Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho
“O PAPEL DA VIA HEDGEHOG NAS
DOENÇAS INFLAMATÓRIAS
INTESTINAIS”
Projeto de Tese de Mestrado
Agnes Naomi Yoshimoto
Orientador:
Heitor Siffert Pereira de Souza
Prof. Adjunto de Clínica Médica da Faculdade de Medicina da UFRJ
Doença inflamatória intestinal
 Doenças
inflamatórias intestinais, de
etiologia multifatorial não totalmente
conhecida, podendo ter acometimento
extra-intestinal, curso crônico e variável,
com períodos de atividade e de remissão
Doença inflamatória intestinal
Doença de crohn
Retocolite ulcerativa

> 90%

Grande impacto na sociedade:


Bimodal : acomete mais jovens dos 20 aos 40 anos e > 60 anos
(15%)
Incidência : RCU 10 a 20 /100000 e DC 5 a 10 /100000, vem
aumentando

Etiologia desconhecida

Resposta terapêutica imprevisível
Caracterizando RCU e DC
UC
CD
Cólon
Em todo Aparelho GI
Mucosa e
Submucosa
Transmural
Idade de Início
15-25
15-25
Prevalência (por
100.00)
35-100
10-100
Curativo
Não curativo
Local
Extensão da
Inflamação
Cirurgia/Ressecção
Manifestações clínicas
Retocolite Ulcerativa
Doença de Crohn
–
Diarréia Hemorrágica
–
Diarréia
–
Cólica abdominal
–
Constipação
–
Tenesmo
–
Dor abdominal crônica
–
Perda de peso
–
Perda de peso
–
Sintomas sistêmicos
–
Febre
–
Manifestações extraintestinais
–
Doença perianal
–
Manifestações extraintestinais
–
Os sintomas dependem da
extensão e gravidade da
inflamação
–
Os sintomas variam de acordo
com a localização da doença
Achados endoscópicos da DII
RCU
DC
Reprinted by permission of Blackwell Science, Inc. Lashner BA, Brzezinski A. In: Di Marino AJ,
Benjamin SB (eds). Gastrointestinal Disease: An Endoscopic Approach. 1997:582-592.
Localização e extensão DII
RCU
DC
40%
Colite Distal/
30%
Lateral
Proctite Esquerda
30%
Extensa/
Pancolite
40%
Ileocolite 25%
Colite
30%
Ileíte/
Jejunoileíte
5% Gastroduodenite
Achados histopatológicos
CU
DC
Todas as amostras inflamadas
Amostras normais
Biópsia distal de espécime mais severa Nenhuma amostra de inflamação
Doença mucosa
Doença transmural
Abcesso cripto
Ingurgitação capilar e venular
Sem tecido/fibrose de granulação
Infiltrado mononuclear
Linfangiectasia
Tecido/fibrose de granulação
Infiltrado mononuclear e microabscesso cripta
Coliten transmural do cólon
ETIOPATOGENIA DAS DII
COMENSAIS
ALIMENTOS
PATÓGENO
FATORES
GENÉTICOS e
AMBIENTAIS
ESTIMULAÇÃO
SISTEMA
IMUNITÁRIO
MEDIADORES SOLÚVEIS
SISTEMA
NÃO-LINFÓIDE
MOLÉCULAS DE ADESÃO
CITOCINAS
ANTICORPOS
AUTOANTICORPOS
FATORES DE
CRESCIMENTO
INFLAMAÇÃO
EICOSANÓIDES
ENZIMAS
PROTEOLÍTICAS
MRO
NO
NEUROPEPTÍDIOS
Adaptado de: Fiocchi C, Gastroenterology 1998; 115: 182
Genética

Etiologia poligênica

Identificados loci de suscetibilidade IBD1-IBD9

Maioria requer confirmação e validação funcional





Polimorfismos do CARD15/NOD2 no locus IBD1 predispõem
a DC (Hugot et al. 2001; Ogura et al., 2001)
Variantes do SLC22A4/A5 no locus IBD5 predispõem a DC
(Petekova et al., 2004)
Variantes do DLG5 no locus IBD5 predispõem a DC
(Stoll et al., 2004)
Variantes do ICAM-1 no locus IBD6 têm associação com DII
(Neville et al., 2004)
Associação de variantes com DC têm influência sobre
fenótipo, mas sofrem variação populacional
Microflora entérica
Normal ou anormal ?
Alterações quantitativas e qualitativas
Redução de Bifidobacterium e Lactobacillus
Aumento de bactérias anaeróbicas
Perda da tolerância para bactérias normais?
Reposta imunitária contra bactérias de baixa patogenicidade?
Etiologia
Genética
Ambiental/
Infecciosa
Fatores imunitários e não imunitários
Inflamação intestinal crônica:
desequilíbrio de mediadores imunológicos
Polarização da reposta imunitária nas DII
Doença de
Crohn
Retocolite
ulcerativa
ALIMENTOS
COMENSAIS
Linf. T
PROLIFERAÇÃO
PATÓGENOS
Linf. T
APOPTOSE
INFLAMAÇÃO
FISIOLÓGICA
DOENÇA DE
CROHN
INFLAMAÇÃO
CONTROLADA
Evolução da terapia das DII: resultado da
compreensão dos mecanismos patogênicos
Década
Medicamento
1940
Sulfassalazina
1950
Corticóides, ACTH
1960
Azatioprina
1970
5-ASA
1980
6-MP, metronidazol, dieta elemental
1990 (início)
Ciclosporina, metotrexate, budesonida
1990 (final)
T. biológicas, pró-bióticos, leucaferese
2000
Modulação da sobrevida celular
Via de sinalização
Hedgehog
Via de sinalização – Hedgehog

pertencem a uma família de moléculas de
sinalização intracelular originalmente
identificadas na Drosophila, gene descoberto
1992

Com 3 homólogos em vertebrados (Ihh, Dhh,
Shh), dentre os quais Shh tem sido a mais
bem estudada

Sintetizada como uma proteína precursora
de 45 kDa, Shh sofre autoproteólise gerando
um domínio C-terminal e outro N-terminal
(atividade sinalizadora). O domínio Shh-C
atua como colesterol-transferase,
modificando a estrutura de Shh-N
Physiol Rev • VOL 87 • OCTOBER 2007
Via de sinalização – Hedgehog
Shh interage com um complexo receptor composto de duas proteínas transmembrana, patched (ptc) e smoothened (smo). Ptc constitui a sub-unidade de
ligação, enquanto que smo é responsável pela transdução do sinal que, por
sua vez, é mediada pela família Gli de fatores de transcrição (Gli1, 2 e 3).
Via de sinalização – Hedgehog

A via de sinalização Shh é fundamental na regulação de processos de
desenvolvimento embrionário de vários órgãos e tecidos (morfogênese do
TGI), e sua reativação estaria associada ao aparecimento de tumores
malignos (pâncreas).

A via também atua na homeostasia do cólon adulto. Evidências sugerem
seu envolvimento na maturação dos enterócitos.

Enterócitos de ratos tratados com ciclopamina ( inibidor do Smo),
apresentou aumento Bmp4 ( alvo epitelial Wnt ) das bases da cripta em
direção ao topo das criptas

Acredita-se que a via hegdeghog atuaria restringindo a atividade Wnt na
base da cripta
Via de sinalização – Hedgehog

Recentemente, foi demonstrado a presença da via Shh como componente
fisiológico da resposta de linfócitos T periféricos e também em processos
imunopatológicos

A análise do ciclo celular de linfócitos T CD4 isolados do sangue e
estimulados com Shh, revelou que a adição exógena de Shh aumenta a
proliferação celular de células ativadas via TCR e o bloqueio com anticorpo
anti-Shh diminui a proliferação .

Os mecanismos pelos quais Shh contribui para a homeostase de células
imunitárias e a neovascularização são pouco compreendidos. É possível
que a via Shh esteja envolvida na patogênese das DII.
Projeto
A via de sinalização Shh está envolvida na
proliferação de células inflamatórias da
mucosa intestinal e na angiogênese,
constituintes fundamentais do processo
inflamatório crônico das DII
Objetivos e metas
1) Investigar a expressão
e modulação da via Shh
na mucosa intestinal de
pacientes com DII.

1.1 localizar, identificar e
quantificar as células que
expressam Shh na mucosa
intestinal de pacientes com DII
e em controles;

1.2 estudar a expressão e
modulação de Shh em
mononucleares isolados da
lâmina própria intestinal;
2) Investigar a atividade
biológica de Shh nas DII.

2.1 analisar proliferação e
apoptose de células
mononucleares da lâmina própria
isoladas da mucosa intestinal e
tratadas com adição ou bloqueio
de Shh;
 2.2 analisar a expressão de
citocinas pró-inflamatórias e
regulatórias, e de fatores
angiogênicos, da mucosa
intestinal tratada com adição ou
bloqueio de Shh;
 2.3 analisar as vias de sinalização
que regulam a transdução de Shh.
Material e métodos

Pacientes





Espécimens cirúrgicos e biópsias endoscópicas de áreas inflamadas e nãoinflamadas da mucosa intestinal de pacientes com DII e de controles
Adultos de qualquer origem etnica que tenham concordado e assinado o termo
de consentimento já aprovado pelo CEP
O diagnóstico de DII será baseado em critérios clínicos, laboratoriais,
radiológicos, endoscópicos, e histológicos usuais.
Variáveis relacionadas com o diagnóstico de DII (atividade clínica da doença,
extensão do acometimento intestinal, tempo de doença, tipo de tratamento)
serão registradas e consideradas na análise final de resultados .
Serão utilizados os índices de atividade de doença Harvery e Bradshaw para
DC, e o de Truelove & Witts, para RCUI .
Material e métodos

Pacientes



Critérios de exclusão: risco teórico excessivo de sangramento, ou de intolerância
a procedimentos endoscópicos prolongados e pacientes em uso de AntiTNF.
20 ml de sangue periférico poderão ser coletados no momento do procedimento
endoscópico ou cirúrgico após terem assinado termo de consentimento livre e
informado.
O estudo apresentará um caráter confidencial durante todas as etapas do
projeto, sendo os dados pessoais conhecidos apenas pelo investigador principal.
Material e métodos

1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa
intestinal de pacientes com DII

1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh
na mucosa intestinal.


 técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh
N-19, anti-ptc C-20 e anti Gli1)  A análise das lâminas será feita ao
microscópio óptico, com o auxílio de um programa computadorizado para
captura e análise de imagens
 estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia
confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via
Shh).
Material e métodos

1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em
mononucleares isolados da lâmina própria intestinal.



Células mononucleares da lâmina própria intestinal (LPMC) são isoladas
de biópsias endoscópicas ou tecido cirúrgico
Células mononucleares do sangue periférico (PBMC) serão separadas por
centrifugação de 20 ml de sangue em gradientes de Ficol-Hypaque.
As LPMC e as PBMC isoladas serão analisadas a fresco e em culturas
estimuladas com fatores de crescimento (IL-2, através do receptor de
linfócitos T (TCR), utilizando anti-CD3, com ou sem co-estimulação com
anti-CD28, e a exposição a produtos bacterianos (LPS).
Material e métodos

1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em
mononucleares isolados da lâmina própria intestinal.



As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à
expressão de proteínas da via Shh.
LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro
(mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. Primers especificos para
Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados.
Western blot e imunohistoquímica/imunofluorescência de slides de
cytospin com LPMC.
Material e métodos

2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII

2.1 analisar a expressão de citocinas e fatores
angiogênicos.

Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC,
tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, ou do
anticorpo anti-Shh, ou de ciclopamina, serão coletados para a
análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e
TGFβ) por meio de ELISA.
Material e métodos

2.2 analisar proliferação e apoptose de células mononucleares
isoladas da lâmina própria intestinal tratadas com adição ou
bloqueio de Shh.



As LPMC isoladas são colocadas em cultura na presença ou ausência do
peptídeo biologicamente ativo Shh amino-terminal (5 e 20 ug/ml), ou do
anticorpo anti-Shh (50 e 2500 ug/ml), ou de ciclopamina (5uM), um inibidor
especifico da via Shh, com ou sem estimulação adicional.
Para a análise da proliferação celular utilizaremos marcador intracelular
(Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit). Após a marcação as células são colocadas
em cultura sem estimulação ou com anti-CD3 mAb (OKT3; 10 µg/ml), anti-CD28
(5µg/ml) e IL-2 (20 U/ml).
No quarto dia, as células coletadas serão analisadas por citometria de fluxo.
Para a avaliação da viabilidade celular e fases precoce e tardia de apoptose,
células serão marcadas com Annexin-V/7-AAD Kit .
Material e métodos

2.3 analisar as vias de sinalização que regulam a
transdução de Shh.

Para a avaliação das vias de sinalização que regulam a transdução de
Shh, trataremos células em cultura com os inibidores LY294002, da
phosphoinositide 3-kinase (PI3-kinase), ou PD98059, da mitogenactivated protein kinases (MAPK), na presença ou ausência de antiCD3+anti-CD28, IL-2, ou LPS. Lisados celulares serão analisados por
Western blot para a avaliação dos níveis de pAkt, p38, pErk, e de Shh.
Material e métodos
Análise estatística

Os dados obtidos em cada etapa do projeto serão armazenados em
planilhas diferentes para posteriormente serem analisados com o auxílio de
um programa de análise estatística por computador (SPSS for Windows).

Será realizada estatística descritiva para cada variável de desfecho. Os
resultados de diferentes grupos serão comparados pelo teste-t, ou pelo
teste t-pareado para comparações antes e após tratamento, ou de áreas
acometidas e não-acometidas dos mesmos indivíduos, e por tabelas de
contingência, ou por ANOVA com comparações múltiplas pareadas.

Coeficientes de correlação serão utilizados para análise de variáveis
numéricas quantitativas. O nível de significância será estabelecido em
p<0,05.
Resultados preliminares

1) Investigar a expressão e modulação da via Shh na mucosa intestinal de
pacientes com DII
 1.1 localizar, identificar e quantificar as células que expressam Shh na
mucosa intestinal.


 técnicas de imunohistoquímica, (anticorpos monoclonais tais como o anti-Shh
N-19, e anti Gli1)  A análise das lâminas foi feita ao microscópio óptico, com o
auxílio de um programa computadorizado para captura e análise de imagens
Controle
DC
RCU
Anti Gli 1
6
8
7
Anti Shh
3
3
3
 estudos de imunofluorescência dupla serão analisados com microscopia
confocal (identificar as principais células que expressam as proteínas da via
Shh) : 36 casos (11 pacientes controle/ 11 com DC e 14 com RCU) de lâminas
já cortadas
Resultados preliminares
imunohistoquimica Shh - controle
Resultados preliminares
imunohistoquimica Shh - DC
Resultados preliminares
imunohistoquimica Shh - DC
Resultados preliminares
imunohistoquimica Shh - RCU
Resultados preliminares
imunohistoquimica Shh - RCU
Resultados preliminares
contagem de células
% de células positivas na
totalidade
da
lâmina
própria
30
17.6
Shh
20
9.6
10
4.5
0
P<0.046 entre grupo controle eN =
DC
3
3
3
control
Crohn
RCUI
Resultados preliminares
imunohistoquimica Gli1 - controle
Resultados preliminares
imunohistoquimica Gli1 - DC
Resultados preliminares
imunohistoquimica Gli1 - DC
Resultados preliminares
imunohistoquimica Gli1 - RCU
Resultados preliminares
imunohistoquimica Gli1 - RCU
Resultados preliminares
contagem de células
% de células positivas na
totalidade
da
lâmina
própria
40
gli-1
30
29.5
22
20
10.7
10
P<0.02 entre grupo controle e
DC
0
N=
6
8
7
control
Crohn
RCUI
Resultados preliminares
 Shh
– marcação periférica
Shh / controle
Shh / DC
Shh / RCU
presente ++
Presente +
Presente +
Base criptas
Presente ++
Presente +
Lâmina própria
Presente ++
Presente +
Epitélio
superficial
Resultados preliminares
 Gli
1 – marcação forte nuclear
Gli / controle
Gli / DC
Gli / RCU
presente +++
Presente +
Presente +
Base criptas
Presente ++
Presente +
Lâmina própria
Presente +++
Presente +
Epitélio
superficial
Resultados preliminares

Sabemos que a via hedgehog encontra-se presente na homeostasia
dos enterócitos de cólon adulto e nos linfócitos T.

Marcação do Anti-Gli 1 é nuclear e Anti Shh é periférica.

Nas lâminas analisadas de cólon com Doença de Crohn marcadas
com Anti Shh e Anti Gli1 observam-se maior marcação na lâmina
própria, assim como na RCU, ou seja há marcação das proteínas
da via hedghog nas células mononucleares que encontram-se
aumentados nessa patologia e também nas bases das criptas.

A demonstração do aumento da expressão da via Shh na mucosa
intestinal apóia a hipótese do aumento da proliferação celular das
LPMC e ainda sustenta o fenômeno de angiogênese local.
Material e métodos

1.2 estudar a expressão e modulação de Shh em
mononucleares isolados da lâmina própria intestinal.



As células serão analisadas com relação à mensagem (mRNA) e à
expressão de proteínas da via Shh.
LPMC terão RNA extraído para a análise por RT-PCR de RNA mensageiro
(mRNA), que codifica Shh, ptc, Smo ou Gli1. Primers especificos para
Shh, ptc, smo, e Gli1 serão desenhados
15 amostras coletadas (8 controles, 4 RCU e 3 DC)
Material e métodos

2) Investigar a atividade biológica de Shh nas DII

2.1 analisar a expressão de citocinas e fatores
angiogênicos.


Sobrenadantes de cultura de órgãos ou de culturas de LPMC,
tratados por 24 horas com peptídeo Shh amino-terminal, e do
anticorpo anti-Shh, ou de ciclopamina, serão coletados para a
análise de citocinas (IFN-g, TNF-alpha, IL-17 e IL-10, VEGF e
TGFβ) por meio de ELISA.
Material de 8 controles, 4 RCU e 3 DC
Cronograma
Atividades / Bimestre
1
2
3
4
Pesquisa bibliográfica
X
X
X
X
Coleta de material
X
X
X
X
Histologia
X
X
X
Imunohistoquímica
X
X
X
Imunofluorescência/confocal
Culturas/ELISA
RT-PCR
Citometria de fluxo
Western blot/Cytospin
Tabulção e análise estatística
Redação de artigos I
Apresentação de resultados I
X
6
7
8
9
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
10
X
11
12
X
X
X
X
X
X
X
X
X
5
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
Bibliografia





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from flies to vertebrates. Exp Cell Res 1999;253:25-33.
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