécula realizando ligações químicas entre os pares α1β2 e α2β1
que possibilitam o deslizamento da molécula quando ocorre a ligação com o
oxigênio.
Com os estudos mais recentes, descobriu que a molécula de hemoglobina
apresenta duas regiões específicas a interna e a externa na globina alfa e na globina
beta. Na região externa é mais extensa encontramos aminoácidos não polares e
hidrofóbicos localizados em 75% da molécula, além dos helicoides e aminoácidos
que envolvem o grupo heme. Da mesma forma, a região interna é menos extensa e
composta por aminoácidos polares e hidrofílicos que estão localizados nas partes
não helicoidais da molécula (NAOUM, 2012).
2.2.2. Hemoglobinas anormais ou variantes
O gene falciforme é resultante da mutação pontual na cadeia Beta globina (β6)
causada pela substituição do aminoácido ácido glutâmico na sexta posição da
cadeia pela valina (β6glu→val) (LORENZ et al., 2003; ZAGO; FALCÃO; PASQUINI,
2004; VERRASTRO; LORENZI; NETO, 2005). Esta substituição (mutação) de
aminoácidos na cadeia beta globina tem como consequência a substituição de uma
única base nitrogenada no DNA, conhecido como polimorfismo de único nucleotídeo
(SNP) (JUSZCZAK; SAMUNI; FRIEDMAN, 2005).
Na mutação da HbS ocorre a substituição de adenina por timina na
composição do
sexto códon do gene da beta globina humana (GAG→GTG)
promovendo assim uma introdução de valina no lugar do ácido glutâmico,
propiciando a polimerização de Hemoglobina S quando estão desoxigenada
(EATON;
HOFRICHTER,
HOCHMUTH, 1990).
1987;
EATON;
HOFRICHTER,
1990;
MACKIE;
25
Figura 2: Estrutura Molecular da Hemoglobina A e da Hemoglobina S.
Fonte: http://www.teliga.net/2011/05/aspectos-gerais-das-proteinas.html
A presença da HbS em indivíduos é conhecida como anemia falciforme é e
caracterizada pela presença de alelos S (HbSS) que caracteriza a homozigose.
Como ocorre variações na síntese de hemoglobina S pode aparecer indivíduos com
característica de heterozigose (HbAS) que não manifestam formas clínicas e são
conhecidos como portadores do traço falcêmico (NAOUM, 2012; LORENZI et al.,
2003).
As hemoglobinas anormais ou variantes surgem pela alteração da cadeia
polipeptídica da globina promovendo perturbação no transporte do oxigênio. As
alterações presentes na hemoglobina ocorrem por mutações nos genes alfa, beta,
gama ou delta (RAPAPORT, 1990).
Estas modificações presentes nas diferentes cadeias globínicas envolvem a
síntese estrutural da cadeia polipeptídica na sequência qualitativa dos aminoácidos.
Também podendo ter alterações nas moléculas e enzimas que tomar parte da
síntese da cadeia heme que são mais raras de ocorrerem (ZAGO; FALCÃO;
PASQUINI, 2004).
Segundo Lorenzi et al. (2003), os defeitos hereditários da hemoglobina podem
ser agrupados em três tipos: mutações genéticas ocasionam alteração na estrutura
das cadeias polipeptídicas, defeito qualitativo; por diminuição ou ausência de
produção de uma ou de mais de uma cadeia polipeptídeos, defeito de quantidade de
síntese das cadeias; resulta na persistência de síntese da hemoglobina fetal durante
a vida adulta, chamada de persistência hereditária da hemoglobina fetal.
São muitas as hemoglobinas anormais ou variantes que apresentam
alterações estruturais na cadeia globínica com modificação na sequência de
aminoácidos ocorrida pela mutação dos genes alfa e beta (não-alfa). Dentre as
26
inúmeras hemoglobinas anormais presentes no homem, a hemoglobina S causa
alterações fisiopatológicas importante no homem que têm troca de aminoácidos na
sua cadeia globínica que produz um defeito qualitativo na estrutura química da
hemoglobina (ZAGO; FALCÃO; PASQUINI, 2004).
2.2.3. Doença falciforme
Doença Falciforme é um termo genérico usado para determinar um grupo de
alterações genéticas caracterizadas pelo predomínio da hemoglobina S (HbS).
Essas alterações incluem a anemia Falciforme (Hb SS), as duplas heterozigoses, ou
seja, as associações de HbS com outras variantes de hemoglobinas, tais como, Hb
D, Hb C, e as interações com talassemias (Hb S/ß° talassemia, Hb S/ß+ talassemia,
Hb S/α talassemia). As síndromes falciformes incluem ainda o traço falciforme
(HbAS) e a anemia falciforme associada à persistência hereditária de hemoglobina
fetal (HbS/PHHF). Apesar das particularidades que as distinguem e de graus
variados de gravidade, todas estas doenças tem um espectro epidemiológico e de
manifestações clínicas e hematológicas superponíveis (ZAGO, 2001).
Normalmente, quanto maior a quantidade de HbS, mais grave é a doença. Os
pacientes homozigóticos para HbS têm quadro clínico, em geral, mais grave do que
os pacientes com hemoglobinopatia SC, SD, SOarab, entre outros. A associação
com persistência hereditária de hemoglobina fetal confere melhor prognóstico à
doença. Em geral, os pais são portadores assintomáticos de um único gene afetado
(heterozigotos), produzindo HbA e HbS (AS), transmitindo cada um deles o gene
alterado para a criança, que assim recebe o gene anormal em dose dupla
(homozigoto SS) (ZAGO, 2001).
A doença originou-se na África e foi trazida às Américas pela imigração
forçada dos escravos. No Brasil, distribui-se heterogeneamente, sendo mais
frequente onde a proporção de antepassados negros da população é maior
(nordeste). Além da África e Américas, é hoje encontrada em toda a Europa e em
grandes regiões da Ásia. No Brasil, a doença é predominante entre negros e pardos,
também ocorrendo entre brancos. Estimativas, com base na prevalência, permitem
estimar a existência de mais de 2 milhões de portadores do gene da HbS, no Brasil,
mais de 8.000 afetados com a forma homozigótica (HbSS). Estima-se o nascimento
de 700-1.000 novos casos anuais de doenças falciformes no país. Portanto, as
27
doenças falciformes são um problema de saúde pública no Brasil (FILHO et. al,1988;
BONINI-DOMINGOS et al., 2000; AOUM, 1984).
É caracterizada pela substituição de adenina por timina (GAG->GTG),
codificando valina ao invés de ácido glutâmico, na posição 6 da cadeia da globina,
com produção de hemoglobina S (HbS). Esta pequena modificação estrutural é
responsável por profundas alterações nas propriedades físico-químicas da molécula
da hemoglobina no estado desoxigenado. Estas alterações culminam com um
evento conhecido como falcização, que é a mudança da forma normal da hemácia
para a forma de foice, resultando em alterações da reologia dos glóbulos vermelhos
e da membrana eritrocitária (EATON; HOFRICHTER, 1987; EATON; HOFRICHTER,
1990; MACKIE; HOCHMUTH, 1990). Este fenômeno é reversível com a oxigenação,
desde que a membrana da célula não esteja definitivamente alterada. Quando isto
ocorre formam-se os eritrócitos irreversivelmente falcizados, que permanecem
deformados independentemente do estado da HbS intracelular (HEBBEL, 1991).
As propriedades reológicas das células falciformes são determinadas pela
extensão da polimerização da HbS. Os polímeros, por serem viscosos, diminuem a
deformabilidade dos eritrócitos, diminuindo o seu trânsito através da microcirculação.
(MACKIE; HOCHMUTH, 1990; MOHANDAS; EVANS, 1989).
Vários fatores influenciam o grau de polimerização da desoxi HbS nas células
vermelhas: a porcentagem de HbS intracelular, o grau de desidratação celular, a
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), o tempo de trânsito dos
glóbulos vermelhos na microcirculação, a composição das hemoglobinas dentro das
células (% de HbS e % de Hb não-S), o pH, entre outros (EATON; HOFRICHTER,
1987; EATON; HOFRICHTER, 1990; NOGUCHI, 1984).
Uma das características dessas doenças é a sua variabilidade clínica:
enquanto alguns pacientes têm um quadro de grande gravidade e estão sujeitos a
inúmeras complicações e frequentes hospitalizações, outros apresentam uma
evolução mais benigna, em alguns casos quase assintomáticos. Tanto fatores
hereditários como adquiridos contribuem para esta variabilidade clínica. Entre os
fatores adquiridos mais importantes está o nível sócio-econômico, com as
consequentes variações nas qualidades de alimentação, de prevenção de infecções
e de assistência médica (ZAGO, 2001).
De modo geral, além da anemia crônica, as diferentes formas de doenças
falciformes caracterizam-se por numerosas complicações que podem afetar quase
28
todos os órgãos e sistemas, com expressiva morbidade, redução da capacidade de
trabalho e da expectativa de vida. Além das manifestações de anemia crônica, o
quadro é dominado por episódios de dores osteoarticulares, dores abdominais,
infecções e enfartes pulmonares, retardo do crescimento e maturação sexual,
acidente vascular cerebral e comprometimento crônico de múltiplos órgãos, sistemas
ou aparelhos (ZAGO, 2001).
Devido ao encurtamento da vida média das hemácias, pacientes com
doenças falciformes apresentam hemólise crônica que se manifesta por palidez,
icterícia, elevação dos níveis de bilirrubina indireta, do urobilinogênio urinário e do
número de reticulócitos (GALILI; CLARK; SHOET, 1986; HEBBEL, 1991). A contínua
e elevada excreção de bilirrubinas resulta, frequentemente, em formação de cálculos
de vesícula contendo bilirrubinato. Entretanto, diferente das outras anemias
hemolíticas, pacientes com doenças falciformes não costumam apresentar
esplenomegalia porque, repetidos episódios de vasooclusão determinam fibrose e
atrofia do baço (ZAGO, 2001).
A destruição do baço é a principal responsável pela suscetibilidade
aumentada a infecções graves (septicemias). Sendo estas infecções a 1ª causa de
morte em crianças menores de 5 anos. Como este estado de asplenia funcional
pode ser documentado desde os três meses de idade, o diagnóstico precoce tem,
pois, um papel central na abordagem dessas doenças, uma vez que podem ser
tratadas adequadamente e as complicações evitadas ou reduzidas. Quando
diagnosticadas precocemente e tratadas adequadamente com os meios disponíveis,
no momento, e com a participação da família, a morbidade e mortalidade podem ser
reduzidas expressivamente (EATON; HOFRICHTER, 1987; EATON; HOFRICHTER,
1990; MACKIE; HOCHMUTH, 1990).
O diagnóstico das hemoglobinopatias nem sempre é simples e rápido devido
a dificuldade na identificação das hemoglobinas anormais pelos métodos
convencionais. Esta dificuldade passa por alguns fatores que influenciam
diretamente no resultado final como, por exemplo, a falta de conhecimento técnico
cientifica do profissional, a falta de dados clínicos não fornecidos e a imperícia em
interpretar o eritrograma (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 2007).
29
2.3. Diagnóstico laboratorial
2.3.1. Eletroforese
A Eletroforese é uma técnica analítica amplamente utilizada para o estudo e
investigação de proteínas, enzimas e DNA (NAOUM, 2012). É utilizada como auxílio
diagnóstico clínico desde 1937, quando Arne Tiselius bioquímico sueco publicou um
trabalho científico relatando o fracionamento das proteínas séricas. Após alguns
anos, Linus Pauling e colaboradores (1949) publicaram na revista Science sua
descoberta, o fracionamento eletroforético da Hemoglobina S (HbS) usando
eletroforese em papel de filtro (NAOUM, 2012).
Desde então, a eletroforese vem sendo empregada como método para o
auxilio diagnóstico das hemoglobinas mutantes presentes no homem. O princípio
físico-químico da eletroforese é relativamente simples, utiliza a corrente elétrica
contínua para realizar o fracionamento dos componentes biológicos como o sangue,
urina, líquor e outras soluções de interesse clínico e de pesquisa (NAOUM, 2012).
Toda molécula presente nos tecidos e fluídos biológicos apresentam cargas elétricas
diferentes em sua estrutura tornando-as carregadas eletricamente produzindo assim
características de polaridade negativa e positiva, chamadas respectivamente de
cátodo e ânodo.
As cargas elétricas presentes nos compostos químicos são atraídas pela sua
polaridade oposta e desta forma se movimentam em um campo elétrico. Este é o
principio fundamental da eletroforese, o deslocamento das moléculas em direção da
sua polaridade oposta em um sistema de corrente elétrica continua que torna
possível o fracionamento dos componentes presentes nos mais diversos materiais
biológicos em especial no sangue, assim, caracterizando seus constituintes
(NAOUM, 2012).
Para que a eletroforese tenha sucesso é necessário além dos fatores físicos,
deve estar presente no sistema eletroforético os fatores químicos como a solução
tampão. No sistema eletroforético, as proteínas se movimentam em direção oposta
da sua polaridade, assim, quanto maior for a corrente elétrica, maior será a
velocidade de movimento de uma proteína em relação à outra em direção ao seu
cátodo ou ânodo fracionando-a de acordo com o número de cargas elétricas
presentes (NAOUM, 2012).
30
A separação das frações proteicas no sistema eletroforético só é possível
pelos aminoácidos que constituem as mais diversas proteínas, isto se dá pela
presença de carga elétrica ou polaridade dos aminoácidos. A migração eletroforética
de uma proteína ocorre sob a influência do campo elétrico. Sob condições de
corrente elétrica constante, a força de deslocamento de uma partícula é o produto de
sua carga efetiva, do potencial de gradiente (molaridade do tampão) e da resistência
do meio usado como suporte (Agar; Acetato; Poliacrilamida) (NAOUM, 2012).
A mobilidade eletroforética é definida fisicamente em: m= d/tE; onde: m – mobilidade
eletroforética; d – distância percorrida; t – tempo; E – potencial de gradiente.
O tipo de eletroforese depende de seus suportes de fracionamentos que são:
a) Acetato de celulose: é um éster produzido pela reação da celulose, extraída e
purificada da polpa de madeira com anidro acético e ácido acético, na presença do
catalisador do ácido sulfúrico (NAOUM, 2012). Este suporte apresenta qualidade na
absorção uniforme de proteínas; quantidade mínima de material para ser aplicado;
características físico-químicas bem definidas e proporcionadas pela homogeneidade
dos microporos; material com relativa pureza e neutralidade química; possibilidade
de transparentar para a leitura densitométrica e arquivamento por longo período de
tempo; por todas essas razões o acetato de celulose passou a ser destinado às
análises de proteínas, lipoproteínas, isoenzimas e hemoglobinas. b) Gel de Agar ou
Agarose: também conhecido ágar-ágar é um hidrocoloide extraído de diversas
espécies de algas marinhas vermelhas e consiste em uma mistura heterogênea de
dois polissacarídeos, a agarose e a agaropectina (NAOUM, 2012).
A operacionalidade tem baixo custo quando o gel de Agar é produzido no
próprio laboratório, mas seu custo fica elevado se o gel for industrializado. O gel de
Agar pode ser utilizado para as análises de rotina laboratorial para o fracionamento
das proteínas, lipoproteínas, enzimas e hemoglobinas; c) Gel de Poliacrilamida: sua
formação é realizada por um mecanismo de polimerização vinílica com o auxílio de
catalisadores. Foi aplicada originalmente em 1959, por Raymond e Weintraub, para
fracionar macromoléculas. Pela eletroforese por gel de poliacrilamida pode fracionar
as proteínas por dois processos, um pelo ponto isoelétrico e o outro pelo peso
molecular (tamanho) (NAOUM, 2012).
A revelação e a quantificação da eletroforese de hemoglobina ocorrem por
dois procedimentos técnicos que promove o resultado da eletroforese de
hemoglobina. Para tal ação, é necessário primeiro que haja a revelação das bandas
31
formadas pela “corrida” da hemoglobina em seu suporte eletroforético específico por
meio de corantes específicos que são capazes de reagir com as frações de
hemoglobinas presentes na eletroforese (NAOUM, 2012).
Os principais corantes utilizados para a revelação da eletroforese de
hemoglobina são o Negro de Amido e o Ponceau, mas para que ocorra de forma
adequada a reação química do corante com as frações produzidas na eletroforese é
necessário saber qual o suporte eletroforético utilizado para empregar o corante que
se adéqua ao suporte escolhido. Desta maneira, tanto o negro de amido quanto o
Ponceau tem sensibilidade para determinados suportes de eletroforese, pois, a
fixação do corante ocorre mais intensamente como o produto do fracionamento que
com o meio utilizado como suporte eletroforético (NAOUM, 2012).
Para que a revelação da eletroforese de hemoglobina seja bem sucedida,
após a coloração do suporte tem que descorar com soluções descorantes que
permitem a visualização das bandas eletroforéticas da hemoglobina para serem
analisadas qualitativamente para ter a confirmação do sucesso da eletroforese e
também observar se há presença de hemoglobinas variantes que possam interferir
no resultado final deste procedimento técnico.
A avaliação quantitativa da eletroforese de hemoglobina pode ser realizada
por eluição e densitometria. Estas duas técnicas são as mais utilizadas em
laboratórios clínicos em sua rotina para a determinação do resultado da eletroforese
de hemoglobina. A eluição e determinado por fotometria após a eluição do suporte
de eletroforese corado com ácido acético 80% que desnatura o meio usado no
fracionamento. As frações eluídas tingem a solução eluidora com intensidades
diferentes de cor e para que possa ser quantificada a solução eluidora que deve ter
as frações completas e uniformes, desta maneira a solução obedece à lei de Beer. A
partir da densitometria é possível determinar quantitativamente a fração de
hemoglobina presente na eletroforese por colorimetria. Este fato deve-se pela
absorção da luz que atravessa o suporte de eletroforese corada (NAOUM, 2012).
2.3.2. Espectroscopia Raman
O efeito Raman foi descoberto em 1928, pelo físico indiano Chandrasekhara
Venkata Raman (SMITH; DENT, 2005). Em 1960 com o uso do laser que a
espectroscopia de Raman teve sua utilização para a identificação e discriminação de
32
materiais biológicos sendo, assim, utilizado como uma ferramenta no diagnóstico de
diversas enfermidades principalmente nos tumores e doenças que alteram a
estrutura proteica tanto nos tecidos como nos fluídos biológicos (CHAIKEN et al.,
2011).
Isto se deve pela capacidade que o efeito Raman tem de demonstrar a troca
de energia entre a luz e a matéria (HOLLAS, 2004). Toda matéria que for irradiada
pela luz (radiação eletromagnética) esta pode ser absorvida, transmitida ou
espalhada (SMITH; DENT, 2005).
A radiação espalhada pode ter a mesma frequência da radiação incidente ou
apresentar alteração da frequência da radiação. Assim o efeito Raman tem duas
formas de espalhamento que são conhecidas como espalhamento elástico
(espalhamento de Rayligh) e o espalhamento inelástico (espalhamento de Raman)
(SMITH; DENT, 2005).
A espectroscopia de Raman provoca a formação de um campo elétrico que
altera a polarização do feixe de luz que incide na molécula produzindo um momento
dipolo induzido (SILVA et al., 2009).
O momento dipolo oscila conforme a frequência presente no campo elétrico
da radiação incidente. Esta oscilação na molécula promove a vibração que está
relacionada com a estrutura molecular irradiada pela presença dos tipos de ligações
químicas entre os átomos que apresentam frequência de vibração menor que a
frequência de oscilação da radiação incidente (SMITH; DENT, 2005). Com isso, vai
ocorrer a formação de um momento dipolo induzido que libera a radiação.
A característica física do efeito Raman ocorre pela mudança do estado dos
níveis de energia dos fótons que foram excitados. A espectroscopia de Raman é
uma ferramenta útil na identificação e estudo de diferentes substâncias químicas
como sua função orgânica e estrutura molecular (SILVA et al., 2009).
Como instrumento para o diagnóstico clínico a espectroscopia de Raman tem
se tornado um método de grande capacidade de discriminação de moléculas que
constituem tecidos ou componentes químicos celulares (MAHEEDHAR et al., 2011).
Esta característica de estudo das moléculas ocorre pela interação física com os
elétrons presentes nas moléculas, que podem sofrer mudanças no seu estado
elétrico produzindo fenômenos de liberação de energia que alteram seus níveis de
energia, modificando a conformação eletrônica dos seus níveis de energia
(HOLLAS, 2004).
33
As mudanças nos níveis de energia nas moléculas irradiadas por radiação
eletromagnética que podem ser absorvidas, transmitidas ou espalhadas. As
radiações na maioria são espalhadas na mesma frequência da radiação incidente
chamada de espalhamento elástico (espalhamento Rayleigh), quando ocorre a
alteração da frequência da radiação o espalhamento é inelástico ou espalhamento
Raman que apresentam vibrações características ou de identidade para cada
elemento químico excitado (SMITH; DENT, 2005). As vibrações são provocadas pela
formação de campo elétrico intenso que oscila na frequência da radiação incidente
que induz uma mudança na polarizabilidade da molécula (STONE et al., 2007).
Deste modo, a polarização ocorrida promove a modulação na amplitude e na
frequência do dipolo induzido pelo feixe de emissão de fótons, que pode ser
espalhamento elástico (Rayleigh) ou espalhamento inelástico (Raman) (SILVA et al.,
2009).
Com a polarização dos elétrons ocorre a separação de cargas dentro da
molécula com o campo externo, assim, moléculas colocadas em campo elétrico
sofrem distorções da seguinte maneira: a) O núcleo carregado positivamente é
atraído para o polo negativo do campo elétrico; b) os elétrons carregados
negativamente é atraído para o polo positivo do campo elétrico (HOLLAS, 2004).
Essas mudanças na polarização apresentar espalhamento inelástico terá o efeito
Raman. A vibração decorrente da excitação da emissão do feixe de fótons na
molécula pode ter 4 tipos de vibrações: 1) estiramento (simétrico ou assimétrico); 2)
deformação no plano; 3) deformação fora do plano; 4) torção (GELDER et al., 2007).
Nas ligações químicas simples, duplas e triplas podem ter o mesmo tipo de
vibração, porém aumentam neste sentido: νC=C>νC=C>νC-C. Diferentes ligações
químicas possuem diferentes frequências vibracionais. O espectro Raman indica a
presença destes diferentes tipos de ligações nas moléculas (GELDER et al., 2007).
A espectroscopia Raman permite a análise de materiais biológicos e pode ser
desenvolvida para detectar componentes simples ou múltiplos. Não envolve etapas
químicas adicionais para análise (separação, diluição ou mistura de quaisquer outros
reagentes), podendo mostrar-se superior aos atuais métodos de teste (PREMASIRI;
CLARKE; WOMBLE, 2001). É concebível que este método pode tornar-se uma
alternativa ou até mesmo substituir os métodos laboratoriais existentes no futuro
próximo, podendo ser usado para outros testes usando tecidos corporais, como o
sangue e os componentes no soro (SHAPIRO et al., 2011).
34
As principais vantagens do uso da espectroscopia Raman sobre outras
técnicas, é que esta permite que a análise seja feita em estruturas químicas
orgânicas ou inorgânicas com precisão, pois, com a radiação eletromagnética
incidente nas moléculas se tem uma resposta pontual e segura pelo comportamento
físico dos níveis de energia dos elementos estudados. Além disso, proporciona a
análise do material biológico em um curto espaço de tempo, onde a coleta do sinal
Raman é rápida, sendo que é possível analisar amostras líquidas ou sólidas em
tempo real. (GUIMARÃES et. al, 2006).
Segundo a revisão de Hanlon et al. (2000), a espectroscopia Raman tem um
grande potencial para fornecer informação de diagnóstico quantitativo in vivo. Dentre
a principal vantagem da Espectroscopia Raman em aplicações biomédicas é a de
que, por meio do ajuste da frequência de excitação, próximo da absorção de
frequência, os marcadores bioquímicos da doença podem ser seletivamente
observados no espectro de Raman. Como a hemoglobina é uma biomolécula e
apresenta a capacidade de absorver luz, ela também apresenta uma faixa e um
perfil espectral característicos da molécula, se ocorrer uma pequena mudança nessa
conformação haverá uma alteração do perfil espectral o que permitirá a identificação
da hemoglobina variante (HbS). Deste modo, pretende-se comparar os espectros
obtidos a partir do Raman com o método convencional de identificação a
eletroforese.
Existem estudos que analisaram a hemoglobina e células vermelhas de modo
estrutural e conformacional utilizando a espectroscopia de Raman. Entre estes
estudos, Raj et al (2012) utilizou micro partículas ligadas as hemácias e empregou
uma armadilha óptica para estimular as alterações na membrana da célula
vermelha. Teve como resultado a presença de um pico específico da deformação da
hemácia que é de 1035 cm-1 que demonstrou a deformidade da membrana. Para
chegar a este resultado utilizou o PCA para identificar as diferenças na estrutura da
membrana alongada.
No trabalho de Hongxing et al. (1999), utilizou SERS para identificar em uma
única molécula de hemoglobina imobilizada ou incorpora com partículas de prata
(nano partículas) obter a vibração do espalhamento Raman para determinar por
cálculo e experimento o aumento do campo eletromagnético por partículas de prata.
Obtendo um pico específico de 1375 cm-1 com uma excitação em 514,5 nm.
35
Villanueva-Luna et al. (2012), utilizou oito voluntários que apresentaram
concentrações de várias moléculas diferentes entre elas a hemoglobina, para este
estudo foi utilizado um laser de excitação de 785 nm e um espectrômetro de
resolução de 6 cm-1 e com região espectral entre 1000 a 1800 cm-1. O espectro
Raman encontrado foi de 1000 e 1542 cm-1 que são da hemoglobina. Para a
determinação das diferenças entre as amostras utilizou o PCA que discriminou os
espectros.
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Amostras biológicas
Para a realização desta pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) da UNICASTELO que aprovou a pesquisa com número de protocolo 64133.
Neste estudo coletou amostras de sangue de 22 pacientes sendo que 19 são
portadores da Hemoglobina S (HbS) e 3 pacientes apresentam a Hemoglobina
normal (HbA). Estes indivíduos foram captados do Banco de Sangue do Município
de Sinop/MT, onde são tratados e recebem atendimento médico especializado.
Como critérios de inclusão foram adotados os sujeitos que:
a) O participante ou responsável aceitar os termos da pesquisa e assinar o
TCLE;
b) Não apresentar doenças infectocontagiosas, sendo que a hematologista
responsável pelos pacientes realizou esta triagem;
c) Pacientes que não haviam realizado transfusão sanguínea no período
maior de 90 dias;
d) As amostras de sangue que foram coletadas no ambulatório da UCT e no
laboratório clínico e foram utilizadas para os exames de rotina dos pacientes.
Para a realização dos procedimentos técnicos de obtenção dos resultados
para este estudo, e em todos os procedimentos foram seguidas rigorosamente as
normas de biossegurança vigente no Brasil com a utilização adequada dos
Equipamentos de Proteção Individual (EPI) e dos Equipamentos de Proteção
Coletivos (EPC) para evitar eventuais acidentes durante o estudo e análise das
amostras.
Aproximadamente 4,5 mL de sangue foram coletados de três pacientes
sadios e dezenove pacientes portadores de doença falciforme e todas as amostras
sanguíneas foram coletadas com anticoagulante (EDTA 10%), com o intuito de
preservar as hemácias da ação dos fatores da coagulação e manter as
características físico-químicas dos eritrócitos.
Em relação ao transporte e conservação das amostras foram acondicionadas
em temperatura de 2ºC à 8ºC para manter a viabilidade molecular da hemoglobina
(SACHER; MCPHERSON; RONALD, 2012. O transporte do sangue foi realizado em
37
caixa apropriado para o transporte de material biológico seguindo as normas de
biossegurança para evitar acidentes com o material biológico impedindo assim que
não haja risco de contaminação ambiental.
A transferência do sangue já coletado para a caixa apropriada ocorreu com o
tubo fechado e sem o contato direto com o sangue. Após a coleta todas as amostras
foram submetidas à eletroforese com intuito de identificar a hemoglobina S nas
amostras de pacientes com doença falciforme e HbA nos indivíduos saudáveis.
3.2. Protocolos de Hemólise
Para obter os espectros da HbS e da HbA foi realizado protocolo de hemólise com
procedimento técnico simples que utilizou somente água para lisar as hemácias e
expor a hemoglobina. Antes da hemólise o sangue foi centrifugado (1500 rpm) por 5
minutos para a lavagem das hemácias em solução fisiológica por 3 vezes até o
sobrenadante ficar límpido. Após este procedimento o lavado de hemácias foi diluído
1:2 em água deionizada para o processo de hemólise.
3.3. Eletroforese
O hemolisado foi obtido a partir do uso de uma solução de Saponina, aplicada na
seguinte proporção: 2 volumes de sangue para 1 volume de saponina. Após a
obtenção do hemolisado que foi ressuspendido em solução Tampão: TRIS-EDTABorato 0,025M (TEB pH 8,5), o aparato típico de eletroforese em acetato de celulose
foi montado e aplicado uma voltagem de 300V. O tempo de corrida foi de 20
minutos, o corante negro de amido foi utilizado para revelar os pontos isoelétricos
das hemoglobinas.
3.4. Análise espectroscópica
Para a obtenção dos espectros foi utilizado um espectrômetro Raman dispersivo
(Lambda Solutions Inc/MA, EUA, modelo P-1 micro-Raman) que é constituído por
um laser de diodo (830 nm), acoplado a uma sonda de Raman, que é usado para
iluminar amostra e recolher a luz dispersa. A sonda está ligada a um espectrógrafo
com uma câmara CCD refrigerado por Peltier-cooled (-75°C), que recolhe espectro
38
de Raman de alta resolução a partir da amostra na região da impressão digital (400 1800 cm-1). A potência do laser foi ajustada a 300 mW e o tempo de exposição para
recolher o sinal de Raman foi ajustado para 3 segundos. Os espectros foram obtidos
em triplicata de cada amostra e a após efeito suas médias.
As regiões espectrais encontradas nas amostras analisadas da HbA e da HbS
foram baseadas nas características espectrais do ácido glutâmico (1500 cm-1 e
1650cm-1) e da Valina (880 cm-1 e 1400 cm-1), respectivamente, obtidos a partir do
fabricante (Sigma®) como demonstrado nas figuras 3 e 4 abaixo.
Figura 3: Espectro do ácido glutâmico.
Fonte: Sigma-Aldrich, 2003 (www.sigmaaldrich.com/catalog/search)
Figura 4: Espectro da valina.
Fonte: Sigma-Aldrich, 2003 (www.sigmaaldrich.com/catalog/search)
Os dados obtidos no presente estudo foram comparados com trabalho de
Hisch et al. (1999), que determinaram os espectros médios da HbA, HbS e HbC.
Na análise estatística foi realizado o teste t não pareado para a determinação do
nível de significância (p < 0,05). O software utilizado nesta análise foi o (Origin® 6.0).
O conjunto de dados dos espectros foi submetido à Análise do Componente
Principal (PCA), que é uma técnica matemática que tem por finalidade básica, a
análise dos dados usados promovendo sua redução e eliminação de sobreposições.
39
Por isso, pode ser usado como ferramenta estatística multivariada simples que
transforma um conjunto de variáveis originais que são extraídos da relação entre os
dados (espectros) com as múltiplas variações, com a transformada linear ótima. PCA
pode ser usado para espectros de grupo de acordo com as respectivas variações
semelhantes, uma vez que cada componente principal é ortogonal ao outro,
portanto, uma característica espectral original está presente em cada componente.
Para calcular o componente principal dos espectros das hemoglobinas utilizado o
Matlab 7.0 (JOLLIFFE, 1995).
40
4. RESULTADOS
A Figura 5 representa o perfil eletroforético de hemoglobina dos pacientes
portadores de doença falciforme (HbAS, HbSS e HbSC) e dos indivíduos normais
(HbAA). A eletroforese foi realizada com o intuito de confirmar a presença das
referidas hemoglobinas nas amostras que foram posteriormente submetidas à
Espectroscopia Raman. Cabe ressaltar que os pacientes que recebem o gene
anormal em dose dupla (homozigoto SS), apresentam o fenótipo HbSS e são os
indivíduos que apresentam o quadro clínico da patologia com maior severidade.
Figura 5: Perfil eletroforérico das Hemoglobinas: indivíduos normais (HbA) e de pacientes com
doença falciforme (HbSS, HbSA e HbSC).
A Figura 6 apresenta os dados referentes aos espectros médios das amostras
de sangue de pacientes normais (HbA), pacientes com doença falciforme (HbS) e do
anticoagulante E.D.T.A. 10%. As diferenças espectrais das amostras de HbA em
relação as amostras de HbS, estão relacionadas as bandas 882 e 1373 cm-1,
atribuídas a valina (Val) que apresentam maior intensidade nos espectros médios da
HbS (HISCH et al., 1999; SIGMA-ALDRICH, 2003®). Enquanto que, as bandas
predominantes nos espectros médio da HbA (1547 e 1622 cm-1) são atribuídas ao
ácido glutâmico (Glu) (HISCH et al., 1999; SIGMA-ALDRICH, 2003). Estes dados
estão de acordo com o esperado, uma vez que a doença falciforme é caracterizada
pela substituição de adenina por timina (GAG>GTG), codificando valina ao invés de
ácido glutâmico, na posição 6 da cadeia da globina, com produção de HbS. Em
relação aos espectros médios do EDTA não houve nenhuma banda espectral que
41
sobrepôs as bandas espectrais das HbA e HbS, assim não interferindo diretamente
no resultado final dos espectros médios da valina e do ácido glutâmico.
Figura 6: Médias dos espectros Raman do EDTA e das amostras de hemoglobina hemolisada dos
grupos HbA e HbS. Val e Glu com espectros característicos da valina (882 cm-1 e 1373 cm-1) e ácido
-1
-1
glutâmico (1547cm e 1622 cm ), respectivamente, os quais são vistos no espectro de hemoglobina.
Com o intuito de identificar e discriminar as diferenças espectrais entre as
hemoglobinas A e S foi utilizada a técnica de PCA. Neste estudo foram obtidos 66
espectros, que foram divididos em dois grupos HbA (normal) e HbS (doença
falciforme). A princípio foram identificadas oito PCs e com o intuito de verificar quais
poderiam apresentar maior poder de discriminação foram submetidos à ANOVA (5%
de significância). Os dois PCs com maior diferença estatisticamente significativas
foram plotados (plotagem binária).
A Figura 7 (A e B) apresentam as intensidades médias e desvio padrão dos
PC1 e PC2, de acordo com a análise estatística pode-se verificar que o PC1 foi mais
efetivo na discriminação da HbS (p < 0,001) enquanto que o PC2 foi mais efetivo na
discriminação da HbA (p < 0,0001).
Além disso, foram plotados os espectros dos PC1 e PC2 em função da
modificação estrutural das hemoglobinas, em destaque no PC1 estão relacionadas
às bandas de 882 e 1373 cm-1, atribuídas a valina que apresentam maior
intensidade nos pacientes portadores de doença falciforme (Figura 7 D). Com
relação ao PC2, destacam-se as bandas 1542 e 1620 cm-1 que são atribuídas ao
42
ácido glutâmico e que estão presentes em maior intensidade nos pacientes normais.
(Figura 7 E).
A Figura 7 (C e F) apresentam as intensidades médias e o desvio padrão que
não obtiveram significância estatística e nem a discriminação dos espectros,
demonstrando que somente os PC1 e PC2 são discriminante para a HbA e HbS.
A
B
C
D
E
F
Figura 7: (A e B): Médias dos valores e o desvio-padrão dos dois primeiros componentes principais
(PC1 e PC2) para os grupos de HbS e HbA. * Representa a diferença estatística com significância
entre os grupos específicos (Teste t) p < 0,001 e ** p < 0,0001. (D e E): Espectros dos primeiros dois
vetores dos componentes principais, com características espectrais de PC1 relacionados com valina
e PC2 relacionado com o ácido glutâmico, como indicado pelas setas. (C e F): Espectros que não
tiveram significância estatística e discriminação dos espectros.
A Figura 8 representa a plotagem binária do PC1 e do PC2 para os diferentes
grupos analisados (HbA e HbS). A linha de diagnóstico baseada no método de
PCA/Mahalanobis foi capaz de distinguir com 100% de capacidade os indivíduos
portadores da doença falciforme dos indivíduos normais.
43
0.40
HbS
0.30
HbA
PC2
0.20
Mahalanobis
0.10
0.00
-0.10
-0.20
0.05
0.10
0.15
PC1
0.20
0.25
Figura 8: Plotagem binária do PC1 e PC2 componentes principais para os grupos de HbA e HbS,
respectivamente. A linha de diagnóstico baseado em PCA / Mahalanobis distinguiu os grupos da
doença falciforme e normal.
44
5. DISCUSSÃO
A doença falciforme é um termo genérico usado para determinar um grupo de
alterações genéticas caracterizadas pelo predomínio da HbS. Essas alterações
incluem a anemia Falciforme (Hb SS), as duplas heterozigoses, ou seja, as
associações de HbS com outras variantes de hemoglobinas, tais como, Hb D, Hb C,
e as interações com talassemias (Hb S/ß° talassemia, Hb S/ß+ talassemia, Hb S/α
talassemia). Normalmente, quanto maior a quantidade de HbS, mais grave é a
doença. Os pacientes homozigóticos para HbS têm quadro clínico, em geral, mais
grave do que os pacientes com hemoglobinopatia SC, SD, SOarab, entre outros. A
associação com persistência hereditária de hemoglobina fetal confere melhor
prognóstico à doença. Em geral, os pais são portadores assintomáticos de um único
gene afetado (heterozigotos), produzindo HbA e HbS (AS), transmitindo cada um
deles o gene alterado para a criança, que assim recebe o gene anormal em dose
dupla (homozigoto SS) (ZAGO, 2001).
A HbS é caracterizada pela substituição de adenina por timina (GAG->GTG),
codificando valina ao invés de ácido glutâmico, na posição 6 da cadeia da globina,
com produção de HbS. Este fenômeno é reversível com a oxigenação, desde que a
membrana da célula não esteja definitivamente alterada. Quando isto ocorre
formam-se os eritrócitos irreversivelmente falcizados, que permanecem deformados
independentemente do estado da HbS intracelular (HEBBEL, 1991).
As propriedades reológicas das células falciformes são determinadas pela
extensão da polimerização da HbS. Os polímeros, por serem viscosos, diminuem a
deformabilidade dos eritrócitos, diminuindo o seu trânsito através da microcirculação.
(MACKIE; HOCHMUTH, 1990; MOHANDAS; EVANS, 1989). Vários fatores
influenciam o grau de polimerização da desoxiHbS nas células vermelhas: a
porcentagem de HbS intracelular, o grau de desidratação celular, a concentração de
hemoglobina corpuscular média (CHCM), o tempo de trânsito dos glóbulos
vermelhos na microcirculação, a composição das hemoglobinas dentro das células
(% de HbS e % de Hb não-S), o pH, entre outros (EATON; HOFRICHTER, 1981;
EATON; HOFRICHTER, 1990; NOGUCHI, 1984).
O diagnóstico das hemoglobinopatias nem sempre é simples e rápido devido
a dificuldade na identificação das hemoglobinas anormais pelos métodos
45
convencionais. Esta dificuldade passa por alguns fatores que influenciam
diretamente no resultado final como, por exemplo, a falta de conhecimento técnico
cientifica do profissional, a falta de dados clínicos não fornecidos e a imperícia em
interpretar o eritrograma (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 2007).
A eletroforese é uma técnica que consiste na migração de moléculas
carregadas eletricamente sob um campo elétrico aplicado, ocupa um dos locais mais
importantes na história do estudo da hemoglobina(Hb).
A HbS, a primeira Hb mutante descrita, foi descoberto em 1949 por Pauling et
al. (VOET et al., 2006), utilizando-se eletroforese. Mais tarde, as variantes de Hb
foram detectadas por eletroforese de zona em papel, em gel de amido, ou de
acetato de celulose (NAOUM, 2012). Com exceção da eletroforese em acetato de
celulose, que ainda é usado em alguns laboratórios, estes procedimentos têm sido
substituídos por focagem isoelétrica (IEF) (NAOUM, 2012).
Na IEF, um gradiente é estabelecido por uma corrente elétrica e por pH
específico que fazem com que a hemoglobina movimente-se e seja identificada. A
molécula de Hb migra através deste gradiente até que atinge a posição em que a
sua carga total é zero (ponto isoelétrico), que, em seguida, concentra-se em uma
banda. Uma das principais desvantagens da eletroforese é a semelhança entre o
ponto isoelétrico da hemoglobina HbS com outro mutante. Além disso, os
procedimentos técnicos são complexos, demorados e incluem o uso de vários
reagentes (LEONELI et al., 2000). Com base nestas informações, é de extrema
relevância que novas tecnologias sejam empregadas no diagnóstico das
hemoglobinopatias, com o intuito de tornar o diagnóstico mais rápido e preciso, para
que os pacientes recebam um tratamento adequado e precoce, como um meio
inovador de evitar ou minimizar as complicações decorrentes desta patologia. Neste
sentido, o presente estudo utilizou a espectroscopia de Raman como ferramenta na
identificação da hemoglobina mutante (HbS).
A espectroscopia de Raman é uma técnica óptica com vantagens sobre as
técnicas bioquímicas tradicionais, tem sido usada como ferramenta para o estudo
espectroscópico dos mais diversos compostos orgânicos e inorgânicos que
demonstra ser uma ferramenta de alta tecnologia a ser utilizada no diagnóstico de
doenças que afetam os seres humanos (KINCAID; STEIN; SPIRO, 1979). A fim de
identificar as alterações de várias biomoléculas que são encontrados em fluidos
biológicos tais como sangue e urina, a espectroscopia Raman tem grande
46
sensibilidade na detecção de compostos químicos presentes nas amostras
biológicas (SILVA et al., 2009; GELDER et al., 2007).
A
maioria
dos
estudos
que
envolvem
a
hemoglobina
humana
e
espectroscopia Raman tem como objetivo identificar a estrutura molecular porque a
função está diretamente relacionada à conformação molecular (HOYER, 2011;
HUISMAN; JONXIS, 1977). A espectroscopia de Raman foi usado para analisar as
estruturas da hemoglobina no sangue (CHAIKEN et al., 2011), para se comparar os
efeitos dos espectros no sangue com a presença da ligação do oxigênio e do gás
carbônico pela oxi-hemoglobina e desoxi-hemoglobina, para se analisar a
oxigenação e a desoxigenação nos eritrócitos (KNEE; MUKERJI, 2009).
No trabalho realizado por Hisch et al. (1999), foi determinado o espectro Raman das
hemoglobinas: HbA, HbS e HbC. De acordo com os resultados obtidos no referido
estudo, a diferença nos espectros médios das hemoglobinas analisadas foi
caracterizada por regiões específicas nos espectros (1542 cm-1, 1558 cm-1 e
1613 cm-1). No estudo de Hisch et al. (1999), os espectros estudados foram obtidos
por métodos de Fluorescência, Ultravioleta e Espectroscopia de Ressonância de
Raman. Assim obtendo espectros definidos da HbA, HbS e HbC. Para a obtenção
das hemoglobinas Hisch et al. (1999), utilizou para purificar as hemoglobinas por
permutação catiônica (CM-52) e remoção orgânica com fosfato de Sephadex G-25 e
depois hemólise obtendo o COHbS, COHbC e COHbA, assim determinando os
espectros que foram capazes de discriminar as três formas das hemoglobinas.
Realizando-se uma análise comparativa do presente estudo com o de Hisch et al.
(1999), o protocolo de obtenção da HbS e HbA não utilizou métodos complexos
como ocorreu no trabalho de Hisch et al. (1999), somente hemólise com água
destilada e centrifulgação da solução e foi observado que as amostras de HbS
provenientes de pacientes portadores de Doença Falciforme e da HbA apresentaram
espectros médios com características específicas nas regiões espectrais das duas
hemoglobinas HbS (882 cm-1 e 1373 cm-1) e HbA (1547 cm-1 e 1622 cm-1) (Figura 6).
Neste sentido, o espectro médio da HbS foi confrontado com o da HbA e as
diferenças observadas foram relacionados com as bandas de 882 e 1373 cm-1, que
são atribudos a valina (Val), e que estão presentes em maior intensidade média nos
espectros da HbS. No entanto, as bandas predominantes nos espectros de HbA
(1547 e 1622 cm-1) são designadas para o ácido glutâmico (Glu), enquanto que no
trabalho de Hisch et al. (1999), se tem os espectros na região da ligação entre o
47
triptofano e tirosina para a COHbS e COHbA e espectro mínino para a COHbA
(1542 cm-1, 1558 cm-1 e 1613 cm-1). Estes dados estão semelhantes com o
esperado, uma vez que os espectros de ambos os trabalhos mesmo tendo
metodologias de pesquisa diferentes obtêm resultados espectrais semelhantes e
discriminante entre as formas de hemoglobinas estuda.
A doença falciforme é caracterizada pela substituição de uma adenina por
timina (GAG > GTG), que codifica para valina em vez de ácido glutâmico na posição
seis da cadeia de globina, com a produção de hemoglobina S (HbS) (JUSZCZAK et
al., 2003).
Em laboratório clínico o diagnóstico para a anemia falciforme está diretamente
relacionado com a presença da HbS nos portadores ou seja a presença da
hemoglobina mutante no interior da hemácia que provoca alterações morfológicas e
reológicas nestas hemácias (ORLANDO et al., 2000).
Fundamentalmente os testes laboratoriais para o diagnóstico da anemia
falciforme, apresentam pouca sensibilidade e reprodutibilidade originando em alguns
pacientes um falso negativo produzindo assim uma interpretação errônea para essa
moléstia (NAOUM; BONINI-DOMINGOS, 2007). A escolha destes testes está
relacionada com o tempo de realização (rapidez) e o custo baixo de alguns
procedimentos técnicos.
Os seguintes testes laboratoriais de escolha na prática laboratorial que são
utilizados nos dias de hoje são:
a) Teste de falcização: é um teste qualitativo que utiliza uma substância
redutora de oxigênio que induz a presença de uma desoxiemoglobina e com
consequência a falcização da hemácia que contém a HbS, mas pode incorrer falhas
como a desproporção entre o redutor e o sangue, a vedação da lamina com a
lamínula e a concentração da HbS presentes nos eritrócitos em relação a HbA e
HbF, e as interações da HbS possibilitando um resultado falso negativo (LEONELLI
et al., 2000)
b) Teste de fragilidade osmótica ou solubilidade: teste qualitativo que tem
como principio metodológico promover um meio hipertônico com um potente redutor
como o ditionito de sódio que promove a hemólise pela incapacidade da membrana
plasmática das hemácias que apresentam em seu interior a HbS tem em suportar a
pressão osmótica. Isto se deve pela a modificação da estrutura da membrana
eritrocitária pela ação da hemoglobina mutante, deste modo provocando a turvação.
48
Pode acontecer a não turvação mesmo tendo alta concentração da HbS no sangue
do paciente (ZAGO, 2001).
c) Morfologia do eritrócito: teste sugestivo que deve ser observado quando se
realiza o eritrograma (esfregaço sanguíneo corado) por meio de microscopia óptica.
A HbS presente no interior do eritrócito modifica a sua morfologia apresentam
característica da existência da HbS pela presença do corpúsculo de Howell Jolie e
pontilhados basófilos que não são características somente para a anemia falciforme
e podem estar presentes em outras formas de anemias como na Talassemia
(VERRASTRO; LORENZI; NETO, 2005).
d) Eletroforese: é um método quantitativo que utiliza características físicas
(campo elétrico) para a discriminação e identificação das hemoglobinas e outras
proteínas. A separação das hemoglobinas ocorre por ponto isoelétrico promovendo
assim uma banda de precipitação no aparato de eletroforese, a precipitação no
aparato pode recorrer em erros por alterações ou imperícia na formação da solução
tampão, no pH da solução e a eletroendosmose que é um fenômeno que produz
uma falha na precipitação das bandas proteicas que ocorrem por alterações no
sistema eletroforético (NAOUM, 2012).
Em relação aos aspectos físicos (pH, temperatura e tempo), durante a
realização da coleta do material e as análises espectroscópicas das amostras não
houve impacto considerável nos resultados obtidos para este estudo, demonstrando
assim que a espectroscopia de Raman foi capaz de realizar os estudos da
hemoglobina mesmo não se observando esses aspectos. Outro ponto importante
que podemos salientar e o armazenamento das amostras em temperatura entre 2 à
8 Cº para a realização dos estudos eletroforéticos e espectroscópicos que não teve
interferência nos resultados mesmos mantendo as amostras armazenadas por
período delongado.
Outra característica que podemos salientar que não foi o objetivo deste
estudo, mas tem importância no diagnóstico laboratorial e a relação dos picos
espectroscópicos identificados no trabalho com a presença ou não de hemácias
depranociticas (Hemácia falciforme). Os picos da HbS (882 e 1373 cm-1 ) podem
indicar a presença da alteração morfológica da hemácia no sangue do portador?
Este estudo deve ser mais aprofundado com uma metodologia que consiga ao
mesmo tempo identificar a presença dos espectros da HbS com o estudo citológico
realizado no eritrograma.
49
Em relação à espectroscopia Raman, ela demonstrou-se uma ferramenta útil
na discriminação das hemoglobinas (HbA e HbS) por não sofrer influências externas
como o tempo de armazenamento, pH do meio e a temperatura. Mas, existe uma
característica da espectroscopia Raman que não pode ser ignorada que é a
fluorescência que pode ocorrer durante a realização do estudo espectroscópico. No
presente estudo houve uma preocupação em relação a fluorescência, pois, a
hemoglobina é um fluoroforo Para diminuir o efeito da fluorescência durante o
estudo
espectroscópico
foi
padronizado
a
obtenção
dos
espectros
pelo
espectrógrafo para a diminuição da ação da fluorescência, para tal as amostras
foram expostas ao infravermelho próximo (laser) para evitar a fluorescência do
material estudado e sendo exposto por tempo determinado de 3s e a utilização da
ferramenta matemática o PCA (CHAIKEN et al., 2011).
Em alguns trabalhos que utilizaram a espectroscopia de Raman como
ferramenta para discriminar proteínas como a hemoglobina utilizaram o PCA para tal
ação, como no trabalho de Saurabh et al. (2012), e no trabalho de Villanueva-Luna
et al. (2012), que discriminaram a hemoglobina com a utilização do PCA obtendo
assim resultados importantes em seus trabalhos. Demonstrando que o PCA é uma
ferramenta matemática com bom desempenho na discriminação dos espectros e por
este capacidade foi escolhido para ser utilizado neste trabalho.
A aplicabilidade da espectroscopia Raman no auxílio diagnóstico das
moléstias que acometem o homem é viável, pois, sua característica física faz com
que seu uso na investigação das doenças por meio das alterações moleculares
decorrentes das alterações metabólicas provocadas por cada patologia é
discriminada pelo efeito Raman quando se utiliza Laser infravermelho próximo para
diminuir o efeito da fluorescência e ferramentas matemáticas para o estudo da
discriminação dos espectros obtidos das amostras de sangue.
50
6. CONCLUSÃO
A espectroscopia Raman dispersiva no infravermelho foi capaz de identificar
mudanças sutis na molécula da hemoglobina, reconhecendo a troca do ácido
glutâmico por valina na cadeia globina na estrutura constituinte da hemoglobina. A
linha de diagnóstico baseada no método de PCA/Mahalanobis foi capaz de distinguir
os espectros do ácido glutâmico (1547 e 1622 cm-1) e da valina (882 e 1373 cm-1)
com 100% de precisão nos indivíduos portadores da doença falciforme (HbS) dos
indivíduos normais (HbA).
51
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57
ANEXO A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)
I. DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU LEGAL
RESPONSÁVEL
1. Dados de Identificação
Nome do Paciente:....................................................................................................
Documento CNS Nº:.................................................................................................
Data de Nascimento:.................................................................................................
Endereço: R:...........................................................Nº:......... Compl:......................
Bairro:..................................................................... Cidade:.....................................
CEP:.............................................................Telefones:............................................
2.Responsável Legal:
Nome do Responsável:...............................................................................................
Natureza (grau de parentesco, tutor, curador, etc.):.....................................................
RG Nº :............................. Sexo: () M ( ) F
Endereço: R:........................................................ Nº:..................
Bairro:................................................................. Cidade:..........................................
CEP:............................................................Telefones:...............................................
II – DADOS SOBRE A PESQUISA
1. Título do Protocolo de Pesquisa: ANÁLISE POR ESPECTROSCÓPIA RAMAN DE
HEMOGLOBINAS A PARTIR DE AMOSTRAS DE SANGUE DE PACIENTES COM
DOENÇA FALCIFORME.
Pesquisador: Antonio Carlos Bueno Filho – Biomédico
Documento de Identidade Nº : 000613549 SSP/MS
Sexo: (X) M ( )F
Cargo/Função: Mestrando em Bioengenharia
Departamento de Bioengenharia da Universidade Camilo Castelo Branco.
Nº de inscrição no órgão de classe: CRBM 5533
58
Colaboram na pesquisa: Dra Adriana Barrinha F. Morreti - Orientadora e Dra. Anna
Letícia Sant´Anna Yanai - Hematologista e Oncologia Pediátrica
III – REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO SUJEITO DA
PESQUISA OU SEU RESPONSÁVEL
A importância da realização desta pesquisa é avaliar com uma metodologia mais
sensível a pesquisa da hemoglobina S facilitando a identificação da anemia
falciforme. Esta doença acomete a população em geral e tem sintomas específicos.
Os sintomas mais comuns são as dores pelo corpo, na barriga e cansaço, e por
apresentar estes sintomas o diagnóstico laboratorial é importante para sua
identificação. A doença falciforme é uma alteração na hemoglobina que ocorre na
sua formação que causa dores e cansaço. Esta mudança da função da hemoglobina
provoca uma alteração nas células do sangue que ficam com um formato de foice.
Esta característica das hemácias em foice fecha o vaso sanguíneo deixando a
circulação do sangue devagar. O objetivo desse projeto é avaliar a presença da
anemia falciforme com mais eficiente na detecção da hemoglobina S. que causa a
anemia falciforme, por meio da utilização de Ramam que tem uma capacidade de
detectar com mais rapidez e corretamente a alteração na hemoglobina no sangue do
pesquisado. O procedimento de coleta de material será da seguinte forma: Será
coletado sangue pela veia do braço com agulha e seringa estéreis e realizado por
um biomédico, enfermeiro ou médico, O tempo de coleta é em torno de 1 minuto e a
técnica para este processo é simples. Os materiais utilizados para coleta são os
seguintes: garrote (tubo de látex), algodão para a assepsia na região da dobra do
cotovelo para evitar contaminação, álcool a 70% para realizar a limpeza da pele da
região do cotovelo. O sangue coletado será acondicionado em tubo específico para
o transporte e utilização. Onde o tubo de coleta contém um anticoagulante chamado
de EDTA que está no interior do tubo. Este anticoagulante não proporcionará
nenhum risco ao pesquisado, pois, somente seu sangue coletado que irá ter contato
com esta substância. A coleta do sangue somente uma única vez com volume de 4
ml.
DESCONFORTOS, RISCOS E BENEFÍCIOS: Não haverá risco grave para você
somente uma pequena dor ou não no local da picada da agulha que é rápido, mas
59
pode ficar roxo no local da picada da agulha após a coleta do sangue no meio do
braço. Esta coleta não apresentar risco grave a saúde do voluntário. Ao voluntário
da pesquisa, será informado dos resultados obtidos com sua amostra por meio de
Laudo que será entregue de forma confidencial e intransferível. O resultado será
colocado em envelope lacrado e entregue pessoalmente ao voluntário.
FORMA DE ACOMPANHAMENTO E ASSISTÊNCIA: Todos participantes da
pesquisa são portadores da anemia falciforme, portanto já estão sendo assistidos
por um médico hematologista.
IV – ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE
GARANTIAS DO SUJEITO DA
1. Acesso, a qualquer tempo, às informações sobre procedimentos, riscos e
benefícios relacionados à pesquisa, inclusive para dirimir eventuais dúvidas através
dos seguintes contatos do pesquisador:
Pesquisador: Antonio Carlos Bueno Filho, End: Rua: Veneza, Qd 12 Lote 2
Residencial Florença, Sinop/MT, Tel: 66-8135-1435.
2. Liberdade de retirar seu consentimento a qualquer momento e de deixar de
participar do estudo, sem que isto traga prejuízo à continuidade da assistência. Você
será esclarecido(a) sobre a pesquisa em qualquer aspecto e tempo que desejar.
Você é livre para recusar-se a participar, retirar seu consentimento ou interromper a
participação a qualquer momento. A sua participação é voluntária e a recusa em
participar não irá acarretar qualquer penalidade ou perda de benefícios.
O(s) pesquisador(es) irá(ão) tratar a sua identidade com padrões profissionais de
sigilo. O resultado do exame será enviado para você e permanecerão confidenciais.
Seu nome ou o material que indique a sua participação não será liberado sem a sua
permissão. Você não será identificado(a) em nenhuma publicação que possa
resultar deste estudo. Uma cópia deste consentimento informado será arquivada e
outra será fornecida a você;
3. Salvaguarda da confidencialidade, sigilo e privacidade;
4. Este novo teste é importante para melhorar a pesquisa da anemia falciforme com
agilidade e rapidez nos resultados e a utilização de um volume pequeno de sangue
para esta pesquisa.
60
5. O projeto de pesquisa foi aprovado pelo plenário do CEP (Processo
Nº.................................)
V– CONSENTIMENTO PÓS-ESCLARECIDO
Para indivíduos vulneráveis como crianças, adolescentes, devem ter um
representante legal, sem prejuízo de sua autorização.
Eu................................................................., após ser convenientemente esclarecido
pelo pesquisador e ter entendido o que me foi explicado, declaro para os devidos
fins que consinto em participar do presente Protocolo de Pesquisa e que o mesmo
poderá ser usado em estudos retrospectivos, desde que mantidas as condições aqui
apresentadas .
Sinop/MT, ______ de ___________________ de ________.
Assinatura do participante ou responsável legal
Identidade
Endereço
Assinatura do pesquisador (carimbo ou nome legível)
Identidade: 000613549/SSP/MS – CRBM 5533
Endereço: R: Veneza, Qd 12 Lot 2 – apto 4 – Residencial Florença - Sinop/MT –
Cep: 78550-404.
61
ANEXO B
PROTOCOLO DE ANAMNESE
PROTOCOLO NUMERO___________
Nome:_____________________________________________________RG:_________
Pai: ____________________________________________________RG____________
Mãe: ___________________________________________________RG____________
Idade:________
Data de Nascimento: ______/______/_______
Sexo: Masculino ( )
Feminino (
)
Endereço: _____________________________________________________________
Bairro:______________________________________________ CEP:____________
Cidade:______________________________________ UF: __________________
Material Biológico coletado: Sangue total com EDTA 10% - Volume de 1ml de sangue
PERGUNTAS
Tipo Sanguíneo:
ABO:______ Rh:_______
Transfusão Sanguínea:
Mais de 90 dias ( )
Menos de 90 dias ( )
Apresenta Alguma doença Transmissível: (
) Sim
(
) Não
Faz uso freguente de medicação: (
)Sim, Qual?____________________
(
) Não
Tem ido regularmente à consulta médica: (
) Sim
(
)Não
Realizou Eletroforese:
Mais de um ano ( )
Menos de um ano ( )