Área: Biotecnologia
SEQUENCIAMENTO DO GENOMA DO COTTON ANTHOCYANOSIS VIRUS, CAUSADOR DO
VERMELHÃO DO ALGODOEIRO, UTILIZANDO DEEP-SEQUENCING DE PEQUENOS RNAS.
Roberto Andrade1, Tatiane da Franca Silva1, Marc Giban2, Maite Vaslin1
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Universidade Federal do Rio de Janeiro ([email protected]), Embrapa-Cirad
Pequenos RNAs ou siRNAs (RNAs de interferência) são pequenas moléculas de RNA originadas
quando plantas e animais são infectados por vírus. Após a entrada do vírus na célula, seu genoma é
liberado e reconhecido por proteínas celulares chamadas Dicer-like. Estas proteínas fragmentam o
genoma viral produzindo os siRNA, que apresentam sequências com aproximadamente 20-26
nucleotídeos (nts). As sequencias dos siRNA são complementares ao genoma viral e, utilizando esta
propriedade, sequenciamos todos os siRNA de plantas infectadas pelo agente causador da doença
Vermelhão do algodoeiro a fim de obtermos a sequência completa do genoma deste vírus. O
Vermelhão causa avermelhamento intenso das folhas e caules e seu agente causal é um vírus
pertencente à família Luteoviridae e ao gênero Polerovírus, descrito unicamente no Brasil por
Santos e colaboradores em 1961. Vírus pertencentes a este gênero apresentam genoma de RNA
fita simples polaridade positiva com seis ORFs, divididas por uma região intergênica. Em trabalhos
anteriores nosso grupo sequenciou a proteína do capsídeo viral (ORF3) e parte de sua replicase
(ORF2) e observou que havia uma grande homologia entre estas ORFs e as ORFs 2 e 3 do Cotton
Leafroll Dwarf Virus (CLRDV), vírus responsável pela Doença azul do algodoeiro, chegando a mais de
90% de identidade. A fim de se obter a sequência completa de seu genoma foi realizado o
sequenciamento de todos os siRNA presentes em amostras de plantas de algodão oriundas de
campo através de deep-sequencing pela plataforma Illumina realizado na Fasteris Co., Geneve,
Suiça. O banco gerado foi comparado com um genoma de referência através de um processo
chamado de mapeamento. O genoma de referência utilizado foi o do CLRDV. Para o mapeamento
do Vermelhão, desenvolvemos um software na linguagem de programação Java 7.0 chamado
SearchSmallRNA e conseguimos obter 87% do genoma viral. Nosso software também analisou a
quantidade de siRNA gerados durante o processo de infecção e constatou que haviam siRNAs
variando entre 18-26 nts, sendo os mais abundantes os de 22 nts seguidos pelos de 24
nucleotídeos. Para obter as porções genômicas não cobertas pelo mapeamento (gaps)
correspondente a 13% do genoma, desenhamos 10 conjuntos de iniciadores para a realização de
amplificações por transcrição reversa seguida de Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) e
posterior sequenciamento por Sanger. A ORF3 viral apresentou 606 nucleotídeos. Para validação
dos resultados de mapeamento, alinhamos a sequencia de nucleotídeos da ORF3 sequenciada por
Sanger com a sequência obtida no mapeamento e encontramos apenas nove nucleotídeos
divergentes. No alinhamento da sequencia proteica encontramos 100% de identidade entre as
ambas, evidenciado a eficiência do programa. O alinhamento da sequência nucleotídica da ORF3
com outros membros da família Luteoviridae confirmou a alta identidade desta com a ORF3 do
CLRDV, confirmando sua filogenia com o gênero Polerovirus. Esta é a primeira vez que este virus é
descrito a nível molecular e estes resultados corroboram a conservação da região 3 do genoma de
polerovírus que infectam algodão e são transmitidos pelo Aphis gosypii.
Brasilia, 3-6 Setembro 2013