Q5. Você trabalha em uma empresa que analisa amostras biológicas vindas de laboratórios de pesquisa e
centros de biotecnologia. Você recebe de seu chefe uma amostra (15 mL) com as seguintes instruções:
a) determine se existe lisina livre; em caso positivo, forneça a sua concentração na amostra.
Resposta: Lys  3,34 min e 10.282nC.min de área do pico correspondente a este aminoácido
Cálculo:
18465 nC.min – 10,262 µM
10.282 nC.min – x = 5,71 µM
Amostra(15mL)  alíquota (1 mL)  diluição de 100 X  injetada (25 µL)  Lys (5,71 µM)
Então: 5,71 X 100 = 0,571 µM de Lys ou 0,571mM ou 0,571.10-3 M
b) sabendo que a amostra contém grande quantidade de hemoglobina e lipídeos e a sua preparação incluiu a
adição do detergente Triton X-100, determine a massa total de proteínas usando uma curva-padrão feita com
albumina de soro bovino e o reagente de Bradford (Abs525 nm versus massa de proteína).
Resposta: A presença dos lipídeos e Triton X-100 interfere na detecção das proteínas quando o método de
Bradford é empregado para tal finalidade. Portanto, não fiz a referida medida porque não seria confiável. Além
disso, a curva-padrão deveria ter sido construída em 595 nm e não em 525nm.
b) forneça a massa total de lipídeos na amostra.
Resposta: 2 mL amostra + 4 mL água + 12 mL MeOH/CHCl3 (2:1, v/v) = 18 mL /3 = 6 mL + 10 mL  2,54 mg.
Portanto, 2,54 mg X 3 =7,62 mg em 2 mL  3,81 mg/mL X 15 = 57,15 mg
d) sabendo que nela existem proteínas de massas molares nas faixas de 9-12 kDa, 20-28 kDa e 45-60 kDa,
realize uma cromatografia de troca iônica que separará os 3 diferentes grupos; forneça o perfil cromatográfico
(cromatograma) obtido.
Resposta: A menos que tais proteínas apresentem cargas líquidas diferentes em um dado pH, isso não
ocorrerá. Os pIs não foram fornecidos e, portanto, não dá para saber. Neste caso,este tipo de cromatografia
não será apropriada e, por isso, eu não fiz. Seria melhor fazer a cromatografia de filtração em gel ou de peneira
molecular ou de exclusão molecular, que separaria as porteínas em questão.
Você segue algumas das instruções, mas contesta outras e não as segue. Realiza, portanto, o seguinte
trabalho experimental:
1. Você retira da amostra uma alíquota de 1 mL e dilui 100 vezes com água. Da solução diluída você injeta 25
µL em um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência que emprega (i) uma coluna de troca-iônica
preenchida com polímero aminado de carga positiva no pH 12 empregado e (ii) detecta os aminoácidos eluidos
da coluna. O cromatograma obtido revela a eluição de 2 compostos após 20,14 e 3,34 min, cujas áreas do picos
correspondentes são 5.203 e 10.282 nC*.min, respectivamente. Você também analisa uma mistura de
aminoácidos de concentração conhecida (10 µM para todos e 5 µM para Cys), que fornece os seguintes
resultados:
Retenção (min)
Aminoácido
Área do pico (nC*.min)
Concentração [µM]
1,85
Arginine
27.975
10,216
3,35
Lysine
18.465
10,262
5,55
Alanine
11.980
10,072
5,86
Threonine
22.175
9,896
6,22
Glycine
13.478
10,203
7,03
Valine
10.317
10,008
8,05
Serine
21.526
9,903
8,29
Proline
19.366
9,906
10,17
Isoleucine
10.001
9,916
10,80,
Leucine
8.778
10,111
11,13
Methionine
22.643
10,075
20,13
21,22
23,01
23,25
24,08
26,37
Histidine
37.430
10,038
Phenylalanine
24.750
9,817
Glutamate
5.609
9,890
Aspartate
9.122
10,191
Cisteina
26.137
5,051
Tyrosine
26.614
9,905
total
316.367
165,480
2. Você retira uma alíquota de 2 mL da amostra biológica recebida, acrescenta a ela água (4 mL) e 12 mL
da mistura MeOH/CHCl3 (2:1; v/v). Após agitação vigorosa por 24 horas seguida de filtração em papel, você
separa 1/3 do total do volume, adiciona 10 mL de CHCl3 e realiza a separação entre as fases aquosa e
orgânica em funil apropriado. Em seguida, você coleta a fase orgânica, seca sobre Na2SO4, elimina
completamente o solvente e pesa o resíduo obtido (2,54 mg).
Que informações você fornece ao seu chefe e que justificativas usa para as instruções contestadas que não
seguiu? Responda referindo-se aos itens a-d acima.