Bruna de Carvalho Sorrentino
Tiago Henriques Moreira
Fisiologia Renal
3º período – Medicina
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Macaé, 25 de Julho de 2012
Sat1:

Transportador de ânion sulfato 1;

Também denominado Slc26a1;

Localizado na membrana basolateral dos rins e
segmentos distais do intestino (íleo distal, ceco e cólon
proximal); e na membrana sinusóide dos hepatócitos;

Medeia o transporte epitelial de oxalato e sulfato;

Importante papel na homeostase do oxalato e sulfato.

O gene do Sat 1 está localizado no Exon 2/ Íntron 2 do
gene da alfa-L- iduronidase (IDUA).
Urolitíase:

O oxalato de cálcio, produto da excreção
urinária, pode formar cristais que ao se
agregarem podem formar cálculos renais no
sistema urinário.
Hepatotoxicidade:

O sulfato é essencial para a fase II da
detoxificação no fígado, e é altamente
reabsorvido pelos rins.
Objetivo principal do estudo:

Determinar as funções fisiológicas do
transportador Sat1 na regulação da
homeostase do oxalato e do sulfato.
Métodos
e
Resultados:
1. Construção do vetor alvo:

Fragmentos de Sat 1 foram multiplicados
por PCR para se criar o fragmento alvo. A
estratégia utilizada para a criação do
fragmento alvo consiste da troca do Exon
3 por
um cassete de resistência à
Neomicina.
2. Criação e identificação de
camundongos Sat1-/- :

O fragmento alvo é eletroporado para
células embrioblásticas de camundongo;

Células embrioblásticas positivas são
injetadas em blastócitos CD1, que são
implantados na fêmea receptora;

Camundongos quiméricos foram cruzados
com heterozigóticos, a fim de produzir
camundongos Sat1-/-.
3. Determinação do genótipo dos
camundongos:

O fragmento do alelo recombinante de Sat
1 foi amplificado por PCR, a fim de se
obter o genótipo dos camundongos;

O transportador Sat 1, nos camundongos
Sat1-/-, encontra-se ausente nas vesículas
da membrana basolateral dos rins, fígado,
íleo distal, ceco, cólon proximal.
4. Análise do RNA:

RNA total é separado em gel em estado tampão, e
transferido para membranas de nylon.

Os borrões formados são injetados com cDNA de Sat1;

RNA total foi transcrito reversamente usando hexâmeros
aleatórios e transcriptase reversa virótica (Progen);

Primer P8 (exon 2) e P9 antisense (exon 4) foram usados
para amplificar os fragmentos de cDNA Sat1;
5. Preparação da vesícula de membrana
e estudos de transporte:

Vesículas de membrana basolateral (BLMVs) e da borda
em escova (BBMVs) foram isoladas do rim, fígado e
intestino, e pré-incubadas em solução tampão;

A absorção de sulfato e oxalato foi medida pela técnica de
filtração rápida;

Proteínas da BLMV foram separadas em gel e transferidas
para a membrana de nylon;

Protéínas Sat1 foram detectadas usando anticorpos para
Sat1.
Sat1-/- : Diminuição no transporte de oxalato e sulfato
na membrana basolateral dos rins, fígado, íleo distal,
ceco e cólon proximal.
6. Análise bioquímica:





•
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•
Sangue: coletado da veia submandibular;
Urina: coletada por micção espontânea prévia à coleta de sangue;
HCl foi adicionado a amostras de plasma e urina; as amostras
foram congeladas para evitar a precipitação de oxalato e
oxalogênese.
Os níveis de atividade do gene IDUA no rim e fígado foram
avaliados;
Foram medidos os níveis de:
Sulfato;
Oxalato;
Creatinina;
PO4- , Na+ , K+ , Cl- , Ca2+ plasmáticos;
Glicolato urinário;
Proteínas na urina;
pH;
H2O cecal;
7. Análise histopatológica:

Tecidos foram dissecados em ~ 50 volumes com 10%
de tampão de formalina, fixados por 3 dias, e imersos
em parafina;

Tecidos foram seccionados, marcados para detecção
de cristais de oxalato de cálcio, e examinados por
microscopia de luz;

Seções do fígado apresentaram degeneração e
necrose severas.
Urolithiasis in Sat1–/– mice. (A and
B) Representative H&E-stained
kidney sections showing infiltration
of leukocytes (arrow) around the
renal cortical vessels in 100% of
Sat1–/– mice (n = 8), absent in
Sat1+/+ mice.(C–F) Representative
Yasue-stained kidney (C and D)
and bladder (E and F) sections
showing calcium oxalate stones
(dark staining) in kidney tubules of
47% Sat1–/– mice (n = 15) and
bladders of 26% Sat1–/– mice (n =
19), but not in any Sat1+/+ mice (n
= 10). Gross histological analyses
of additional tissues in which Sat1
is expressed (liver and brain)
showed no structural differences
between Sat1–/– and Sat1+/+ mice
(not shown). Scale bars: 100 ìm (A
and B); 500 ìm (C and D); 2 mm (E
and F).
8. Administração de APAP:

Acetaminofeno (APAP) foi dissolvido em
soro, filtrado e esterilizado;

Com ~ 3 meses, os camundongos
receberam injeção de APAP, morrendo
entre 2 a 12 hs após administração.
Necrose hepática após administração de APAP:
(C and D) Representative H&E-stained liver sections of Sat1+/+ and
Sat1–/– mice (n = 6–7 per group) 12 hours after administration of 250
mg/kg APAP, showing liver necrosis in Sat1–/– mice.
Nos camundongos Sat1-/- :

Não aconteceram diferenças no peso corporal, tamanho do
rabo ou outra característica corporal que distinguisse
camundongos Sat1-/- dos Sat1+/- ou Sat1+/+. Porém, foram
observadas diferenças histológicas;

As veias corticais renais sofreram infiltração por leucócitos:
sugestiva de obstrução ureteral ou uropatia obstrutiva;

Cristais de oxalato foram observados nos túbulos corticais
renais e na bexiga;

Aumento da concentração plasmática do oxalato e diminuição
da concentração do sulfato;

Aumento do sulfato e diminuição do oxalato no conteúdo cecal.
Sat1 e IDUA:

Os genes Sat1 e IDUA são sobrepostos;

Distorções seletivas no gene IDUA não levaram a
alterações nos níveis de RNAm para Sat1;

Ausência de mudanças na atividade funcional do IDUA
em Sat1-/- sugere que efeitos antisense não atuem de
forma relevante na regulação da expressão dos genes
Sat1 e IDUA.
Sat1-/- e oxalato:

Os níveis elevados de oxalato no plasma,

aumento da razão oxalato/creatinina na urina,

manutenção da razão glicolato/creatinina na urina
(indicador da produção hepática de oxalato),

e redução no transporte de oxalato na membrana
basolateral de segmentos do intestino distal:
SUGEREM QUE >
Hiperoxalúria e hiperoxalemia:
A hiperoxalúria
nos camundongos Sat1-/é devido à hiperoxalemia,
e não a alterações do oxalato
nos túbulos renais.

Sat1-/- e sulfato:

Diminuição significante do sulfato no soro,

aumento da razão sulfato/creatinina na urina,

e aumento no índice de excreção fracionada (FEI)
de sulfato:
SUGEREM QUE >
Hiposulfatemia:

Ocorre provavelmente devido à elevada excreção
renal de sulfato em camundongos Sat1-/-.

Há grande redução do transporte de sulfato
através da membrana basolateral renal e
sinusoidal hepática,

sugerindo que Sat1 é o transportador de sulfato
predominante na membrana basolateral do túbulo
proximal renal, e na membrana sinusoidal dos
hepatócitos.
Sat1-/- e a hepatotoxicidade:

O esgotamento de sulfato pela ausência
de Sat1 nas membranas sinusoidais dos
hepatócitos, onde facilitam o importe de
sulfato para as reações de sulfonação, e
a hiposulfatemia, acarretam em lesões
hepáticas induzidas por fármacos como
o APAP.
Referência bibliográfica:
Dawson PA, Russell CS, Lee S, McLeay
SC, Van Dongen JM, Cowley DM,
Clarke LA, Markovich D. Urolithiasis and
hepatotoxicity are linked to the anion
transporter Sat1 in mice. J Clinical
Investigation. 2010; 120 (3):706-712.