Espectrometria de massas e proteômica
Espectrometria de massas e proteômica
BCM13042 - Fundamentos de Análises de Proteínas (2011/2)
Dr. Diogo Ribeiro Demartini | [email protected]
Laboratório de Proteínas Tóxicas
Centro de Biotecnologia e Departamento de Biofísica - UFRGS
Diogo Ribeiro Demartini
Espectrometria de massas e proteômica
Introdução
1. Espectrometria de massas
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Histórico;
Fundamentos básicos;
Componentes e tipos de equipamentos;
Tipos de ionização;
Tipos de fragmentação;
Detecção;
2. Proteômica
a)
b)
c)
d)
Preparo de amostras (2D, 1D, GeLC, HPLC, etc...);
Abordagens (Botton Up & Top Down, fosfo, PTM);
Fragmentação de peptídeos;
Proteômica quantitativa;
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1.a - Histórico
Prof. Charley Staats
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Espectrometria de massas e proteômica
1.b - Fundamentos básicos
 Medida da relação massa/carga de um íon
 Diferentes de outras técnicas, MS não envolve uma região específica do
espectro eletromagnético;
 massa/carga (m/z): massa do íon / carga do íon
–
1 unidade de massa atômica = 1 Da = 1/12 massa
–
1 kDa = 1000 amu
Diogo Ribeiro Demartini
12C.
Espectrometria de massas e proteômica
1.b - Fundamentos básicos
Resolution =18100
8000
Counts
6000
Resolution = 14200
4000
Resolution = 4500
2000
0
2840
2845
2850
2855
Mass (m/z)
Prof. Charley Staats
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Espectrometria de massas e proteômica
1.c – Componentes e tipos de equipamentos
IONIZAÇÃO
ANÁLISE
DETECÇÃO

Electron Ionization (EI)


Chemical Ionization (CI/APCI)

Sector Mass Analyzers
(Magnetic and Electrostatic)
Quadrupole Analyzers

Photo-ionization (APPI)

Ion Traps

Electrospray (ESI)

Ion Cyclotron Resonance


Time-of-Flight

Matrix-assisted Laser Desorption
(MALDI)
Field Desorption (FD)

Plasma Desorption (PD)

Fast atom bombardment (FAB)

High-temperature Plasma (ICP
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
MCP Microchannel
Plate Detectors
http://www.rmjordan.com/jpegs/40mmmcp.jpg
Adaptado de “Villanova University “
Espectrometria de massas e proteômica
1.c – Componentes e tipos de equipamentos
A MONTAGEM DO EQUIPAMENTO É FEITA ATRAVÉS
DA COMBINAÇÃO DOS COMPONENTES
Aebersold R, Mann M. 2003. Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422, 198-207.
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1.c – Componentes e tipos de equipamentos
IONIZAÇÃO
MALDI
ESI
ANÁLISE
TOF
Q
DESI
Qq
SELDI
QQQ
LTQ
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DETECÇÃO
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1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization)
The technique which we now know as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) was developed
simultaneously in two laboratories in 1987. The first report of high mass ions (above m/z 10,000) was a paper
presented by Koichi Tanaka of the Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) at the Second Japan-China Joint
Symposium on Mass Spectrometry, held September 15-18, 1987 in Takarazuka, Japan. Using a pulsed N2 laser
(337 nm) and a time-of-flight mass spectrometer equipped with a coaxial reflectron, they recorded molecular
ions at m/z 34,529 from carboxypeptidase-A dissolved in a slurry of glycerol and an ultra-fine metal powder. In
addition, they reported a mass spectrum of lysozyme (MW 14,307) containing multimeric ions up to the
pentamer recorded at m/z 71,736. At the same time, Michael Karas and Franz Hillenkamp from the University of
Muenster (Germany) had developed a matrix-assisted technique using a frequency-quadrupled (266 nm) Qswitched Nd:YAG laser to desorb intact molecular ions from proteins dissolved in matrix solution containing
nicotinic acid. Their first high mass results were reported at the International Mass Spectrometry Conference
(IMSC) in Bordeaux, France in August 1988, and included molecular ions for bovine serum albumin observed in
their mass spectrum at m/z 66,750. Results from both of these groups were first published in 1988, followed by a
number of other reports by Hillenkamp and Karas for proteins with molecular weights in excess of 100 kDa.
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y; Yoshida, T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) 151-153.
Karas, M.; Hillenkamp, F., Anal. Chem. 60 (1988) 2299-2301
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Skoog. Principles of Intrumental Analysis. 1998. 5th Ed.
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1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
Laser
TRASFERÊNCIA DE ENERGIA ENTRE A
MATRIZ E O ANALÍTO
AMBOS VOOAM!!
A
M
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placa
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1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
http://bioms.chem.uu.nl/index.php/education/open-access-master-courses
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1.d- Tipos de ionização – MALDI (dessorção)
Íon [M+H]+
Menos sensível a contaminantes
Sensibilidade: fentomol
Análise high-troughput (rápido e relativamente fácil)
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1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa)
Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas.
O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de
gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso,
formando gotículas altamente carregadas.
Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou
múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o
campo eléctrico aplicado.
No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos
e no modo negativo, os íons são desprotonados
(M + nH)n+
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1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa)
Modo positivo (protonados)
Modo negativo (deprotonados)
1- formação de microgotículas;
2- evaporação do solvente (gás)- rompimento do limite de Rayleigh;
3- ionização (formas multicarregadas) – (M+nH)n+;
4- entrada no espectrômetro
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1.d- Tipos de ionização –ESI (fase gasosa)
-Automatização;
-Acoplamento a sistemas
cromatográficos;
-Geração de íons
multicarregados;
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1.d- Tipos de ionização – demais tipos de ionização
 Electron Ionization (EI) – bombardeamento; fragmentação
excessiva;
 Chemical Ionization (CI/APCI) – tranferência de prótons através
do uso de gás (CH4)
 Photo-ionization (APPI) – ioniza o que ESI não consegue.
 Desorption-electrospray ionization (DESI) – combinaçãod
MALDI e ESI (incidência de laser e spray, em uma matriz sobre
uma placa NÃO inerte)
 Fast atom bombardment (FAB)- moléculas lábeis.
 High-temperature Plasma (ICP) – fluxos na ordem de 50
mL/min!!!!
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1.d- Tipos de ionização – comparativo
http://www.chem.agilent.com/en-US
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Espectrometria de massas e proteômica
1.e- Tipos de FRAGMENTAÇÃO




Por que fragmentar?
Como fragmentar?
Como analisar?
Como DETECAR?
CID: COLLISION INDUCED DISSOCIATION – COLISÃO FÍSICA ENTRE O ÍON
PRECURSOR E UM GÁS (Ar, He, N2);
EDT: ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION – REAGENTE ANIÔNICO
TRANSFERE ENERGIA PARA O PEPTÍDEO POSITIVO;
ECD: ELECTRON CAPTURE DISSOCIATION – CONVERSÃO DO PEPTÍDEO
IONIZADO PARA UMA FORMA RADICALAR
INFRARED MULTHIPHOTON DISSOCIATION – ABSORÇÃO DE FÓTONS
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1.f- Detecção
MCP: U$ 20.000,00
Do tamanho de uma moeda de UM REAL!!!
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2.a- Proteômica – Preparo de amostras




Tecido de origem
Tratamento necessário à resposta biológica;
Remoção de contaminantes;
Digestão das proteínas a peptídeos;
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2.a- Proteômica – Preparo de amostras -digestão
“ Reduzir” as proteínas a peptídeos;
Expor ao máximo os sítios de
clivagem (redução com DTT seguida
de alquilação)
Digestão por enzimas (geralmente
tripsina, alta especificidae (Arg/Lis)
Anal Bioanal Chem (2007) 389:991–1002
Diogo Ribeiro Demartini
O PREPARO DAS AMOSTRAS É PONTO CRÍTICO DE
QUALQUER EXPERIMENTO PROTEÔMICO
Espectrometria de massas e proteômica
2.a- Proteômica – Preparo de amostras
 Remoção de contaminantes
 Detergentes, sais, açúcares, etc... O espectrômetro NÃO sabe
que estamos trabalhando com peptídeos
 Enriquecimento de peptídeos de interesse,
modificados ou não
 Enriquecimento de peptídeos fosforilados, atrvés do uso de
cromatografias de afinidade por metal imobilizao (Fe, Ti, Ga);
 Pré-fracionamento das amostras para análise
 Eletroforese uni ou bi-dimensional, cromatrografias diversas.
Associação de cromatrografias de troca catiônica forte, com
fase reversa: MuDPIT
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2.a- Proteômica – Preparo de amostras – fosfopeptídeos
MOMENTO BIOQUÍMICO
Proteomics 2009, 9, 1451–1468
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Espectrometria de massas e proteômica
2.a- Proteômica – Preparo de amostras - Overview
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2.a- Proteômica – Preparo de amostras
 Gel-1D
 Gel-2D
 Cromatografia multidimensional
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2.a- Proteômica – Preparo de amostras
1D
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2D
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2.a- Proteômica – Preparo de amostras - MudPIT
500
100
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diogo Ribeiro Demartini
1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
50
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
% ACN
50
100
% ACN
50
100
% ACN
100
mM NaCl
A280/mL
1000
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2.b- Proteômica – Abordagens Botton upe Top down
http://en.wikipedia.org/wiki/Bottom-up_proteomics
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2.c- Proteômica – Resolução e analisadores
Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas
com base no tamanho dos peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina,
comparando-se o espectro de massa real com o teórico, obtido a partir dos bancos
de dados de proteínas.
Massa/carga
1529
1529.7
1529.73
1529.734
1529.7348
Mass Tolerance (Da)
1
0.1
0.01
0.001
0.0001
# Hits in Database
478
164
25
4
2
Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança
na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos
trípticos.
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2.c- Proteômica – Analisadores
1 – MS-Setor magnético: os íons moleculares são focalizados,
formando um feixe, são acelerados através de um campo
magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as
massas dos íons
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2.c- Proteômica – Analisadores
2- Quadrupolo: quatro eletrodos longos ou não, com
cargas opostas e paralelas
+ +
-
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2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo)
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2.c- Proteômica – Analisadores (quadrupolo)
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2.c- Proteômica – Analisadores
3- Ion trap: literalmente, armadilha de íons.
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2.c- Proteômica – Analisadores (ion trap)
- Transmissão em feixes;
- Armazenamento temporário dos íons;
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2.c- Proteômica – Analisadores
3- TOF: time of flight
TEMPO DE VÔO DEPENDE DA ENERGIA CINÉTICA
TOF
TOF/TOF
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1
2
 m 
t =
 .D
 2eV 
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2.c- Proteômica – Analisadores (TOF)
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2.c- Proteômica – Analisadores (TOF)
Rápido
Fácil de usar
Resolucão moderada
Moléculas grandes ( 70 kDa…)
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2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
PEPTÍDEO
PEPTÍDEO
PROTONADO
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2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
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2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
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2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
Sequenciamento de novo de proteínas
Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de
fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que
correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.
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Espectrometria de massas e proteômica
2.c- Proteômica – MS/MS e fragmentacão de peptídeos
A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela
determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso
do exemplo, os íons y.
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Espectro MS/MS do peptídeo tríptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.
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AA Codes
Mono.
AA Codes
Mono.
Gly
G
57.021464
Asp
D
115.02694
Ala
A
71.037114
Gln
Q
128.05858
Ser
S
87.032029
Lys
K
128.09496
Pro
P
97.052764
Glu
E
129.04259
Val
V
99.068414
Met
M
131.04048
Thr
T
101.04768
His
H
137.05891
Cys
C
103.00919
Phe
F
147.06841
Leu
L
113.08406
Arg
R
156.10111
Ile
I
113.08406
CMC
Asn
N
114.04293
Tyr
Y
163.06333
-
-
-
Trp
W
186.07931
161.01467
Espectrometria de massas e proteômica
2.d- Proteômica e a análise de dados
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Espectrometria de massas e proteômica
2.d- Proteômica e a análise de dados
 Comparação de massas reais obtidas no
equipamento, com massas teoricas;
 Rastreamento contra bancos de dados;
 MASCOT: socore
 SEQUEST: Xcorr
 Escores diferentes para um “hit”;
 Número de peptídeos únicos que identificam uma
proteína
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Espectrometria de massas e proteômica
QUANTIFICATION BASED ON
NUMBER OF ACQUIRED MS2 SPECTRA
MS2
Nano-LC
intensity
Spectra 1
Peptide 1
Spectra 2
Peptide 2
Time (min)
intensity
MS
Spectra 3
Peptide 3
m/z
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m/z
Espectrometria de massas e proteômica
60 min acquisition time
36,000 acquired spectra/hour
5-10 scans/second
intensity
Nano-LC
Time (min)
MS
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MS2
Espectrometria de massas e proteômica
Spectrum 1
Peptide 1
AAELTNLFES
Spectrum 2
Peptide 2
DNGMHALIIYDDLSKQAVAY
Spectrum 3
Peptide 3
MS2
TGSIVDVPAGKAMLG
MELSPRAAEL TNLFESRIRN FYANFQVDEI GRVVSVGDGI AQVYGLNEIQ AGEMVLFANG
VKGMALNLEN
ENVGIVVFGG
KRTGSIVDVP AGKAMLGRVV DAMGVPIDGR
HIGH
CONFIDENCE
MATHINGDTAIKEGDLV
CRITERIA
ATPase
alpha subunit
: gi 140325074
GALSDHEQRR
VEVKAPGILE
RKSVHEPMQT GLKAVDSLVP IGRGQRELLI GDRQTGKTTI
AIDTILNQKQ INSRATSESE TMYCVYVAIG QKRSTVGQLI QTLEEANALE YSILVAATAS
- PROTEIN PROBABILITY: >95%
RDNGMHALII
YDDLSKQAVA
- DPAPLQFLAP
Minimun of 2YSGCAMGEYF
unique non-overlapping
peptides
- VFYLHSRLLE
Xcorr:
RAAKRSDQTG AGSLTALPVI ETQAGDVSAY
+1; 1.5
YRGIRPAINV GLSVSRVGSA AQLKAMKQVC GSSKLELAQY
+2: 2.0
LNRGARLTEV
+3: 2.5 PKQPQYAPLP IEKQILVIYA AVNGFCDRMP
QALKGGLTNE RKMEPDAFLK ERALALI
ATPase alpha subunit : gi 140325074
Diogo Ribeiro Demartini
SEQUEST algorithms
YRQMSLLLRR
TM algorithms
ScaffoldPPGREAFPGD
IPTNVISITD GQICLETELF
REVAAFAQFG SDLDAATQAL
LDRISQYEKA IPNSVKPELL
Espectrometria de massas e proteômica
2.e- Proteômica quantitativa
 Label-free: livre de marcação
 Labelled:
 iTRAQ
 marcação isotópica (18O)
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