BCM13042
Fundamentos de Análises de Proteínas
• Docentes
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Célia R Carlini
Charley C. Staats
Diogo R Demartini
Hugo Verli
• Súmula
– Aminoácidos e peptídeos: estrutura; estereoquímica; propriedades físico-químicas; curva de
titulação; ponto isoelétrico; ligação peptídica
– Proteínas: arquitetura de proteínas; tipos de estrutura secundária; enovelamento; modificações
pós-traducionais; mobilidade eletroforética; flexibilidade; catálise
– Métodos para determinação da estrutura de proteínas: RMN; cristalografia de raios-X;
Dicroísmo circular
– Espectometria de massas: metodologias de ionização; metodologias de análise.
– Métodos para determinação da quantidade de proteínas: gravimétrico; absorbância;
fluorescência; ninhidrina; biureto; lowry; azul de comassie; acido bicinchônico.
– Métodos de separação, purificação se sequenciamento de proteínas, peptídeos e aminoácidos:
precipitação; salting in; salting out; eletroforese; cromatografia liquida, ultracentrifugação;
química de Edman; métodos de separação de aminoácidos.
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Fundamentos de Análises de Proteínas
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22/11 Aminoácidos e peptídeos: Charley
23/11 Estrutura e determinação da estrutura de proteínas: Hugo
24/11 Métodos de quantificação, análise e purificação de proteínas: Célia
25/11 Espectrometria de massas e proteômica
29/11 – 02/12 Seminários
– 1 tópico por dia
– 5 grupos por tópico
• Tópico 1 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos
1.
2.
3.
4.
5.
Papéis Biológicos de D-Aminoácidos
Determinação de sequencia de aminoácidos/peptídeos (Edman, MS-MS, Dansylação)
Assinalamento de padrões (bioinformática)
Modificações pós-traducionais: tipos, funções e impactos em análises
Síntese de peptídeos para avaliação biológica
• Tópico 2 – Métodos de Análise e Caracterização de Peptídeos
6.
7.
8.
9.
10.
Eletroforeses (1D, 2D, nativa, zimogramas)
Cromatografia (troca iônica, hidrofóbica, fase reversa, afinidade)
Metodologias de quantificação de proteínas
Precipitação fracionada
Métodos Imunoquímicos
• Tópico 3 – Espectrometria de massas e proteômica
11.
12.
13.
14.
15.
MudPit / GELC – MS
Proteômica quantitativa comparativa
Metaloproteômica
Fosfoproteômica
Interatoma
• Tópico 4 – Determinação de estrutura
16.
17.
18.
19.
20.
RMN
Dicroísmo circular
Fluorometria
Cristalografia – Raios X
Determinação de motivos estruturais
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Fundamentos de Análises de Proteínas
Avaliação
• Apresentação de 1 item referente a cada tópico
• Respostas aos questionários aplicados pelos colegas
• Cada aluno deverá formular 1 questão sobre o item apresentado
• Os demais alunos deverão escolher 2 questões referentes a cada
tópico para responder
• As questões devem ser embasadas em um artigo científico. Esperase que a questão seja formulada a partir de um gráfico ou tabela
presente no artigo científico.
• O autor da questão será responsável pela correção.
• Aulas serão disponibilizadas junto ao endereço
www.ufrgs.br/laprotox
Sorteio
Amino-Ácidos
Estrutura geral dos
Aminoácidos
Quantos aminoácidos existem em
sistemas biológicos?
20 aminoácidos definidos por seu
códon no mRNA
Grupo R 5 grupos distintos
2 aminoácidos não usuais
Inserção depende de um elemento
cis no mRNA
Polar - aquoso
Apolar - lipídico
Polar - aquoso
Selenocystein
Pyrrolysine
Hypothetical scheme for the cotranslational insertion of pyrrolysine in response to a contextdependent UAG codon.
Ibba M , Söll D Genes Dev. 2004;18:731-738
©2004 by Cold Spring Harbor Laboratory Press
Formação de pontes de enxofre
Estereoisomeros
a-carbon is a chiral center
Two stereoisomers are called
enantiomers.
The solid wedge-shaped bonds
project out of the plane of paper,
the dashed bonds behind it.
The horizontal bonds project out of
the plane of paper, the vertical
bonds behind.
The Stereochemistry of Amino Acids
http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/amino_acids_chiral.gif
D-aminoácidos existem e são metabolizados
Serine-racemase
D-amino ácidos em proteínas?
Características físico-químicas
dos aminoácidos
Absorbância na região UV de aminoácidos aromáticos
Estudos conformacionais – Try fluorescence
Changes in low density lipoprotein receptor intrinsic tryptophan fluorescence upon calcium addition.
Dirlam-Schatz K A , Attie A D J. Lipid Res. 1998;39:402-411
©1998 by American Society for Biochemistry and Molecular Biology
Zwitterion = íon híbrido
Voet Biochemistry 3e
© 2004 John Wiley & Sons, Inc.
Efeito sobre o pKa do ambiente químico
Henderson/Hasselbach equation and pKa
Protonated form
HA ↔
Unprotonated form (conjugate base)
H+ + A-
Ka = [H+] [A-] / [HA]
[H+] = Ka [HA]/ [A-]
-log [H+] = -log (Ka [HA]/ [A-])
-log [H+] = -log Ka -log ([HA]/ [A-])
pH = p Ka - log ([HA]/ [A-])
Titulação de
um
aminoácido
Curva de titulação
Glutamato
Curva de titulação> Histidina
Anel indólico
Peptídeos
Formação da ligação peptídica
Níveis estruturais das proteínas
Como se definem estruturas
secundárias?
Distâncias interatômicas na ligação peptídicas
são menores que as de uma ligação amida
comum
Ressonância eletrônica
Ligação peptídica tem 50% de carácter de dupla ligação
rígida e coplanar
Ângulos de rotação da cadeia polipeptítica em torno de um carbono alfa
Cadeias
laterais
A
B
C
D
A
B
D
C
E
E
F
Gráfico de Ramachandran
F
O que é um domínio protéico?
Procura de domínios conservados
Localização da proteína pode trazer
informações sobre a sua função