FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DE COIMBRA
No âmbito de:
BIOQUÍMICA I
(1º ano)
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E
IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
SEMINÁRIO ORIENTADO 3 – SO3
Turma 2
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
SUMÁRIO
1.
Noção básica de propriedades dos lípidos, remetendo para
aquelas com interesse no uso de métodos de extracção e
identificação
2.
Comunicação de diferentes métodos de extracção de lípidos em
amostras biológicas
3.
Comunicação de diferentes métodos de análise de lípidos que
possibilitem a sua identificação
4.
Comunicação de exemplos do estudo dos lípidos no diagnóstico
médico
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
 São,
LÍPIDOS
maioritariamente:
− Ésteres de ácidos gordos
Propriedades
− Amidas de ácidos gordos
 Moléculas orgânicas com:
‒ Baixa solubilidade em água e outros solventes polares
‒ Alta solubilidade em solventes apolares
Por serem insolúveis em solventes polares, os lípidos
são fundamentais para estabelecer uma interface entre o meio
intracelular e o extracelular, francamente hidrófilos.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
LÍPIDOS
RESERVA
MEMBRANARES
(LÍPIDOS
APOLARES)
(POLARES)
FOSFOLÍPIDOS
GLICEROFOSFOLÍPIDOS
Ácido
gordo
Esfingosina
Ácido
gordo
Ácido
gordo
Glicerol
Glicerol
Ácido
gordo
Ácido
gordo
PO4
ESFINGOLÍPIDOS
Álcool
Ácido
gordo
PO4
Álcool
ESTERÓIS
GLICOLÍPIDOS
EX :
COLESTEROL
ESFINGOLÍPIDOS
Esfingosina
TRIGLICERÍDEOS
Ácido
gordo
Mono- ou
oligossacarídeo
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO

Método de Folch

Cromatografia
‒ Cromatografia em camada fina (TLC)
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
MÉTODO DE FOLCH
 Realiza-se uma homogeneização do tecido com clorofórmio e
metanol na proporção de 2:1.
 Adiciona-se água ou um sal apropriado à solução.
 A mistura resultante fica dividida em duas fases.
 Na fase inferior encontram-se os lípidos puros.
Durante o processo de lavagem, vai ser perdida
alguma percentagem de material lipídico.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
CROMATOGRAFIA
 Baseia-se na interacção de uma amostra com uma fase
estacionária e uma fase móvel.
 A fase estacionária (matriz) permanece imóvel durante a
separação, enquanto a fase móvel, que constitui o eluente,
permite a separação dos componentes da amostra consoante a
sua afinidade.
 Os vários componentes da amostra interagem, essencialmente,
por:
- Afinidade de carga;
- Polaridade.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
ERA UMA VEZ…
A
M
A
M A M
M
M
A
A
M
M
A
A
M
A
A
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
ERA UMA VEZ…
M
M
M
A A AAA A A
A
A
M
M
M
M
M
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA
 As substâncias da mistura são transportadas a certas
distâncias e, desta forma, separadas.
 Permite identificar substâncias desconhecidas através
da comparação com padrões (caso eles existam) e
isolar os diferentes componentes de uma mistura.
 Fase estacionária – camada fina de ácido de silício (por
exemplo) sobre suporte de vidro, adsorvente muito polar
Migração de um solvente (a) e de
um componente da amostra (b).
e, como tal, os fosfolípidos (por exemplo) possuem
grande afinidade para ele.
 Fase móvel – solvente (clorofórmio+metanol+água) com
afinidade para os fosfolípidos
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
MÉTODOS DE ANÁLISE

Teste de Iodo

Teste de Liebermann-Burchard

Espectrometria de massa

Teste enzimático
‒ Identificação da esfingomielina
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
TESTE DO IODO
 Identifica a presença de ácidos gordos insaturados através de
uma reacção de halogenação.
 Se houver dupla ligação, o iodo será consumido e a coloração
característica (azul) da solução de iodo diminuirá de intensidade.
 Pode-se quantificar os ácidos gordos insaturados através de uma
titulação com uma solução de iodo.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
TESTE DE LIEBERMANN-BURCHARD
 Identificar e quantificar o "colesterol total" (colesterol + ésteres
do colesterol).
 Tem como fundamento a reacção do colesterol e dos seus
ésteres com anidrido acético e ácido sulfúrico concentrado, da qual
resulta a formação de um complexo corado de azul esverdeado,
cuja intensidade da cor é directamente proporcional à concentração
de colesterol.
L-B reagent
H2SO4/HOAc
HO
HOO2S
Cholesterol
Cholestahexaene sulfonic acid
max = 620 nm
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
ESPECTROMETRIA DE MASSA
 Um composto é ionizado (uma molécula de carga nula é
bombardeada por electrões).
 Os iões são separados atendendo à base da razão da
massa pela carga.
 Identifica entidades massa/carga (que correspondem a
compostos) devidamente separadas umas das outras e
expressa esses achados de maneira gráfica (espectro).
 Muitas vezes acoplada à cromatografia.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
TESTE ENZIMÁTICO
 Através de reacções enzimáticas específicas com a amostra
anteriormente isolada, obtêm-se produtos que emitem, por
exemplo, fluorescência.
IDENTIFICAÇÃO DA ESFINGOMIELINA
 Importante componente lipídico da membrana celular.
 É baseado na actividade enzimática da esfingomielinase.
 Esfingomielinase bacteriana é primeiramente usada para
hidrolisar a esfingomielina.
 Ocorrem, posteriormente, uma série de reacções enzimáticas
que resultam na formação de um produto altamente fluorescente,
a resorufina.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
EXEMPLOS DO ESTUDO DE LÍPIDOS NO
DIAGNÓSTICO MÉDICO

Doença de Niemann-Pick

Hipercolesterolemia
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
NIEMANN-PICK
Doença sem tratamento (segundo um trabalho de
licenciatura de uma aluna de bioquímica tutorado pelo
Prof. Doutor Hassan Bousbaa).
 As formas tipo A e B da doença de Niemann-Pick são causadas
pela deficiente actividade da esfingomielinase.
 Os pacientes desta doença possuem valores de esfingomielina 4
a 15 vezes mais elevados que um indivíduo normal, dependendo do
tecido em análise.
 Leva à hipertrofia do baço e do fígado e a lesões nervosas graves
(Tipo A)
DIAGNÓSTICO
Realizado a partir da análise dos níveis de
esfingomielina em amostras de tecidos (biopsia ao
baço ou fígado).
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
HIPERCOLESTEROLEMIA
 Patologia que se caracteriza pelos níveis elevados de colesterol
no sangue
 É
um
dos
factores
envolvidos
no
desenvolvimento
da
arterosclerose, devido à acumulação de colesterol na corrente
sanguínea
 Tem como causa maior a prática de hábitos alimentares
inadequados
DIAGNÓSTICO
Realizado a partir da análise dos níveis de
colesterol no sangue.
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
HIPERCOLESTEROLEMIA
Tratamento
 Uma alimentação saudável, com baixo teor em
gorduras saturadas.
 Estatinas ( inibidor da enzima que catalisa a reacção de
formação do colesterol)
Acetyl-CoA
3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA
HMG-CoA reductase
Squalene
Cholesterol + Lecithin
LCAT
Mevalonate
Cholesterol ester
“Statin” drugs inhibit this enzyme
MÉTODOS DE EXTRACÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE LÍPIDOS
BIBLIOGRAFIA

Propriedades e classes de lípidos
‒
STRYER, Lubert; TYMOCZKO, John L.; BERG, Jeremy M. – Bioquímica – 5ª ed.; Rio Janeiro:Guanabara
Koogan , 2004 ; pág. 333-344, 754-755

Métodos de extracção
‒
‒
‒
‒

Métodos de análise
‒
‒
‒
‒
‒
‒
‒

http://www.cyberlipid.org/extract/extr0001.htm
http://www.lipidlibrary.co.uk/topics/extract/index.htm
http://jacintocastanho.planetaclix.pt/cromatografia.htm
http://www.infopedia.pt/$cromatografia
http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm
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http://www.apmaldi.com/Applications/Spectra/Lipids_Spectrum2.jpg
http://www.dbm.ufpb.br/DBM_bioquimica_monitoria.htm
http://www.dq.fct.unl.pt/cadeiras/bio-A/main/aula09_08_09(lipidos).pdf
http://www.dqb.fc.ul.pt/docentes/fduarte/espectrometria_de_massa_de_elect.htm
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12069422?dopt=Abstract
Exemplos do estudo de lípidos no diagnóstico médico
‒
‒
‒
http://www.cyberlipid.org/cyberlip/home0001.htm
http://www.ess.ips.pt/escola/Bioquimica/8CLE/GRUPO9/9.8.pdf
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