URINARY EXOSOMES: IS THERE A
FUTURE?
Patricia
Gonzales,
Trairak
Pisitkun
and
Mark
A.
KnepperLaboratory of Kidney & Electrolyte Metabolism
National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of
Health Bethesda, MD, USA Nephrol Dial Transplant (2008) 23:
1799–1801
Gdayllon Cavalcante Meneses
INTRODUÇÃO


Os exossomas são minúsculas vesículas (<100
nm) que contém diversas proteínas de membrana
e citoplasmáticas das células de origem.
Foram primeiramente descritos em células
sanguíneas, e estão presentes na maioria das
células do corpo humano;
INTRODUÇÃO


São produzidos em todos os tipos de células epiteliais
renais;
Os exossomas são vesículas originadas de corpos
multivesiculares (MVB) no interior das células.
INTRODUÇÃO


Os Exossomos urinários constituem cerca de 3%
do total de proteínas urinárias;
Quando exossomos são isolados, suas proteínas
constituintes são enriquecidos > 30 vezes,
melhorando a detecção de proteínas rara que
pode ter valor de diagnóstico.
INTRODUÇÃO


A descoberta dos exossomas urinários;
Pode fornecer uma fonte de Biomarcadores
protéicos para doenças
Fornecem importante significado
fisiológico e patológico referente ao estado
das células renais de origem.

INTRODUÇÃO
Exossomas urinários
Análise Proteômica
Proteínas citosólicas e
de membrana
FORMAÇÃO DOS EXOSSOMAS URINÁRIOS
MVBS
MICROGRAFIA ELETRÔNICA
MVB
MICROGRAFIA ELETRÔNICA
EXOSSOMAS URINÁRIOS (40-100 NM)
EXOSSOMA URINÁRIO
OBJETIVO

Discutir possíveis aplicações da análise de
exossomas urinários, bem como as barreiras para
seu desenvolvimento na prática clínica entre
outros.
COMO A ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS
PODERIA SER USADO EM PESQUISA CLÍNICA?

A descoberta de biomarcadores com aplicação em larga
escala:
DESCOBERTA
• Análise
Proteômica de
urina de
pacientes bem
caracterizados
VALIDAÇÃO
• Quantificação
de
biomarcadores
na urina de
muitos
pacientes
IMPLEMENTAÇÃO
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À
ESPECTROMETRIA DE MASSA (LC-MS/MS)



Importante ferramenta analítica para a análise
de pequenas moléculas em diversas matrizes
biológicas;
Diversos estudos têm sido direcionados no
sentido de desenvolver metodologias, utilizando
LC-MS/MS;
Exemplos: determinação de fármacos e
metabolitos em biofluidos, análise de proteínas e
peptídeos,
determinação
quantitativa
de
pequenas moléculas.
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À
ESPECTROMETRIA DE MASSA (LC-MS/MS)
Cromatografia
Líquida
Espectrometria
de massa
• Alto poder de
separação.
• Alta seletividade
e sensibilidade
QUAIS SÃO OS PROCESSOS CLÍNICOS QUE PODERIAM SE
BENEFICIAR COM A ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS E
BIOMARCADORES SUBSTITUTOS?
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

Potenciais aplicações:
Herança autossômica, doença renal policística dominante
(DRPAD) (Hogan, et al 2007).
No transplante renal, onde os biomarcadores poderá
fornecer orientações no intervalo antes da leitura da
biópsia, permitindo uma escolha mais rápida da melhor
terapia, na questão da lesão renal aguda x rejeição;
Grande potencial para as análises de mutações genéticas (
apresentam mRNA no seu lúmen).
BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE
EXOSSOMAS URINÁRIOS



Difícil quantificação, deve-se saber a taxa
absoluta da excreção de cada proteína e comparar
as taxas de excreção entre pacientes e controles;
Variação na excreção de
concentração das proteínas;
água
altera
a
Como alternativa pode-se utilizar marcadores
exossomais (Alix ou TSG101) que são
encontrados em todos os exossomos.
USO DO INIBIDOR DE PROTEASE



Preservar as proteínas associadas aos exossomas,
durante estocagem transporte e etc;
É recomendável a estocagem das amostras a
-80ºC;
Após descongelamento, as amostras devem ser
centrifugadas extensivamente afim de aumentar
a recuperar os exossomas da urina congelada.
BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE
EXOSSOMAS URINÁRIOS

Isolamento por Ultracentrifugação:
O mais efetivo!

Desvantagem:

o
Alto custo do equipamento;
o
Suporte inviável em ambientes clínicos.
o
Tendem a reter e concentrar proteínas solúveis que
podem competir com as proteínas exossomais,
dificultando a identificação.
PROCESSO
DE
ULTRACENTRIFUGAÇÃO
BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE
EXOSSOMAS URINÁRIOS

Abordagens utilizando ultrafiltração:

São promissores, mas tendem a reter e concentrar proteínas
solúveis na urina, além de exossomos.

Dificuldades nos processos de separação de interferentes.
BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE
EXOSSOMAS URINÁRIOS
A
excreção
da
proteína
Tamm-Horsfall
(uromodulina, a mais abundante proteína
excretada na urina).
 Esta
proteína tende a formar agregados fibrilares
na urina, principalmente em baixa temperatura;
 Estes
agregados podem arrastar os exossomas e
evitar o seu isolamento eficiente e purificação
através de processos de centrifugação.
A ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS É POTENCIALMENTE ÚTIL
PARA ESTUDOS FISIOLÓGICOS?

Foi demonstrado que o isolamento de exossomas
urinários detectou proteínas transportadoras de
Na+ expressas ao longo dos túbulos renais (McKee
et al., 2000).
o
o
A
Taxa
de
excreção
de
uma
determinada
proteína é a diferença entre a taxa de sua produção e a taxa
de sua degradação na célula;
Deve-se conhecer a taxa de degradação para poder
estimar a taxa de produção dessas proteínas.
CONCLUSÃO
Como qualquer nova ferramenta, a
análise de exossomas tem vantagens e
desvantagens que devem ser exploradas
antes de qualquer análise. No entanto,
dada a natureza não-invasiva do
procedimento de coleta da amostra e a
grande quantidade de informações
potencialmente disponíveis a partir de
tais estudos, parece provável que a análise
de exosomas irá desempenhar um papel
importante na pesquisa em nefrologia no
futuro.
BOA TARDE!!