Cinética Enzimática
Prof. Dr. Henning Ulrich
Influência do Substrato
 Concentração de substrato [S]: afeta a
velocidade da reação;
 Efeito de [S]: varia durante o curso de uma
reação S  P;
 Velocidade inicial (V0): [S] >> [E]  tempo
muito curto  [S] = constante.
Influência do Substrato
 [E] = cte
  [S] = V0  linear
  [S] = V0 
 V0 = Vmáx
Influência do Substrato
 Alguns casos a V0 não pode ser medida
• Não existe técnica experimental;
• Equação química não representa
transformação;
a
 Velocidade da reação:
• Velocidade
média de consumo ou
produção;
• Variação de uma propriedade no sistema.
Influência do Substrato
 Vitor Henri (1903): E liga-se ao S para
formar ES  passo obrigatório;
 Leonor Michaelis e Maud Menten (1913)
• E combina-se reversivelmente com S ES
E+S
• ES se rompe  E e P
ES
k2
k1
k-1
ES
E+P
Influência do Substrato
 Qualquer instante da reação: E e ES;
 [S]  = velocidade da reação  [S];
 Vmáx = todas as moléculas de E estiverem
na forma ES  enzima “saturada”;
  [S]: estado pré-estacionário   ES;
• Estado estacionário  [ES] = cte;
• V0  estado estacionário.
Equação Michaelis-Menten
 Curva:
possui
a
mesma forma para a
maioria das enzimas;
 Expressa
pela
Equação
de
Michaelis e Menten;
 Hipótese: limitante  quebra de ES  E + P.
Equação Michaelis-Menten
 Equação da velocidade para uma reação
catalisada enzimaticamente e com um único
substrato;
 Relação quantitativa entre a V0, a Vmáx e a
[S] inicial relacionadas através de Km.
Vmáx  S 
V0 
K m  S 
Equação Michaelis-Menten
Relação numérica:
V0 é metade de
Vmáx;
1
V0   Vmáx
2
km = “afinidade”
pelo substrato;
 Km  afinidade
 Vmáx é proporcional à [E].
Significado de Km e Vmáx
 Equação
Michaelis
e
dependência hiperbólica;
Menten
=
 Mecanismos de reação diferentes
catalisam reações com 6 ou 8 passos;

 Significado e magnitude de Vmáx e Km varia;
 Km: depende de aspectos específicos do
mecanismo de reação.
Significado de Km e Vmáx
k 2  k 1
Km 
k1
K2 << K-1  afinidade da enzima;
 K2 >> K-1;
 K2 e K-1 são comparáveis a Km  função
complexa;
 Vmáx: número de passos da reação e
identidade dos passos limitantes.
Significado de Km e Vmáx
E+S
K1
K-1
ES
K2
K-2
EP
K3
E+P
Enzima na saturação: EP e Vmáx = k3.[Et];
 Kcat = velocidade limitante de qualquer
reação  enzimas saturadas;
 Kcat e Km = ambiente celular, concentração
do substrato e química da reação.
Complexo enzima-substrato: ES
v (formação) = k1 [S] [E] { v (“degradação”) = k-1[ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Estado estacionário (“steady state”): [ES] = constante
v de formação = v de “degradação” ou: k1 [S] [E] = (k-1 + k2) [ES]
[S] [E] / [ES] = (k-1 + k2) / k1
{ (k-1 + k2) / k1 = Km
Constante de Michaelis
[ES] = [S] [E] / Km { [E] = [ET] – [ES] { [ES] = ([ET] – [ES]) [S] / Km
[ES] = [ET] [S] / Km – [ES] [S] / Km {[ES] + [ES] [S] / Km = [ET] [S] / Km
([ES] Km + [ES] [S]) / Km = [ET] [S] / Km
{
[ES] = [ET] [S] / Km + [S]
[ES] (Km + [S]) / Km = [ET] [S] /
Km
[ES]
=
[ES] = v / k2
[ET] ( [S] / Km + [S] )
[ET] = Vmax / k2
v / k2 = Vmax / k2 ( [S] / Km + [S] )
Variável dependente:
velocidade de reação,
função de [S].
Constante*:
velocidade
máxima
Variável independente:
concentração do substrato.
Constante de Michaelis:
KD aparente de ES.
* “Constante”: Vmax é função de [E]total
Parâmetros Cinéticos
 Exemplo:
Vo (g/L.h)
0,78
1,25
1,66
2,19
2,35
2,57
3,0
Vo (g/L.h)
[S] (g/L)
0,25
0,51
1,03
2,52
4,33
7,25
2,0
1,0
0,0
0
2
4
[S] (g/L)
6
8
Parâmetros Cinéticos
 Exemplo: Lineweaver-Burk
1
K
1
1
 m 

V0 Vmáx S  Vmáx
1/Vo (L.h/g)
1,6
1,2
1
1
 0,228
 0,3668
S 
V0
0,8
P ort ant o,
1
g
 0,3668 Vmáx  2,73
Vmáx
Lh
y = 0,228x + 0,3668
0,4
R2 = 0,9991
0,0
0
1
2
3
1/[S] (L/g)
4
5
Km
g
 0,228  K m  0,622
Vmáx
L
Inibidores Competitivos
 Forma
estrutural
competição;
=
substrato

 Porcentual de inibição  concentrações
e afinidade pela enzima.
Inibidores Competitivos
  [S]  Vmáx =
Km 
 Experimento
• 1º  [E], [S] = cte
• 2º  [E], [I] = cte
1/V0 x 1/[S]
Inibidores Competitivos
 Equação de
Michaelis e Menten
V  Vmáx 
Km
S 
1  I 


  S 
K I 
Lineweaver-Burk
K m 1  I  
KI  1
1
1




S 
V Vmáx
Vmáx
Inibidores Competitivos
 Relação entre as velocidades com e
sem inibidor
V0
Km
 1
 I 
VI
K I K m  S 
 [S]  = influência
do [I] desprezível.
Inibidores Não-Competitivos
 Ocupa outro sítio 
ES, EI e EIS;
 [S]  = não leva
todas as E 
produtiva;
 Vmáx  e Km normal.
Inibidores Não-Competitivos
 Equação da
velocidade:
V  Vmáx 
S 

I    S 1  I  
K m 1 

 K 
I 
 KI 

 Lineweaver-Burk
1 Km

V Vmáx

I   1  1
1 

 K I  S  Vmáx

I  
1 

 KI 
Inibidores Incompetitivos
 Bloqueio de ES;
 2 sítios ativos  I
se fixa no complexo
ES;
 ESI = não forma P;
 Vmáx  e Km 
Inibidores Incompetitivos
 Equação da velocidade:
Vmáx
 S 
1  I 
KI
V 
Km
 S 


I
1
KI
1 Km 1
1


 Lineweaver-Burke: 
V Vmáx S  Vmáx


I 


 1 
 KI 
Inibidores Incompetitivos
Inibidores Irreversíveis
 Combinam-se com um grupo funcional 
destruição;
 União covalente  inibidor e enzima.
 Vmáx  e Km =
Inibidores Irreversíveis
 Equação de
Michaelis e Menten:
VI  Vmáx  k 3  [ EI ]
S 
K m  S 
Inibidores Irreversíveis
 Lineweaver-Burk:
Km
1
1
1



VI Vmáx  K 3 EI  Vmáx  K 3 EI  S 
Influência do pH
 Valor de pH ótimo = atividade máxima;
 Velocidade da reação:  pH afasta do
ótimo;
 Influência do pH: análise dos grupos
dissociáveis;
 Ácidos (Brönsted): compostos capazes de
dissociar-se, liberando H+.
Influência do pH
HA  A + H+
 pH   HA   A 
 Aminoácidos:
 CH 2  COOH   CH 2  COO 
 CH 2  CH 2  CH 2  CH 2  NH 3
 H
a 
  CH 2  CH 2  CH 2  CH 2  NH 2
 H
 pH   -COO- captam prótons = -COOH;
 pH   -NH3+ são dissociados = NH2;
 Ligação eletrostática = -COO- -- NH3+.
b
Influência do pH
 pH ótimo depende do número e tipo de grupos
ionizáveis  estrutura primária;
 Variações do pH  afeta substrato com grupos
ionizáveis;
 Estabilidade da enzima: temperatura, força
iônica, concentração de substratos ou cofatores
da enzima e concentração da enzima, entre
outros.
Influência do pH
 pH 5 e 8 = não afeta a
atividade;
 Declínio entre pH 6,8-8
e 6,8-5 = forma iônica não
adequada;
 5 > pH > 8 = inativação
irreversível.
Influência da Temperatura
  T   velocidade de reação =  energia
cinética;
 T muito elevadas = desnaturação da
enzima
• Rompidas as pontes de hidrogênio 
alterações estruturas = nova conformação;
• T desnaturação  pouco acima da T
ótima.
Influência da Temperatura
 Enzimas  PM  1 cadeia polipeptídica e
pontes dissulfeto = estáveis ao calor;
 Efeito da T = pH, força iônica e a presença
ou ausência de ligantes;
 Substratos
protegem
desnaturação.
a
enzima
da
Influência da Temperatura
 K é função  da T  Lei de Arrhenius
k  k0  e

RT
Influência da Temperatura
 Enzimas são termolábeis 
enzimática = inativação términa
k  k e
'
'
0
reação

RT
Efeito da T na velocidade das reações 
coeficiente de temperatura
• Velocidade  quando a T  10ºC.
2,3  R  T2  T1  log Q10
Ea 
10
Regulação da Atividade
 Sistema enzimático: produto da reação da 1ª
enzima  substrato da enzima subseqüente;
 Enzimas reguladoras  determina
velocidade da seqüência;
• Atividade catalítica  ou   sinais;
 Moléculas sinalizadoras
metabólitos ou cofatores.

a
pequenos
Enzimas Alostéricas
 Ligação não-covalente
modulador;
e
reversível

 Inibição por retroalimentação
• Enzima reguladora  inibida pelo P final da
via  reequilibra as necessidades celulares;
 Moduladores: inibidores ou estimuladores.
Enzimas Alostéricas
 Modulador = substrato  homotrópicas;
 Modulador  substrato  heterotrópicas;
 Sítio alostérico
modulador;

específico
 Curva
de
saturação
subunidades múltiplas.
para
sigmóide
o

Enzimas Alostéricas
  curvas de variação de atividade 
moduladores inibidores, ativadores ou os
dois tipos.
Modificação Covalente
 Ligação covalente de um grupo químico à
sua estrutura;
 Metabolismo alterado 
inativas e inibem vias ativas.
aciona
vias