Licenciatura em Biologia Humana
2º Ano (4º Semestre)
Ano Letivo 2011/2012
Júri:
Prof. Fernando Capela
Prof. Paulo de Oliveira
Elaborado por:
Maria Ferreira nº 27496
Mariana Ascensão nº 27756
Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012
De acordo com o tipo de células que podem gerar
dividem-se em:
 Totipotentes
 Pluripotentes
 Multipotentes
 Oligopotentes
 Unipotentes
Figura 1 – “Stem cells” pluripotentes


“Stem cells” pluripotentes derivadas artificialmente
de células não-pluripotentes pela indução de uma
manifestação “forçada” de certos genes

Não são obtidas a partir do embrião, mas sim de
células diferenciadas

Yamanaka (2006) – 1ª vez que se geraram iPSCs a
partir de fibroblastos de ratinhos

Foram isolados 4 genes essenciais para a produção de
“stem cells”

Yamanaka (2007) – descobriu que:

Nanog
um dos principais determinantes da pluripotência
celular

c-Myc
é oncogénico

Yamanaka (2007) – transformou fibroblastos humanos
em células iPS’s

Hochedlonger (2008) - utilizou um adenovírus para
transportar os 4TF para o DNA de célula da pele e
fígado de ratinhos

Yamanaka (2008) - concluiu que
se poderiam transferir os 4 genes
necessários com um plasmídeo
Figura 2 - Yamanaka

Freed (2009) – demonstrou outra vantagem do
adenovírus

Morrisey (2011) – usou microRNAs, melhorando a
eficiência da reprogramação

Células para reprogramação:
 Eficácia,
período de tempo e extensão da reprogramação
varia conforme as células iniciais

Tecidos da medula óssea são uma fonte de “stem cells”
Cirurgia invasiva e dolorosa
Figura3 – Indução de iPSC’s
Células Adultas
Geração de iPSC
Células adultas podem ser reprogramados
para um estado pluripotente pela expressão
“forçada” de alguns fatores embrionários
de transcrição

Eficiência da produção
extremamente baixa

Se forem usados vírus
poderá haver alteração
genética das células e a expressão de oncogenes
pode ser acionada

iPSC’s são tipicamente derivadas por transfecção de
certas células
Exemplo: Fibroblastos

O estado de diferenciação da célula alvo
influencia a sua suscetibilidade para a
reprogramação e para o potencial de
diferenciação das iPSC’s daí derivadas

Stem cells de músculo de rato reprogramam com
maior eficiência que as suas células filhas mais
diferenciadas (mioblastos e fibroblastos)
depende

Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no
processo de indução, cuja ausência torna impossível a
indução

Oct-3/4

Sox2

Fatores adicionais para ↑ eficiência da indução:
 Klf4
 c-Myc
oncogénico
Transferência
dos 4TF, exceto
c-Myc
 Nanog
 LIN28
Células
Adultas
Células iPS

Processo:

+ lento

- eficaz

Não se desenvolve cancro



Oct-3/4

Papel crucial na manutenção da pluripotência

Ausência → conduz à diferenciação
Sox2

Semelhante ao Oct-3/4 → mantém pluripotência

Expresso em “stem cells” pluripotentes e unipotentes
Klf4

fator capaz de gerar células iPS



c-Myc

Mostrou-se desnecessários para a geração de iPSC’s humanas

Oncogene → por isso o seu uso é preocupante
Nanog

Necessário para promover pluripotência

Poder de renovar “stem cells”

Ausência → rápida diferenciação

Desnecessário para a indução
LIN28

Fator de geração de iPSC’s

Desnecessário

Proteína supressora de tumores

Principal inibidora da geração de células iPS

Liga-se diretamente ao promotor do Nanog para
suprimir o seu nível de expressão
Inicia-se a diferenciação de “stem
cells” em células adultas

Deleção do gene p53
iPSCs em 1000x
↑ eficiência de geração de

Proteínas envolvida na geração de células iPS humanas

Possui 2 promotores alternativos:
 TAp73
 DNp73
funções semelhantes à p53
inibe o p53 e o p73
↑a expressão Nanog
pode ↑ eficiência da geração de iPSC’s humanas
células geradas com a sua expressão são + resistentes à
diferenciação (in vitro e in vivo)

Os 2 promotores da p73 têm papéis opostos

Lin et al descobriu que a adição do gene humano
de DNp73 ↑ a geração de iPSC’s
Condições basais:
• Oct-3/4
• Sox 2
•Klf4
Condições basais +
•c-Myc
DNp73
Gráfico 1 – Colónias de iPSC humanas

Contribui diretamente para a expressão do Nanog e
do Oct-3/4
Manutenção da
pluripotência
Gráfico 2 – Expressão de fatores de transcrição

Até 2009, todos os métodos desenvolvidos
envolviam a utilização de materiais genéticos
Possibilidade de
ocorrerem modificações
genéticas

Tumores
Hongyan et al

Utilizaram proteínas recombinantes capazes de
reprogramação celular
piPSC’s

Hongyan et al
Autorrenovam-se
piPSC’s
Pluripotentes in vitro e
in vivo
Evitam introdução de
modificações
genéticas

piPSC’s
 Foram
criadas em ratinhos
Indistinguíveis das “stem
cells” embrionárias
 Exigem
métodos de aperfeiçoamento
 Representa
Vantagens
um avanço em relação aos outros métodos

Vantagens:

Elimina o risco de modificar o genoma da célula-alvo
Oferece um método para gerar iPSC’s + seguras

Confere uma abordagem + simples e + rápida

Poderia potencialmente permitir a aplicação de uma
metodologia de reprogramação mais ampla e mais
económica
larga escala
produção de proteína recombinantes em

Reduzido número de células

Falta de metodologias simples

Custos

Rendimento

Inserção genómica

Rejeição Imunológica

Teratomas

Plasmídeos – evita vírus, necessita de oncogenes e
é menos eficiente

Adenovírus – não incorpora os seus genes no
hospedeiro alvo e necessita de pouco tempo de
apresentação

Proteínas recombinantes
Propriedades celulares biológicas:

Morfologia – forma redonda, nucleótidos grandes e citoplasma escasso

Propriedades de crescimento – tempo de duplicação e atividade mitótica

Marcadores de stem cells - iPS humanas expressam os marcadores específicos para
hESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-2-49/6E e Nanog

Genes de ‘stem cells’ – Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1, DPPA2,
DPPA4 e hTERT

Atividade da telomerase – hESCs expressam alta atividade de telomerases para
sustentar a autorrenovação e proliferação e assim como as iPS
Plutipotência:

Diferenciação neural – iPS diferenciadas em neurónios,
expressando βIII-tubulina, tirosina hidroxilase, AADC, DAT,
Chat, LMX1B e MAP2

Diferenciação cardíaca – iPSC diferenciadas em
cardiomiócitos

Formação de teratomas

Quimeras de ratinhos

Complementação tetraploide

Grande plasticidade celular

Não geram riscos de rejeição imune

Possibilidade de modelos de doenças in vivo

Possibilidade de reparação de doenças por mutações
A eficácia de indução de iPSC’s é muito baixa dando
origem a células insuficientemente reprogramadas


A tecnologia das iPS tem potencial para
avançar com a terapia médica personalizada,
a medicina regenerativa e criar novos modelos
de doenças humanas para pesquisa e testes
terapêuticos
Uso de iPSC’s para a terapia de doenças
incuráveis: produção de células adultas
específicas para cada paciente e doença
específica



O transplante de órgãos exige disponibilidade de
tecidos e tratamento com imunossupressores
As iPSCs humanas poderiam ser induzidas nos tipos
de células desejados e seriam geneticamente
compatíveis com o paciente
Surgiram discussões sobre o fornecimento de
terapias celulares em humanos, nomeadamente
para pacientes com doenças debilitantes e
distúrbios neurológicos – Questão ética

É necessário superar a barreira que está entre a
eficiência e a integração genómica.

Caracterização proteómica de iPSC’s.

Uso de iPSC’s para identificar fármacos terapêuticos
capazes de resgatar um fenótipo.
Por exemplo, linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados
pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), onde o gene p63 está
mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser
parcialmente resgatado.

Modelação de doenças

Descoberta de fármacos

Terapia genética

Terapia de substituição/reprogramação

Terapia para o Parkinson

Terapia para reparação cardíaca

Terapia para reparação hepática

Estas técnicas de geração de células iPS são
revolucionárias pois, anteriormente só se podiam
obter células pluripotentes a partir do embrião e
agora, é possível obtê-las a partir de células
adultas.

A eficiência das iPSC é muito baixa
insuficientemente rerogramadas
células

A utilização de vírus pode levar a alterações
genómicas

Reguladores transcricionais cruciais envolvidos no
processo de indução, cuja ausência torna
impossível a indução

Importante descoberta para a terapêutica.

Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of
human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology.
2012; 13:9

TAN, Kah Yong et al. Efficient Generation of iPS Cells
from Skeletal Muscle Stem Cells. PLoS ONE. Outubro
2011; vol. 6

ZHOU, Hongyan et al. Generation of Induced Pluripotent
Stem Cells Using Recombinant Proteins. Cell Press. Maio
2009





Figura 1 - “Stem cells” pluripotenes em
http://dererummundi.blogspot.pt/2008/03/clulas-estaminais-e-expressognica.html
Figura 2 – Yamanaka em
http://www.gladstone.ucsf.edu/gladstone/site/publicaffairs/content/1/64
8
Figura 3 – Indução de iPSC’s em
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Induction_of_iPS_cells.svg
Gráfico 1- Colónias de iPSCs humanas em Lin et al. DNp73 improves
generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell
Biology. 2012; 13:9
Gráfico 2 - Expressão de fatores de transcrição em Lin et al. DNp73
improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC
Cell Biology. 2012; 13:9